李濤，韓雪梅，許效群，韓克光*

（1.山西農(nóng)業(yè)大學 動物醫(yī)學學院，山西 太谷030801；2.山西農(nóng)業(yè)大學 食品科學與工程學院，山西 太谷030801）

糖尿?。―iabetes mellitus，DM）是一種以高血糖為特征的代謝性疾病，長期存在的高血糖會導致各種組織受損，特別是造成眼、肝、腎、脾、心臟、血管、神經(jīng)的慢性損害以及功能障礙。據(jù)國際糖尿病聯(lián)合會（International Diabetes Federation，IDF）公布：2015 年用于糖尿病醫(yī)療保健的支出高達6 730 億美元；同年全球4.15 億糖尿病成年患者及3.18 億存在患糖尿病風險的人群中，中國占三分之一［1］。在我國糖尿病的發(fā)病率以每年100 萬的速度增加［2］。目前主要通過藥物控制血糖水平來減少高血糖對各組織器官的損傷，然而這些藥物可引起不同程度的不良反應［2，3］。近年來，天然黃酮類化合物作為安全、有效的降糖降脂物質引起國內(nèi)外學者的高度關注，但不同來源的天然黃酮其構成與功效不同。本課題組前期研究結果表明，盛花期的苦蕎葉黃酮化合物含量高達10.25%，遠高于苦蕎籽粒及其它植物資源。提取的苦蕎葉黃酮（Fagopyrum tataricumleaf flavone，F(xiàn)LF）可促進糖尿病模型小鼠胰島β 細胞的修復，具有顯著的降糖效果［4］，本研究將探討FLF 在降糖過程中對糖尿病小鼠臟器病損的保護修復作用及機制，為苦蕎葉黃酮及天然降糖物質的開發(fā)利用提供實驗參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

FLF 由山西農(nóng)業(yè)大學食品學院苦蕎深加工研究課題組提供，由超聲波萃取、大孔吸附樹脂純化而得，純度為90%。鏈脲佐菌素為Sigma 產(chǎn)品，鹽酸二甲雙胍（Metformin Hydrochloride，Met）購自北京索萊寶，其余試劑均為國產(chǎn)分析純。檢測超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-PX）、丙二醛（MDA）、胰島素（INS）的試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。

1.2 儀器與設備

高速電動勻漿器（天津恒奧），D-3752 高速冷凍離心機（美國Sigma），723 可見分光光度計（上海菁華）；DNM-9606 酶標分析儀（北京普朗）；RM2015 切片機（德國Leica）；多功能真彩色細胞圖像分析管理系統(tǒng)（美國Media Cybernetics）。

1.3 糖尿病小鼠模型的建立、分組、處理及樣品采集

清潔級ICR 雄性小鼠［（體質量20±2）g］購自山西醫(yī)科大學動物實驗中心［SCXK（晉）2015-0001］，通過高脂高糖飼料和腹腔注射鏈脲佐霉素（Streptozocin，STZ）建立糖尿病小鼠模型［4］，將建模成功的小鼠隨機分為模型對照組（Model）、鹽酸二甲雙胍（Metformin hydrochloride）治療組（Met150 mg·kg-1bw）和3 個FLF 干預組，每組10只，另取10 只健康小鼠作為正常對照組（Nomal）。FLF 的高、中、低3 個劑量組分別為FLF-H（200 m·kg-1bw）、FLF-M（150 mg·kg-1bw）和FLF-L（100 mg·kg-1bw）。所有小鼠均飼喂標準飼料，每日灌胃相應的受試物，N 組和M 組灌胃等體積生理鹽水，期間測定小鼠體重，持續(xù)4 周后，脫頸處死小鼠，摘取肝臟和腎臟，稱重后，部分組織用于制備石蠟切片，剩余部分制成10%組織勻漿液，離心取上清液，-20℃保存。

1.4 切片制作及染色

肝和腎的組織切塊經(jīng)10%甲醛溶液固定后制備組織石蠟切片，切片厚度為4 μm，附于經(jīng)多聚賴氨酸附膜的載玻片上，經(jīng)二甲苯脫蠟處理和乙醇梯度脫水后，蘇木素伊紅染色，依次再經(jīng)95%、100%乙醇、二甲苯∶石碳酸（3∶1）、二甲苯處理后，中性樹脂封固，顯微鏡下觀察。

