甘 澤，王 琪，王媛媛，趙彩英，李怡娜，張全偉，馬友記，張 勇，趙興緒*

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070；2.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070；3.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070)

髓過氧化物酶(myeloperoxidase,MPO)是一種血紅素輔基蛋白酶，屬于血紅素過氧化物酶超家族成員，受生長因子的調(diào)控，存在于多種細(xì)胞中，參與多種疾病的發(fā)生和發(fā)展過程。MPO是中性粒細(xì)胞產(chǎn)生的具有吞噬功能的溶酶體酶，通過將過氧化氫和氯離子變?yōu)榇温人醽韰⑴c對外來物質(zhì)的破壞，可作為中性粒細(xì)胞的特異性標(biāo)記物[1]。正常生理情況下，MPO是先天性免疫系統(tǒng)的一部分，通過介導(dǎo)微生物的殺傷作用來促進(jìn)宿主防御[2]；在特定條件下，MPO催化產(chǎn)生過多的活性氧觸發(fā)氧化應(yīng)激和氧化性組織損傷[3]，導(dǎo)致多種疾病的發(fā)生和發(fā)展[4]?；钚匝醯漠a(chǎn)生取決于專門的酶，例如還原型輔酶Ⅱ(NADPH)、MPO和一氧化氮合酶(NOS)等[5]。一氧化氮(NO)可作用于炎癥反應(yīng)，并在免疫調(diào)節(jié)反應(yīng)中起關(guān)鍵作用，主要由3種NOS亞型產(chǎn)生：神經(jīng)元(nNOS)、內(nèi)皮(eNOS)和誘導(dǎo)型(iNOS)[6]。研究發(fā)現(xiàn)，MPO表達(dá)水平與其啟動(dòng)子區(qū)域的等位基因多態(tài)性有關(guān)，在-463位置處(G-463A)的G被A取代后導(dǎo)致MPO轉(zhuǎn)錄水平顯著降低[7]，在-129位置處(G-129A)也發(fā)現(xiàn)G被A取代后MPO轉(zhuǎn)錄降低的現(xiàn)象[3]。最新研究表明，MPO缺乏癥有較高的發(fā)生率[8]，盡管MPO缺乏癥對降低心肌梗塞及其他心血管損傷有保護(hù)作用[9]，但MPO缺失后發(fā)生嚴(yán)重感染和慢性炎癥的幾率明顯增高[9]。但關(guān)于MPO介導(dǎo)的神經(jīng)炎癥和神經(jīng)元死亡的生化基礎(chǔ)與機(jī)理研究仍然是一個(gè)未知領(lǐng)域。總之，MPO是一種既與機(jī)體免疫防御有關(guān)，又與組織氧化損傷有關(guān)的復(fù)雜的多功能酶，它與臨床疾病的關(guān)系已得到越來越多的驗(yàn)證，隨著對其分子生物學(xué)研究的深入，MPO將會(huì)有更為廣闊的應(yīng)用前景。

本研究通過克隆小鼠MPO基因CDS區(qū)序列，進(jìn)行生物信息學(xué)分析，為研究MPO生化性質(zhì)、生物特性和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，及有關(guān)信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制提供理論依據(jù)；通過構(gòu)建MPO真核表達(dá)載體并轉(zhuǎn)染NSC-34細(xì)胞，探究細(xì)胞內(nèi)相關(guān)基因蛋白的表達(dá)變化，為研究MPO在疾病監(jiān)測和治療中的生物學(xué)作用及其水平升高與炎癥和氧化應(yīng)激之間的聯(lián)系奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器與材料1640細(xì)胞培養(yǎng)基(GE公司，美國)；T4-DNA連接酶、限制性核酸內(nèi)切酶XhoⅠ和SacⅡ(NEB公司，美國)；TransZol Up和DH5α感受態(tài)細(xì)胞(北京全式金生物技術(shù)有限公司)；高效裂解液RIPA(北京索萊寶公司)；MPO兔多克隆抗體(武漢三鷹生物技術(shù)有限公司)；兔源GAPDH多克隆抗體、HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)；Alexa Fluor 633(AF633)標(biāo)記的羊抗兔紅色熒光二抗(Thermo Fisher公司，美國)；真核表達(dá)載體pEGFP-C1(Kanamycin，4 731 bp)購于Clontech公司；小鼠神經(jīng)元細(xì)胞系NSC-34購于上海通派生物科技有限公司。Q6000B微量核酸蛋白測定儀(Quawell公司，美國)；IX71型相差顯微鏡(Olympus公司，日本)；5417R型高速冷凍離心機(jī)(Eppendorf公司，德國)；Mini-PROTEAN Tetra Cell 型垂直電泳槽、電轉(zhuǎn)印槽、梯度PCR儀、凝膠成像系統(tǒng)(Bio-Rad公司，美國)；U2800紫外分光光度計(jì)(Hitachi公司，日本)；LightCycler 96 實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(Roche，瑞士)；LSM800激光共聚焦掃描顯微鏡(CARL ZEISS，德國)等。

