方碧煙 ，甘均龍，史軍杰 ，彭麗華，陳煒璇，成金樂*

（1. 廣州中醫(yī)藥大學(xué) 中藥資源科學(xué)與工程研究中心，廣東 廣州 510006；2. 國家中醫(yī)藥管理局中藥破壁飲片技術(shù)與應(yīng)用重點(diǎn)研究室，中山市中智藥業(yè)集團(tuán)有限公司，廣東 中山 528437；3. 嶺南中藥資源教育部重點(diǎn)實驗室（廣州中醫(yī)藥大學(xué)），廣東 廣州 510006； 4. 國家中成藥工程技術(shù)研究中心南藥研發(fā)實驗室，廣東 廣州 510006）

紅景天為景天科植物大花紅景天Rhodiola crenulata (Hook. f. et Thoms.) H. Ohba 的干燥根和根莖，可益氣活血、通脈平喘，主治氣虛血瘀、胸痹心痛、中風(fēng)偏癱、倦怠氣喘等癥[1]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，紅景天及其有效成分紅景天苷具有抗疲勞、抗抑郁、增強(qiáng)免疫力、清除活性氧自由基、抗腫瘤、護(hù)肝等作用，對神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)等系統(tǒng)疾病具有一定治療作用[2]。紅景天破壁飲片是將其傳統(tǒng)飲片，經(jīng)現(xiàn)代超微粉碎技術(shù)加工至D90 小于45 μm（300 目以上）的破細(xì)胞壁粉體，經(jīng)不添加成型劑專利技術(shù)制成的30 ～ 100目干燥顆粒狀飲片[3-4]。由于經(jīng)破細(xì)胞壁工藝處理，破壁飲片已失去傳統(tǒng)飲片的外觀性狀和顯微鑒別特征，需引入可反映中藥整體成分信息的HPLC 指紋圖譜技術(shù)作為其質(zhì)量評價的指標(biāo)之一[5-7]。

本研究通過建立紅景天傳統(tǒng)飲片、破壁粉體及破壁飲片的HPLC 指紋圖譜，對三者間的化學(xué)成分相關(guān)性進(jìn)行分析，以評價紅景天破壁飲片制備工藝過程中的成分傳遞信息以及批間成分一致性情況；進(jìn)一步通過化學(xué)識別模式快速區(qū)分物質(zhì)基礎(chǔ)差異大的不同產(chǎn)地紅景天樣品[8-9]，為紅景天破壁飲片的原料、中間體及成品質(zhì)量控制提供參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Waters 2695/2988 型高效液相色譜儀（美國沃特世公司）；明澈TM-D24UV 型純水系統(tǒng)（美國Milipore 公司）；KQ-700DE 型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 材料

紅景天苷（批號：110818-201507，99.4%）、酪醇（批號：111676-200602，100%）、沒食子酸（批號：110831-201605，90.8%）均購于中國食品藥品檢定研究院；水為自制超純水；乙腈、甲醇均為色譜純，購于安徽時聯(lián)特種溶劑股份有限公司；其余試劑為分析純，購于廣州化學(xué)試劑廠。

10 批紅景天藥材均從西藏和四川的不同區(qū)域采集，經(jīng)中山市中智藥業(yè)集團(tuán)有限公司賈世清中藥師鑒定為景天科植物大花紅景天Rhodiola crenulata（Hook. f. et Thoms.）H.Ohba 的干燥根和根莖。紅景天藥材按傳統(tǒng)方法制成紅景天傳統(tǒng)飲片，并以此為原料，按破壁飲片制備工藝規(guī)程分別制備成對應(yīng)批次的紅景天破壁粉體及破壁飲片（均由中山市中智中藥飲片有限公司制備），樣品信息見表1。

表1 紅景天樣品信息Tab. 1 Sample information of Rhodiolae Crenulatae Radix et Rhizoma

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

Shiseido CAP Cell C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；以乙腈（A）-0.1%甲酸水溶液（B）的流動相進(jìn)行梯度洗脫（0 ～ 25 min，5% ～ 15%A；25 ～ 45 min，15% ～ 23%A；45 ～ 70 min，23% ～ 28%A）；流速：0.6 mL/min；檢測波長：275 nm；柱溫：30 ℃；供試品溶液進(jìn)樣量：20 μL。

