袁偉康，戚南山，廖申權(quán)，Mudassar Mohiuddin，李躍龍，呂敏娜，吳彩艷，李 娟，林栩慧，蔡海明，胡俊菁，于林增，肖文婉，張健騑，曹 正1,，孫蕓蕓1,，孫銘飛*，顧有方

(1.安徽科技學院 動物科技學院，安徽 鳳陽 233100；2.廣東省農(nóng)業(yè)科學院 動物衛(wèi)生研究所 農(nóng)業(yè)部獸用藥物與診斷技術(shù)廣東科學觀測實驗站 廣東省畜禽疫病防治研究重點實驗室，廣東 廣州 510640；3.廣東省農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全中心，廣東 廣州 510640)

雞壞死性腸炎又稱雞腸毒血癥，于1961年首次報道于英國，嚴重危害養(yǎng)雞業(yè)的發(fā)展。隨著集約化養(yǎng)雞業(yè)的發(fā)展，目前該病已成為家禽養(yǎng)殖中最重要的腸道疫病之一。該病是一種由革蘭陽性、厭氧、有芽孢的產(chǎn)氣莢膜梭菌(Clostridiumperfringens)引起的疫病[1-2]，該菌株產(chǎn)生的毒素多達17種，但單一的菌株只能產(chǎn)生某些特定毒素。目前根據(jù)分泌毒素種類和致病性的不同，將產(chǎn)氣莢膜梭菌分為A～G共7個型：其中A型產(chǎn)氣莢膜梭菌產(chǎn)生alpha (α，CPA)毒素，B型產(chǎn)氣莢膜梭菌產(chǎn)生α、beta (β，CPB)和epsilon (ε，ETX)3種毒素，C 型產(chǎn)氣莢膜梭菌產(chǎn)生α和β毒素，D型產(chǎn)氣莢膜梭菌產(chǎn)生α和ε毒素，E型產(chǎn)氣莢膜梭菌產(chǎn)生α和iota (ι，ITX)毒素[3]，F(xiàn)型產(chǎn)氣莢膜梭菌產(chǎn)生α和enterotoxin (CPE) 毒素，G型產(chǎn)氣莢膜梭菌產(chǎn)生α和necrotic B-like (NetB)毒素[4]。以往的研究發(fā)現(xiàn)A型產(chǎn)氣莢膜梭菌是雞壞死性腸炎的主要致病菌，少數(shù)為C型，但最近有學者表示真正可能致病的產(chǎn)氣莢膜梭菌類型是G型[5-6]。

在過去40多年，使用抗生素類藥物防治雞壞死性腸炎取得了一定效果，但隨之帶來許多潛在危害，如細菌的耐藥性逐漸增強，肉食品藥物殘留的超標等，成為嚴重威脅公眾健康的公共衛(wèi)生問題。為此，近年來西方一些發(fā)達國家已經(jīng)明令禁止某些抗生素和動物促生長劑在畜禽養(yǎng)殖生產(chǎn)中的使用，而我國也明文規(guī)定截至2020年7月1日禁止飼料生產(chǎn)企業(yè)生產(chǎn)含有促生長類藥物飼料添加劑(中藥類除外)的商品飼料。這一系列減抗替抗政策的出臺短期內(nèi)將影響畜禽養(yǎng)殖業(yè)生產(chǎn)，一旦不提高養(yǎng)殖管理水平，一些腸道疫病，特別是由機會性致病原產(chǎn)氣莢膜梭菌等引起的壞死性腸炎等疫病將難以控制，給家禽養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大經(jīng)濟損失[7]。如何尋找一種新的替代抗生素類的生物制劑來預(yù)防控制雞壞死性腸炎疫病是一個迫在眉睫的任務(wù)，建立有效的發(fā)病模型來評價新型減抗替抗方案的防控效果即成為當前亟待解決的問題。然而由于目前對雞壞死性腸炎的發(fā)病機制尚未完全清楚，且該病的發(fā)生又是一個多因素控制調(diào)節(jié)的疫病[8]，如何去復(fù)制一個有效的疫病發(fā)病模型是一個關(guān)鍵的難點，因此現(xiàn)對成功復(fù)制雞壞死性腸炎病例的關(guān)鍵因素進行了詳細的綜述，以期為雞壞死性腸炎病的實驗室研究及綜合防控提供理論基礎(chǔ)。