1.2 小鼠神經(jīng)元細(xì)胞RNA提取及cDNA合成小鼠神經(jīng)元細(xì)胞于37 ℃、5%CO2條件下使用完全培養(yǎng)基(含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基)培養(yǎng)，待細(xì)胞匯合度達(dá)90%后，用PBS清洗培養(yǎng)基收集細(xì)胞，根據(jù)TransZol Up說明書提取細(xì)胞RNA，微量核酸測定儀檢測濃度及純度；根據(jù)全式金反轉(zhuǎn)錄說明書將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，保存于-20℃冰箱。

1.3 設(shè)計(jì)引物根據(jù)NCBI已公布的小鼠MPO(NM_010824.2)、NADPH(AF276957.1)、nNOS(NM_008712.3)和GAPDH(GU214026.1)基因序列，利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物，送由西安擎科生物科技有限公司合成，引物的相關(guān)信息見表1。

表1 引物序列及擴(kuò)增片段長度

1.4 MPO基因克隆及生物信息學(xué)分析將MPO基因反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，得到MPO基因的目的條帶，膠回收后連接pUC-57-Kan載體，再轉(zhuǎn)化 DH5α感受態(tài)，在含有卡那霉素抗性(Kan)的固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，挑取單個(gè)菌落于液體培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)，并進(jìn)行菌液 PCR、雙酶切和測序鑒定。

通過NCBI網(wǎng)站BLAST工具(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) 進(jìn)行同源序列搜索，用MEGA 7.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹[10]；采用ProtParam在線工具(http://web.expasy.org/protparam/)預(yù)測MPO蛋白的基本理化性質(zhì)[11]；通過DTU Health Tech網(wǎng)站Prediction servers (http://www.cbs.dtu.dk/services/)在線工具預(yù)測MPO蛋白信號(hào)肽、跨膜結(jié)構(gòu)域、磷酸化和糖基化位點(diǎn)；運(yùn)用SOPMA軟件(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/secpred_sopma.pl)預(yù)測MPO蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)；采用折疊識(shí)別建模法通過phyre2在線軟件(http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/page.cgii?id=index)預(yù)測MPO蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)[12]；在網(wǎng)頁P(yáng)SORTⅡ(https://psort.hgc.jp/form2.html) 上進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測；運(yùn)用STRING (https://string-db.org/)構(gòu)建MPO蛋白的互作網(wǎng)絡(luò)[13]。

1.5 pEGFP-C1-MPO表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定將測序正確的pUC-57-Kan-MPO表達(dá)載體和pEGFP-C1載體用XhoⅠ和SacⅡ雙酶切，對目的條帶進(jìn)行膠回收；用T4連接酶將純化的MPO基因與pEGFP-C1載體連接，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，接種于含Kan抗性(100 mg/L)的LB瓊脂平板上，挑選單一陽性克隆的菌斑進(jìn)行搖菌、過夜培養(yǎng)、提取質(zhì)粒，并分別進(jìn)行菌液 PCR、雙酶切及測序鑒定。