2.2 供試品溶液的制備

取紅景天樣品0.25 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加入25 mL 70%甲醇，稱重，浸潤30 min，超聲提取45 min，取出，冷卻至室溫，補(bǔ)重，搖勻，濾過，即得。

2.3 對照品溶液的制備

取沒食子酸、紅景天苷及酪醇3 種對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL 含沒食子酸1.0 mg、紅景天苷0.5 mg、酪醇0.2 mg 的混合對照品溶液，即得。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 專屬性試驗 取紅景天破壁飲片，供試品溶液及空白供試品溶液按“2.2”項下的方法制備，按“2.1”項下的色譜條件進(jìn)行測定。結(jié)果顯示溶劑對樣品的HPLC 分析無影響，表明該方法專屬性良好。

2.4.2 精密度試驗 取1 份紅景天破壁飲片，供試品溶液按“2.2”項下的方法制備，連續(xù)進(jìn)樣6 次，記錄色譜圖。各譜圖相似度大于0.99；計算其它各共有峰的相對保留時間及相對峰面積的RSD 值（以1 號沒食子酸峰為參照峰），結(jié)果均小于3%，表明儀器精密度良好。

2.4.3 重復(fù)性試驗 取同一批紅景天破壁飲片6份，供試品溶液按“2.2”項下方法制備，進(jìn)樣分析。各譜圖相似度大于0.99；計算其它各共有峰的相對保留時間及相對峰面積的RSD 值，結(jié)果均小于3%，表明方法的重復(fù)性良好。

2.4.4 穩(wěn)定性試驗 取1 份紅景天破壁飲片，供試品溶液按“2.2”項下的方法制備，并于制備后0、2、4、8、12、24 h 時進(jìn)樣分析。各譜圖相似度大于0.99；計算其它各共有峰的相對保留時間及相對峰面積的RSD 值，結(jié)果均小于5%，表明供試品溶液在24 h 內(nèi)較穩(wěn)定。

2.5 指紋圖譜的建立及相似度評價

取10 批次不同產(chǎn)地的紅景天傳統(tǒng)飲片及其對應(yīng)批次的破壁粉體和破壁飲片，按“2.2”項下的供試品制備方法制備相應(yīng)的供試品溶液，進(jìn)樣測定，記錄指紋圖譜。通過“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2012 A 版）”軟件分別建立紅景天傳統(tǒng)飲片、破壁粉體、破壁飲片的指紋圖譜共有模式，計算10 批傳統(tǒng)飲片、10 批破壁粉體、10 批破壁飲片各自的相似度。結(jié)果顯示紅景天傳統(tǒng)飲片、破壁粉體及破壁飲片指紋圖譜均標(biāo)定了18 個共有峰，經(jīng)對照品指認(rèn)，1號峰為沒食子酸，2 號峰為紅景天苷，4 號峰為酪醇（見圖1）；10 批傳統(tǒng)飲片中編號1、2、3 間的相似度達(dá)0.96 以上，而與其它批次傳統(tǒng)飲片的相似度低于0.85；編號4、5、6、8、9 間的相似度達(dá)0.95 以上，而與其它批次傳統(tǒng)飲片的相似度低于0.90；編號4、7、10 間的相似度較高，而與其它批次傳統(tǒng)飲片的相似度低于0.85。10 批破壁粉體及10 批破壁飲片也隨著傳統(tǒng)飲片表現(xiàn)出相同規(guī)律。

圖1 混合對照品峰的指認(rèn)Fig. 1 Peak identification of hybrid reference substance

2.6 紅景天傳統(tǒng)飲片、破壁粉體、破壁飲片相關(guān)性分析

將10 批紅景天傳統(tǒng)飲片、破壁粉體及破壁飲片的指紋圖譜共有模式進(jìn)行相似度分析（見圖2 和表2），且分別將同批次的紅景天三態(tài)（傳統(tǒng)飲片、破壁粉體及破壁飲片）指紋圖譜進(jìn)行比較（見圖3）。結(jié)果均顯示紅景天傳統(tǒng)飲片、破壁粉體、破壁飲片之間的相似度極高（均大于0.99），說明紅景天傳統(tǒng)飲片經(jīng)破壁粉碎技術(shù)及無添加成型技術(shù)制成破壁飲片成品的整個工藝流程中，成分傳遞好，有效成分整體概貌基本沒有發(fā)生改變。