1 雞壞死性腸炎病例復(fù)制的關(guān)鍵因素

1.1 飼料因素以小麥、大麥或黑麥作為原材料的飼料中含有大量的水溶性難消化的非淀粉多糖(non-starch polysaccharides,NSP)，這類物質(zhì)能引起腸道消化液黏度和腸黏液的增加，消化液黏度的增加會延長腸道內(nèi)容物的停滯時間，增加腸道內(nèi)容物黏性以及產(chǎn)氣莢膜梭菌的數(shù)量，可增加壞死性腸炎的發(fā)病率[9]。非烘烤大豆類的飼料能抑制胰蛋白酶活性進而增加壞死性腸炎對腸道的損傷[10]。

RODGERS等[11]研究表明，在動物飼料中添加魚粉并不會增加艾美耳球蟲與產(chǎn)氣莢膜梭菌聯(lián)合感染所引起雞壞死性腸炎的嚴重性，但單獨使用艾美耳球蟲誘導(dǎo)或飼料添加魚粉都會導(dǎo)致雞群腸道菌群發(fā)生紊亂[12-13]，引起雞壞死性腸炎的發(fā)生，因此無需同時使用球蟲誘導(dǎo)和飼料添加魚粉的方法進行雞壞死性腸炎病例的復(fù)制。此外，限制雞群的飼料攝入量會顯著降低壞死性腸炎疫病引起的腸道癥狀的損傷評分[14]，因此在雞壞死性腸炎病例復(fù)制模型的建立過程中，試驗雞群在飼養(yǎng)過程中需獲得充足的飼料，避免限料。

1.2 菌株因素

1.2.1菌株毒素的類型 目前，基于試驗研究，人們普遍認為只有具有netB基因陽性的G型產(chǎn)氣莢膜梭菌菌株能引起雞壞死性腸炎[15]。netB基因與一個位于質(zhì)粒上的致病性位點(NELoc-1)相關(guān)[16]，研究人員發(fā)現(xiàn)在復(fù)制病例的過程中，netB基因會出現(xiàn)丟失，從而導(dǎo)致病例復(fù)制失敗。造成netB基因丟失的原因主要有兩個方面，一是其他基因在NELoc-1位點中發(fā)生突變，使調(diào)控基因發(fā)生變異，導(dǎo)致原始菌株中含有netB致病性位點的整個毒力質(zhì)粒丟失；二是細菌在繼代培養(yǎng)過程中，具有netB基因的質(zhì)粒自行從宿主菌株中失去?？赡艿脑蚴莕etB具有獨特的染色體基因[17]，當netB毒力質(zhì)粒在宿主菌中表達時會對菌株產(chǎn)生消極的影響，宿主菌株因為自我保守機制對質(zhì)粒進行了修改，從而導(dǎo)致netB毒素基因的自行丟失。因此，保證病例復(fù)制所使用的產(chǎn)氣莢膜梭菌是含有netB毒素的G型菌對于試驗的成功至關(guān)重要。

此外有研究報道，具有tpeL基因陽性的G型產(chǎn)氣莢膜梭菌菌株中netB毒素基因的拷貝數(shù)遠遠大于tpeL基因陰性的G型產(chǎn)氣莢膜梭菌[17]，即具有tpeL基因的G型產(chǎn)氣莢膜梭菌比沒有tpeL基因的菌株能引起更嚴重的雞壞死性腸炎[18]，說明tpeL毒素是另一個引起雞壞死性腸炎發(fā)病的重要毒素。