1.6 pEGFP-C1-MPO轉(zhuǎn)染NSC-34細(xì)胞正常培養(yǎng)小鼠神經(jīng)元細(xì)胞NSC-34，當(dāng)35 mm培養(yǎng)皿中細(xì)胞匯合度達(dá)到70%～80%時(shí)，利用Lipofectamine 2000參考文獻(xiàn)及說明書[14]，將pEGFP-C1和pEGFP-C1-MPO兩種載體進(jìn)行稀釋，室溫靜置15～20 min 后，均勻滴入培養(yǎng)皿，于37 ℃、5% CO2正常培養(yǎng)，6 h后換2 mL含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，轉(zhuǎn)染48 h后收集各組培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

1.7 qRT-PCR及Western blot分析提取上述各組細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。選用GAPDH為內(nèi)參基因，檢測MPO及NADPH、nNOS 基因mRNA的表達(dá)水平。結(jié)果采用2-△△Ct法進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。

取細(xì)胞總蛋白30 μg，通過12% SDS-PAGE分離膠分離，100 V恒壓轉(zhuǎn)PVDF膜，脫脂牛奶封閉1.5～2.0 h；選用GAPDH作為內(nèi)參，一抗4 ℃過夜孵育，二抗37 ℃孵育2 h，ECL發(fā)光法顯色曝光，運(yùn)用Image J軟件進(jìn)行灰度掃描分析。

1.8 細(xì)胞免疫熒光染色將細(xì)胞接種于蓋玻片，待轉(zhuǎn)染成功后，置于4%多聚甲醛室溫固定30 min，棄去固定液，用0.5% Triton X-100室溫孵育10 min，3% H2O2室溫孵育10 min，山羊血清4 ℃封閉15 min，棄去封閉液，滴加一抗(MPO)，4 ℃濕盒孵育過夜；避光滴加AF633紅色熒光標(biāo)記的二抗，室溫避光孵育1 h，PBS洗3次，避光滴加二脒基苯基吲哚(DAPI)染核，室溫靜置3～5 min，滴加少量的抗熒光淬滅封片劑封片。

在激光共聚焦顯微鏡下觀察：載體表達(dá)的EGFP蛋白顯綠色，DAPI標(biāo)記的細(xì)胞核顯藍(lán)色，AF633標(biāo)記的陽性表達(dá)部位顯紅色。

2 結(jié)果

2.1 MPO基因克隆將pUC-57-Kan載體與MPO基因擴(kuò)增產(chǎn)物雙酶切后進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞后涂板，挑選單一菌落擴(kuò)大培養(yǎng)。經(jīng)菌液PCR檢測，得到單一條帶大小約為2 171 bp(圖1A)；對pUC57-T-MPO克隆載體進(jìn)行XhoⅠ和SacⅡ雙酶切及測序鑒定，雙酶切結(jié)果顯示目的片段大小和與預(yù)期的大小一致(圖1B)；陽性克隆測序結(jié)果與NCBI中序列進(jìn)行比對，結(jié)果相似度達(dá)100%；結(jié)果表明成功克隆小鼠MPO基因CDS區(qū)序列。

2.2 表達(dá)載體pEGFP-C1-MPO的鑒定將pUC57-T-MPO克隆載體和pEGFP-C1載體雙酶切，回收目的片段連接空載體，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞后涂板，挑選單一菌落進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，菌液PCR電泳檢測結(jié)果顯示，擴(kuò)增產(chǎn)物條帶大小為2 171 bp(圖1C)；將pEGFP-C1-MPO表達(dá)載體進(jìn)行XhoⅠ和SacⅡ雙酶切后獲得2條大小分別約為4 700 bp和2 171bp的條帶(圖1D)；結(jié)果表明，pEGFP-C1-MPO表達(dá)載體構(gòu)建成功。

M.DNA相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；L1.pUC-57-Kan-MPO菌液PCR產(chǎn)物；L2.pUC-57-Kan-MPO；L3.pUC-57-Kan-MPO雙酶切產(chǎn)物；L4.pEGFP-C1-MPO菌液PCR產(chǎn)物；L5.EGFP-C1-MPO雙酶切產(chǎn)物；L6.pEGFP-C1-MPO