1.5 臟器指數(shù)和抗氧化能力檢測

各臟器指數(shù)為臟器濕重與體質量之比。嚴格按照試劑盒說明書測定小鼠肝臟、腎臟組織中的SOD、GSH-PX、MDA 含量。

1.6 統(tǒng)計分析

采用GraphPad Prism 5 軟件分析數(shù)據(jù)，所用數(shù)據(jù)以（平均數(shù)±標準誤）表示，組間采用t 檢驗進行分析。

表1 各組小鼠體重變化情況Table 1 Changes of mice body weight（g）in different groups during 4-week treatment 單位：g

2 結果與分析

2.1 FLF 對DM 小鼠體重的影響

由表1 可見，糖尿病模型小鼠和正常小鼠的體重在灌胃受試物之前無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）；實驗期間，N 組小鼠體重逐漸增加，M 組體重則不斷下降，第5 天時，M 組體重便顯著低于N 組（P＜0.05）。Met 組與FLF 高劑量組在給藥第5 天，體重顯著高于M 組（P＜0.05），中、低劑量組則分別在給藥第9 天和第13 天顯著高于M 組（P＜0.05）。給藥第9 天直至實驗結束，Met 和FLF 高劑量組的小鼠體重均極顯著高于M 組（P＜0.01），以上結果說明FLF 可很好地改善糖尿病小鼠的體重下降情況，且呈一定的劑量效應。

2.2 FLF 對DM 小鼠肝腎臟器指數(shù)的影響

由圖1 可見，M 組小鼠的肝臟、腎臟指數(shù)顯著高于N 組（P＜0.001），肉眼觀察明顯腫大。給藥4周后，F(xiàn)LF 各組及Met 組的肝臟、腎臟指數(shù)均極顯著低于M 組（P＜0.01 或P＜0.001），說明FLF 可明顯抑制糖尿病小鼠的肝臟和腎臟腫大。由圖1還可知，在本試驗劑量范圍內(nèi)，F(xiàn)LF 劑量越大，抑制肝腎腫大的效果越好。

2.3 FLF 對DM 小鼠肝臟和腎臟T-SOD、GSHPX 水平的影響

超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-PX）活性反應機體的抗氧化水平，對機體的氧化與抗氧化平衡起著至關重要的作用。由圖2 可見，與N 組相比，M 組小鼠肝、腎組織中的T-SOD 和GSH-PX 含量極顯著下降（P＜0.001），說明DM 發(fā)生過程中小鼠肝臟和腎臟的抗氧化能力受損，器官處于氧化脅迫之下。給藥4 周后，與M 組相比，F(xiàn)LF 各劑量組及Met 組小鼠肝腎組織中的T-SOD 和GSH-PX 含量均顯著提高（P＜0.05，P＜0.01 或P＜0.001），且呈劑量效應，F(xiàn)LF高劑量組的改善效果甚至優(yōu)于藥物組，在數(shù)值上已經(jīng)接近正常組水平。

圖1 苦蕎葉黃酮對糖尿病小鼠肝臟指數(shù)（左）和腎臟指數(shù)（右）的影響Fig.1 Effects of flavonoids extracted from F.tataricum leaves on the liver（left）and the kidney（right）index of diabetes mellitus mice

圖2 苦蕎葉黃酮對糖尿病小鼠肝臟和腎臟組織T-SOD、GSH-PX 含量的影響Fig.2 Effect of flavonoids from F.tataricum leaves on liver and kidney T-SOD，GSH-PX levels of diabetes mice

2.4 FLF 對DM 小鼠肝臟腎臟MDA 水平的影響

丙二醛（MDA）是最常見的脂質過氧化產(chǎn)物，其含量反映機體的脂質過氧化程度和受自由基攻擊的嚴重程度，從而間接反應組織的受損程度。由圖3 可見，M 組小鼠肝腎組織中的MDA 含量極顯著高于N 組（P＜0.001）。給藥4 周后，除FLFL 組肝臟的MDA 含量外，其余處理組的MDA 含量均顯著低于M 組（P＜0.05，P＜0.01 或P＜0.001），并且MDA 的含量隨著FLF 劑量的增大而減小，且FLF-H 組與Met 組差異不顯著（P＞0.05）。

圖3 苦蕎葉黃酮對糖尿病小鼠肝臟和腎臟MDA 含量影響Fig.3 Effect of flavonoids from F.Tataricum leaves on MDA levels in liver and kidney of diabetes mice