1.2.2菌株毒素制備方法 對于雞壞死性腸炎病例的復(fù)制，G型產(chǎn)氣莢膜梭菌菌株的制備非常重要。熟肉培養(yǎng)基與液體硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基(fluid thioglycollate medium，F(xiàn)TG)一樣，在有氧培養(yǎng)條件下都可以支持產(chǎn)氣莢膜梭菌的生長。研究發(fā)現(xiàn)菌株在FTG培養(yǎng)基中培養(yǎng)15 h后的致病力比培養(yǎng)24 h更強[19]，因此建議菌株在培養(yǎng)基中培養(yǎng)15 h后即可使用。菌株在有氧環(huán)境下培養(yǎng)15 h后，可以得到(2～5)×108個群落形成單位(CFU/mL)，健康雞群中小腸每克腸道內(nèi)容物中含產(chǎn)氣莢膜梭菌的數(shù)量是102～104CFU/mL，而發(fā)生壞死性腸炎的雞腸道中產(chǎn)氣莢膜梭菌為 107～109CFU/mL；因此，菌株經(jīng)FTG培養(yǎng)基培養(yǎng)15 h后得到的群落形成單位已經(jīng)足以導(dǎo)致動物產(chǎn)生疫病[20]。

1.2.3菌株接種方法 使用已經(jīng)制備好的G型產(chǎn)氣莢膜梭菌接種動物時，普遍采用的接種方式有兩種：一是通過拌料的方式對雞群進行接種，即使用產(chǎn)氣莢膜梭菌與培養(yǎng)基的混合物液體FTG和飼料以1.25～1.50∶1.00的比例(V∶W)均勻混合，雞群在試驗開始之前需要禁食一整夜，試驗開始后，每天喂2次預(yù)先處理好的飼料，飼養(yǎng)周期一般為5 d，在接種飼料的最后一天或第2天對雞只處理并進行病變評分的統(tǒng)計。通過飼料的方式對雞群進行菌株接種雖然免去了每天對每只雞進行單獨接種菌株的麻煩，但需要大量的肉湯培養(yǎng)基，這可能會增加費用；二是通過口服或灌胃的方式接種經(jīng)肉湯培養(yǎng)的菌株。具體方法是連續(xù)3 d，每天2次接種3 mL 105～107CFU/mL的菌液，或連續(xù)7 d每天接種1 mL(1～4)×108CFU/mL的菌液。該方法常與感染球蟲、IBDV疫苗接種等有關(guān)雞壞死性腸炎的危險因素相結(jié)合[21]。除了通過飼料或致病菌株直接灌胃感染以外，目前有研究人員選擇將雞群暴露在被產(chǎn)氣莢膜梭菌污染的環(huán)境中進行自然感染[22]，雖然他們也取得不錯的結(jié)果，但此種方法在不同群體間很難標準化，且重復(fù)性差，因此并不值得推廣。

1.3 球蟲感染因素球蟲引起的腸道上皮損傷是雞壞死性腸炎的主要誘發(fā)因素之一，產(chǎn)氣莢膜梭菌之所以能夠快速復(fù)制并分泌大量外毒素，可能是因為球蟲感染造成雞腸道黏膜損傷為產(chǎn)氣莢膜梭菌提供了有利于菌株生長的大量氨基酸和富含蛋白質(zhì)的營養(yǎng)，也可能是因為球蟲病引起的腸黏液分泌異常有利于菌株的生長繁殖[21]。也有研究表明，由艾美耳屬球蟲感染(Eimeriaacervulina、E.brunetti、E.maxima的混合體)引起的腸道微生物菌群的顯著變化是產(chǎn)氣莢膜梭菌快速復(fù)制并產(chǎn)生毒素的促成因素[23]。由于以上這些原因，在試驗誘導(dǎo)壞死性腸炎時艾美耳屬球蟲經(jīng)常與產(chǎn)氣莢膜梭菌聯(lián)合使用。然而，球蟲本身會對雞群腸道產(chǎn)生嚴重的損害甚至導(dǎo)致其死亡，因此必須謹慎選擇球蟲種類和接種劑量。一般使用感染十二指腸的堆型艾美耳球蟲(E.acervulina)或感染小腸的巨型艾美耳球蟲(E.maxima)進行球蟲誘導(dǎo)試驗。同時球蟲的劑量也很重要，一般使用(2～5)×104E.acervulina或(2～5)×104E.maxima與產(chǎn)氣莢膜梭菌聯(lián)合誘發(fā)疫病。此外，球蟲的感染時間對于成功誘導(dǎo)雞群產(chǎn)生壞死性腸炎至關(guān)關(guān)鍵，一般不超過產(chǎn)氣莢膜梭菌接種前4 d對雞群接種球蟲，以便球蟲引起的腸道損傷與梭菌引起的癥狀同時發(fā)生。