2.3 MPO基因生物信息學(xué)分析系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果顯示：小鼠MPO基因與章魚、美洲灰熊、馬的親緣關(guān)系最為接近，與人、非洲爪蟾、揚(yáng)子鱷的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)(圖2)。小鼠MPO蛋白氨基酸預(yù)測結(jié)果表明：小鼠MPO蛋白由718個(gè)共19種氨基酸組成，其中亮氨酸(Leu)最多(85，11.80%)，組氨酸(His)最少(8，1.11%)；理化性質(zhì)預(yù)測結(jié)果表明：小鼠MPO蛋白由11 436個(gè)原子組成，相對分子質(zhì)量為81 181.66，718個(gè)氨基酸中帶負(fù)電荷氨基酸殘基共60個(gè)，正電荷氨基酸殘基共88個(gè)，理論等電點(diǎn)為9.63，其不穩(wěn)定系數(shù)為43.53，脂肪系數(shù)為85.31，親水性為-0.311，預(yù)測該蛋白為不穩(wěn)定的親水蛋白；信號(hào)肽和跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測表明：MPO蛋白無跨膜結(jié)構(gòu)、無信號(hào)肽；磷酸化和糖基化位點(diǎn)預(yù)測顯示：MPO共有52個(gè)磷酸化位點(diǎn)，其中有25個(gè)絲氨酸磷酸化位點(diǎn)、6個(gè)蘇氨酸磷酸化位點(diǎn)和21個(gè)酪氨酸磷酸化位點(diǎn)；蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測結(jié)果顯示： 43.61%的α螺旋、5.69%的β折疊、4.72%的β轉(zhuǎn)角和45.79%的無規(guī)卷曲共同構(gòu)成了MPO蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)；三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果顯示：該蛋白有18個(gè)α-螺旋，4個(gè)β折疊及大部分的無規(guī)卷曲構(gòu)成，這與二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果基本一致(圖3A)。亞細(xì)胞定位預(yù)測結(jié)果表明：MPO蛋白在細(xì)胞核 (12.9%)、線粒體 (21.7%)、細(xì)胞骨架 (13.0%)和細(xì)胞質(zhì) (52.2%) 中均發(fā)揮一定的生物學(xué)作用；string結(jié)果表明MPO與NADPH、nNOS、TNF、CAT等蛋白存在一定的互作關(guān)系(圖3B)。

圖2 不同物種基于MPO的系統(tǒng)進(jìn)化樹

圖3 MPO蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)(A)及MPO蛋白互作關(guān)系(B)預(yù)測結(jié)果

2.4 pEGFP-C1-MPO表達(dá)載體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染NSC-34細(xì)胞pEGFP-C1空載體及pEGFP-C1-MPO表達(dá)載體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染小鼠NSC-34細(xì)胞48 h，用倒置熒光顯微鏡觀察綠色熒光蛋白的表達(dá)情況，結(jié)果細(xì)胞中綠色熒光清晰可見，表明pEGFP-C1空載體與pEGFP-C1-MPO表達(dá)載體成功轉(zhuǎn)入細(xì)胞內(nèi)(圖4)。

2.5 qRT-PCR及Western blot檢測轉(zhuǎn)染效率利用qRT-PCR對MPO目的基因和GAPDH內(nèi)參基因進(jìn)行擴(kuò)增后，檢測MPO 基因mRNA的表達(dá)情況。結(jié)果顯示：試驗(yàn)組MPO基因mRNA的表達(dá)水平顯著升高，且與陰性對照組和空白對照組相比差異極顯著(P<0.01)，而空白對照組與陰性對照組相比MPO基因mRNA的表達(dá)水平無顯著性差異(P>0.05)(圖5)。

圖4 轉(zhuǎn)染NSC-34細(xì)胞48 h熒光照片(100×)

*.P<0.05；***.P<0.01。下同

Western blot檢驗(yàn)蛋白表達(dá)水平，用GAPDH對小鼠不同組別MPO的表達(dá)豐度進(jìn)行校正，結(jié)果顯示：試驗(yàn)組MPO蛋白的表達(dá)豐度明顯上調(diào)，極顯著高于陰性對照組(P<0.01)(圖6)，與qRT-PCR的結(jié)果一致。