2.5 苦蕎葉黃酮對糖尿病小鼠肝臟組織形態(tài)的影響

對各組小鼠肝臟組織進行HE 染色，觀察病理變化，N 組小鼠肝小葉結構規(guī)整，肝細胞呈多邊形，分布整齊，大小均一，肝細胞索以中央靜脈為中心向四周放射排列（圖4）。M 組小鼠的肝組織結構紊亂，肝細胞腫脹，肝索結構不清晰，胞質內(nèi)出現(xiàn)大小不等不被染色的異常顆粒（圖4B 處），肝竇不清晰、有出血（圖4A 處）現(xiàn)象，肝臟組織嚴重受損。Met 組及FLF 高劑量組小鼠的肝組織結構明顯改善，肝索結構較為清晰（圖4E 處），肝細胞排列較為整齊，胞內(nèi)異常顆粒減少，細胞炎癥、壞死、出血現(xiàn)象顯著改善。

圖4 各組小鼠經(jīng)HE 染色的肝臟組織切片圖（400×）Fig.4 HE stained liver sections of mice from different groups（400×）

2.6 苦蕎葉黃酮對Ⅱ-型糖尿病小鼠腎臟組織形態(tài)的影響

N 組小鼠腎組織結構規(guī)則，細胞排列整齊，腎小管上皮細胞未見異常，無炎性細胞浸潤；M 組小鼠的腎小管結構紊亂，腎小管上皮細胞出現(xiàn)顆粒變性（圖5B 處）、空泡變性（圖5D 處），體積腫大，有少量的腎小管上皮細胞核固縮，壞死，腎間質中可見多量淋巴細胞浸潤（圖4C 處），結締組織增生，腎組織纖維化。與M 組相比，Met 組及FLF 各劑量組小鼠腎組織結構明顯改善，腎小管上皮細胞可見輕微的顆粒變形、腫大，未見明顯壞死、炎性細胞浸潤、出血。

圖5 各組小鼠經(jīng)HE 染色的腎臟組織切片圖Fig.5 HE stained kidney sections of mice from different groups

3 討論

來自蕎麥不同部位的黃酮提取物均具有降糖降脂效果［5～12］。氧化應激在糖尿病發(fā)生過程中具有重要作用，研究者證實了銀杏葉［13］、沙棘果［14］、杭白菊［15］、紫蘇［16］、桑葉［17］等其它植物來源黃酮提取物對DM 模型小鼠或大鼠抗氧化功能的改善作用。劉小娜等研究者指出蕎麥黃酮在降糖過程中對糖尿病動物模型的腎臟保護作用與其具有降糖、降脂、降 低 非 酶 糖 基 化 及 氧 化 應 激 水 平 相 關［18～20］。FLF 已經(jīng)被證實對DM 小鼠具有降糖降脂作用［4］，本研究證實了其對DM 小鼠肝臟和腎臟病理損傷的修復效果，并揭示了其增強肝、腎組織抗氧化能力的機制。

本研究結果表明，DM 小鼠肝腎組織中的TSOD、GSH-PX 含量顯著下降，MDA 含量顯著升高，意味著這些器官的抗氧化能力顯著下降，自由基的產(chǎn)生與清除失衡，自由基不斷累積使這些臟器遭受高水平的氧化應激［21，22］，引起組織受損和過度的細胞凋亡，因而病理切片可觀察到肝和腎發(fā)生了明顯的水腫、炎癥、出血、壞死等病變，所以腎病是糖尿病最常見的并發(fā)癥之一，糖尿病腎病嚴重可導致腎功能衰竭。而肝臟是糖類、蛋白質和脂肪代謝的重要場所，又是機體很重要的內(nèi)分泌器官之一［23］，肝組織的上述病變導致代謝受阻，進一步加劇了糖尿病小鼠的糖、脂代謝紊亂。大量研究表明，糖尿病患者幾乎都存在著自由基代謝紊亂的現(xiàn)象［24］，機體內(nèi)自由基水平直接影響糖尿病患者病情的發(fā)展［23，25］，因此糖尿病必須得及早進行控制。本試驗結果表明，F(xiàn)LF 可顯著提高糖尿病小鼠肝、腎、脾中T-SOD、GSH-PX 含量，顯著降低MDA 含量，說明FLF 能有效地清除糖尿病小鼠體內(nèi)的自由基，減少自由基造成的細胞損傷，使糖尿病小鼠的肝臟和腎臟指數(shù)顯著下降，病理切片可觀察到FLF 對受損肝腎組織明顯的修復效果。

4 結論

糖尿病可引起小鼠的肝臟和腎臟病變，F(xiàn)LF 在降糖、降脂過程中，通過增加肝腎組織的抗氧化活性，減少氧化應激損傷，消除炎癥和組織壞死來修復DM 小鼠受損肝臟和腎臟的組織結構，恢復其生理功能，且具有量效關系。