1.4 實驗動物因素

1.4.1實驗動物免疫抑制 研究表明發(fā)生免疫抑制的雞更容易發(fā)生壞死性腸炎，雞群感染如傳染性法氏囊病病毒、馬立克病病毒、雞白血病病毒等能引起機體的免疫抑制，從而造成雞群壞死性腸炎發(fā)病率增高。因此有研究人員通過使用傳染性法氏囊炎(infectious bursal disease,IBD)疫苗來提高壞死性腸炎病變的嚴重程度[24]，此方法通過對雞只注射IBDV疫苗來完成。雞只在注射IBDV疫苗后，由于免疫抑制的結(jié)果，發(fā)生壞死性腸炎時的癥狀會明顯加重[25]。

1.4.2實驗動物的品種、性別和日齡 不同種類的雞對于雞壞死性腸炎的發(fā)病率是不同的，Cobb雞壞死性腸炎發(fā)病率明顯高于Ross雞或Hubbard雞；不同性別、不同日齡的雞對于壞死性腸炎的發(fā)病率也存在較大差異：生長速度較快的公雞相較于母雞更容易感染該病，14～20日齡的雛雞體內(nèi)不具有保護性的母源抗體，更容易暴發(fā)壞死性腸炎疫病[26]。

2 優(yōu)化人工造模方法

雞壞死性腸炎是一種復(fù)雜的多因素疫病，表1總結(jié)了一些能夠引起動物發(fā)病的誘導(dǎo)因素[27-28]，在試驗中可以通過人為控制其中的某些因素來調(diào)控誘導(dǎo)動物發(fā)病后產(chǎn)生癥狀的嚴重程度。

在進行動物試驗攻毒階段時試驗人員可以選擇使用哪些感染方式和感染途徑對雞群進行疫病的誘導(dǎo)感染，其中包括：單獨使用具有致病性的含有netB毒素的G型產(chǎn)氣莢膜梭菌通過灌胃或者摻拌飼料的方式進行給藥(試驗證明灌胃給藥的途徑最為快捷有效)感染雞群，雞群飼喂時飼料的選擇可以參照表1中飼料因素羅列的能加重雞壞死性腸炎的飼料進行選擇(推薦使用高淀粉多糖的粉料飼喂雞群)；另一種方法是使用球蟲或者IBDV與產(chǎn)氣莢膜梭菌聯(lián)合使用[29]：在人工復(fù)制病例過程中，球蟲的使用會明顯加重疫病的嚴重程度[30]，但球蟲的感染不是必需的，根據(jù)試驗的目的可以選擇用或者不用。不同試驗?zāi)康乃扇〉木唧w方法和給藥途徑可能不同，這都取決于研究人員的預(yù)期目的以及現(xiàn)行可用的資源。

表1 雞壞死性腸炎的誘導(dǎo)因素

3 雞壞死性腸炎發(fā)病模型的評分系統(tǒng)

雞壞死性腸炎病例復(fù)制試驗中，對于雞產(chǎn)生的壞死性腸炎進行病變評分是確定發(fā)病模型是否成功的關(guān)鍵，壞死性腸炎的大體病變包括多灶性至煤樣化的黏膜纖維化至潰瘍性病變，炎癥引起的黏膜壁增厚和黏膜粘連滲出或黏膜脫落導(dǎo)致的黏膜壁變薄或平滑肌張力喪失，腸道伴有或不伴有氣體膨脹，這些變化在嚴重程度上各不相同。在病變評分時，非常重要的一點是評估整個小腸的病變程度，因為病變可能只是局限于十二指腸，大多數(shù)最嚴重的病變出現(xiàn)在空腸，但在壞死性腸炎癥狀非常嚴重的情況下回腸也會受到影響。目前全球公認的壞死性腸炎病變評分系統(tǒng)：分別是0～6分制和0～4分制。0～6 分的評分系統(tǒng)具體評分細則，0分：無明顯病變；1分：腸壁變薄或易碎；2分：1～5個局灶性壞死；3分： 6～15個局灶性壞死；4分：16個或 16個以上局灶性壞死；5分：2～3 cm的壞死區(qū)域；6分：廣泛、 彌漫性壞死。此外0～4分評分系統(tǒng)評分細則，0分：無明顯病變；0.5分：腸系膜及小腸壁嚴重充血；1 分：腸壁變薄、變脆，出血點多于5個；2分：腸腔內(nèi)有氣體，腸壁出現(xiàn)大量出血點并伴隨少量壞死或潰瘍點；3分：腸壁出現(xiàn)區(qū)域性壞死、潰瘍；4 分：腸腔內(nèi)有大量氣體并出現(xiàn)彌漫性壞死。