圖2 紅景天傳統(tǒng)飲片、破壁粉體、破壁飲片指紋圖譜共有模式比較Fig. 2 Comparison of the mutual mode of HPLC fingerprint of decoction pieces, ultrafine powder and ultrafine granular powder of Rhodiolae Crenulatae Radix et Rhizoma

表2 紅景天傳統(tǒng)飲片、破壁粉體、破壁飲片的相似度Tab. 2 Similarity of decoction pieces, ultrafine powder and ultrafine granular powder of Rhodiolae Crenulatae Radix et Rhizoma

2.7 主成分分析（PCA）和聚類分析（HCA）

以18 個共有峰的峰面積為變量，分別采用SIMCA 14.1 軟件、SPSS 26.0 軟件對上述各10 批紅景天傳統(tǒng)飲片、破壁粉體及破壁飲片樣品進(jìn)行PCA、HCA 分析。結(jié)果顯示：三個主成分的累計貢獻(xiàn)率為84.16%，從PCA 得分圖可知（見圖4），30 個紅景天樣品明顯分為3 類，其中樣品編號為1、2、3 的傳統(tǒng)飲片及其制備的破壁粉體、破壁飲片為一類；編號為4、7、10 的傳統(tǒng)飲片及其制備的破壁粉體、破壁飲片為一類；編號為5、6、8、9 的傳統(tǒng)飲片及其制備的破壁粉體、破壁飲片為一類；從HCA 樹狀圖可知（見圖5），當(dāng)平方歐式距離為5 時，不同產(chǎn)地紅景天樣品的分類結(jié)果與PCA 結(jié)果一致。

3 討論

本研究分析了不同產(chǎn)地的10 批紅景天傳統(tǒng)飲片及以其為原料所制備的破壁粉體、破壁飲片的HPLC指紋圖譜。以HPLC 指紋圖譜的相似度對紅景天破壁飲片、破壁粉體及傳統(tǒng)飲片進(jìn)行成分相關(guān)性分析時，表現(xiàn)出極高的相似度，表明紅景天破壁飲片的整個制備過程中，未出現(xiàn)成分種類的新增或消失，整體概貌未變化，具有同質(zhì)性。且所采集的不同產(chǎn)地紅景天藥材，其傳統(tǒng)飲片圖譜相似度差異較大，并將成分差異進(jìn)一步延續(xù)至破壁飲片中間體和成品。其PCA、HCA 分析也非常清晰地將HPLC 指紋圖譜相似度高的樣品歸為一類，而差異大的歸為其它兩類，進(jìn)一步佐證了指紋圖譜相似度評價結(jié)果。結(jié)果提示，產(chǎn)地的生態(tài)環(huán)境對紅景天藥材生長過程中的成分富集影響較大，為保證以其為原料的中藥成品質(zhì)量穩(wěn)定、一致，應(yīng)對紅景天藥材的產(chǎn)地及加工方法進(jìn)行控制和要求。HPLC 指紋圖譜技術(shù)雖然克服了單一成分信息量不全的缺點(diǎn)，能較全面、整體反映成分概貌，但具有一定的模糊性，不能清晰反映成分的含量變化情況。為反映破壁飲片與其傳統(tǒng)飲片的“同量性”，后續(xù)還將進(jìn)一步通過化學(xué)計量學(xué)技術(shù)篩選飲片中的質(zhì)量標(biāo)志性成分，并對其進(jìn)行含量測定，分析破壁飲片與其傳統(tǒng)飲片的含量相關(guān)性情況，更全面地表征由傳統(tǒng)飲片加工成破壁飲片的成分傳遞信息。

圖4 PCA 得分圖Fig. 4 Score plot of PCA

圖5 HCA 圖Fig. 5 HCA dendrogram

4 結(jié)論

本研究所建立的HPLC 指紋圖譜分析方法穩(wěn)定、可靠，結(jié)合化學(xué)模式識別技術(shù)，可用于評價紅景天傳統(tǒng)飲片、破壁粉體及破壁飲片的批次間成分一致性、穩(wěn)定性，進(jìn)而延伸應(yīng)用至原料的質(zhì)量控制、破壁飲片加工過程的工藝穩(wěn)定性評價，為破壁飲片產(chǎn)品的質(zhì)量控制和質(zhì)量追溯提供參考。