圖6 Western blot檢測MPO蛋白表達(dá)水平

2.6 過表達(dá)MPO基因后相關(guān)基因表達(dá)水平的檢測以反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，選擇GAPDH為內(nèi)參基因，以陰性對照組為參照，經(jīng)qRT-PCR檢測NADPH和nNOS 基因的表達(dá)情況。結(jié)果表明：試驗(yàn)組nNOS mRNA表達(dá)水平顯著高于陰性對照組(P<0.05)，NADPH mRNA表達(dá)水平顯著低于陰性對照組(P<0.05)，表明nNOS 隨MPO表達(dá)上調(diào)而顯著升高，NADPH隨MPO表達(dá)上調(diào)而顯著降低(圖7)。

2.7 細(xì)胞免疫熒光染色將瞬時(shí)轉(zhuǎn)染pEGFP-C1-MPO和pEGFP-C1載體的NSC-34細(xì)胞，通過細(xì)胞免疫熒光對小鼠MPO蛋白進(jìn)行細(xì)胞定位檢測。結(jié)果表明：轉(zhuǎn)染pEGFP-C1載體后，MPO蛋白主要分布于細(xì)胞質(zhì)中，而過表達(dá)MPO后，除了在細(xì)胞質(zhì)中存在高表達(dá)外，在細(xì)胞核中也發(fā)現(xiàn)MPO蛋白陽性表達(dá)(圖8)。

圖7 qRT-PCR檢測NADPH和nNOS mRNA表達(dá)水平

3 討論

MPO是一種過氧化物酶，也是一種重要的含鐵溶酶體，存在于髓系細(xì)胞的嗜苯胺藍(lán)顆粒中，是髓細(xì)胞的特異性標(biāo)志。隨著對MPO基因研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)MPO基因的增加或缺失會(huì)導(dǎo)致個(gè)體對一些疾病易感性的差異，它與人類多種疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，因此越來越受到國內(nèi)外學(xué)者的重視。JI等[15]的研究證實(shí)MPO基因多態(tài)性與患阿爾茨海默氏病(AD)風(fēng)險(xiǎn)的遺傳關(guān)聯(lián)；NDREPEPA 等[16]強(qiáng)調(diào)MPO水平與心血管疾病的患病率和嚴(yán)重程度相關(guān)。本研究通過對小鼠MPO基因的克隆及生物信息學(xué)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：小鼠MPO與章魚、美洲灰熊和馬的親緣關(guān)系最為接近，與人、非洲爪蟾和揚(yáng)子鱷的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，但氨基酸的同源性都在79.25%以上。胡寶慶等[17]研究表明，在不同物種間MPO存在較高的同源性。綜上說明，MPO基因的核苷酸突變反映在蛋白質(zhì)水平多屬同義突變，表明在不同物種間MPO基因有較高的保守性，在生物遺傳過程中該基因?qū)τ诰S護(hù)機(jī)體正常生理功能具有重要的意義[18]。HANSON等[19]與 CARPENA等[20]提出MPO存在4個(gè)糖基化位點(diǎn)Asn 323、Asn 355、Asn 391和Asn 483，晶體學(xué)數(shù)據(jù)表明只有3個(gè)(Asn 355、Asn 391和Asn 483)；VAN ANTWERPEN等[21]認(rèn)為除Asn 323、Asn 355、Asn 391和Asn 483這4個(gè)之外還有一個(gè)Asn 729糖基化位點(diǎn)。本試驗(yàn)預(yù)測出MPO置信度大于0.7的糖基化位點(diǎn)有4個(gè)，與 VAN ANTWERPEN等[21]的結(jié)果一致。重鏈的糖基化對于MPO的酶促活性很重要，去糖基化的MPO氯化活性顯著降低。蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果顯示MPO中主要由無規(guī)卷曲構(gòu)成(45.79%)，其次是α螺旋(43.61%)，而β折疊和β轉(zhuǎn)角僅占10%左右，α螺旋和β折疊相對較穩(wěn)定，但含量較少，無規(guī)卷曲占比較高使蛋白質(zhì)分子空間結(jié)構(gòu)相對不穩(wěn)定[22]，這與通過理化參數(shù)計(jì)算所得的結(jié)果一致[11]。亞細(xì)胞定位預(yù)測結(jié)果表明MPO蛋白主要在細(xì)胞質(zhì) (52.2%)中發(fā)揮生物學(xué)作用。免疫熒光結(jié)果表明，正常情況下MPO主要分布于細(xì)胞質(zhì)中，但當(dāng)MPO攜帶一個(gè)含有CMV強(qiáng)啟動(dòng)子的表達(dá)載體時(shí)，MPO 出現(xiàn)了入核現(xiàn)象，這種現(xiàn)象提示其可能與核膜上的核孔復(fù)合體有關(guān)并與轉(zhuǎn)運(yùn)受體激活相關(guān)[23]。蛋白互作發(fā)現(xiàn)MPO與NADPH、nNOS、iNOS、TNF和CAT等蛋白存在相互作用關(guān)系。大量研究證實(shí)[13]MPO與NADPH[24]和nNOS[25]等蛋白存在互作關(guān)系，其中MPO、NADPH和nNOS均在Phagosome(ko04145)這一信號(hào)通路上。