為了試驗組和對照組之間進行有意義的比較，任何評分系統(tǒng)都應(yīng)該明確定義病變的嚴重程度和范圍，其中必須考慮小腸受損的比例，并且無論該特定試驗中最輕微和最嚴重的病變是什么，都必須嚴格按照病變評分系統(tǒng)對受損腸道進行評分。例如，有1 cm腸道發(fā)生了非常嚴重的病變，但在病變評分時具有這1 cm嚴重損傷的整個腸道不能被定義為具有嚴重的病變。

一些研究人員試圖尋找免疫參數(shù)來顯示對壞死性腸炎的嚴重性，例如，通過檢測腸道黏膜中細胞因子如IL-8、IL-10和IFN-γ等炎性細胞因子水平的變化也可在一定程度上反映雞壞死性腸炎的病變程度，但其結(jié)果在不同個體間差異很大，因此目前要用替代的、間接的系統(tǒng)來評估壞死性腸炎疫病的嚴重性，仍然需要很多年的時間。

4 小結(jié)及展望

4.1 飼料因素、菌株毒素類型、菌株培養(yǎng)、球蟲誘導(dǎo)、實驗動物等多種因素對人工造模的影響程度非淀粉多糖以及大豆類的飼料可以改變動物體內(nèi)菌群的數(shù)量和消化酶的活性，增加禽類患壞死性腸炎的幾率；G型產(chǎn)氣莢膜梭菌是雞壞死性腸炎的主要病原，能夠引起雞群暴發(fā)壞死性腸炎疫?。唤?jīng)FTG培養(yǎng)基培養(yǎng)15 h的G型產(chǎn)氣莢膜梭菌具有最強的致病力，更容易導(dǎo)致雞群發(fā)生壞死性腸炎；經(jīng)球蟲誘導(dǎo)后雞群腸道發(fā)生損傷，致使雞群腸道微生物發(fā)生變化，更有利于產(chǎn)氣莢膜梭菌的生長，能夠增大雞群產(chǎn)生壞死性腸炎的幾率；免疫抑制的雞、Cobb雞、公雞以及不具有母源抗體的雛雞更容易感染雞壞死性腸炎病。

4.2 雞壞死性腸炎動物發(fā)病模型能夠成功建立需要注意的關(guān)鍵因素及優(yōu)化方案菌株毒素類型和實驗動物是雞壞死性腸炎動物發(fā)病模型能夠成功建立需要注意的最關(guān)鍵因素，建議在人工造模時優(yōu)先選擇netB陽性G型產(chǎn)氣莢膜梭菌對SPF試驗雞進行動物試驗，同時需要結(jié)合自身實驗室情況對各種誘導(dǎo)因素進行篩選，選擇最適合的條件進行試驗。

4.3 改進雞壞死性腸炎的病變評分系統(tǒng)建議實驗人員選擇整個小腸的病變程度進行雞壞死性腸炎的病變評分，目前全球公認的壞死性腸炎病變評分系統(tǒng)：分別是0～6分制和0～4分制。同時需由多人進行病變評分，再對病變評分進行統(tǒng)計分析，由此得到的病變評分結(jié)果才更加具有準確性，才能使得復(fù)制雞壞死性腸炎疫病能更容易成功，對進一步研究雞壞死性腸炎疫病的病理以及分子機理，篩選有效預(yù)防和控制雞壞死性腸炎的生物制劑具有積極意義。