圖8 免疫熒光檢測MPO在細(xì)胞中的分布

為了進(jìn)一步研究MPO生物學(xué)功能，本研究選用pEGFP-C1真核強(qiáng)啟動(dòng)子表達(dá)載體，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染NSC-34細(xì)胞。結(jié)果表明，試驗(yàn)組綠色熒光表達(dá)量低于陰性對照組，推測可能與轉(zhuǎn)染載體的大小有關(guān)(pEGFP-C1-MPO， 6 860 bp；pEGFP-C1， 4 689 bp)，這種現(xiàn)象與戚順民等[26]成功構(gòu)建H-FABP基因的真核表達(dá)載體并轉(zhuǎn)染PK15細(xì)胞的現(xiàn)象一致。轉(zhuǎn)染結(jié)果表明，試驗(yàn)組MPO mRNA和蛋白表達(dá)量極顯著高于陰性對照組，從mRNA轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)水平均證明過表達(dá)載體pEGFP-C1-MPO構(gòu)建成功而且有效。MPO蛋白在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)便于結(jié)合和轉(zhuǎn)運(yùn)低密度脂蛋白(low density lipoprotein,LDL)和載脂蛋白A-1[1]等，進(jìn)而影響各種代謝酶、受體、細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)和基因表達(dá)等。研究顯示，MPO主要作為氧化應(yīng)激和系統(tǒng)炎癥標(biāo)志物，是預(yù)測急性冠狀動(dòng)脈綜合征(ACS)的新型標(biāo)志物，對ACS患者的診斷及預(yù)測均有較高的價(jià)值。MPO其水平增高可以反映中性粒細(xì)胞在某一組織中的增高，間接反映炎癥在組織中的存在，MPO活性越高，說明組織炎癥程度越重[3]。炎性狀態(tài)下MPO能將亞硝酸鹽氧化成NO2，從而削弱NO2-依賴性血管緊張素的松弛作用并降低鳥苷酸環(huán)化酶的活性，在此過程中，一氧化氮(NO)是MPO的一種重要的生理底物，過表達(dá)MPO模擬炎癥環(huán)境發(fā)現(xiàn)這一過程消耗大量的NO，從而誘導(dǎo)合成NO的NOS表達(dá)量升高[27]。本研究所用的細(xì)胞為小鼠神經(jīng)元細(xì)胞，該細(xì)胞中誘導(dǎo)合成NO的NOS為nNOS[6]，即nNOS的表達(dá)量升高。有研究報(bào)道，NO的合成速度降低或消耗速度加快會(huì)導(dǎo)致NO的反應(yīng)性降低，對NADPH的消耗減少[28]。本試驗(yàn)中過表達(dá)MPO后NO消耗速度增加，從而使NADPH氧化酶的表達(dá)量降低。

本研究成功從NSC-34細(xì)胞中克隆小鼠MPO基因的CDS區(qū)序列，初步預(yù)測小鼠MPO蛋白由718個(gè)氨基酸組成，其二級(jí)結(jié)構(gòu)含43.61%的α螺旋、5.69%的β折疊、4.72%的β轉(zhuǎn)角和45.79%的無規(guī)卷曲，為不穩(wěn)定的親水性蛋白。pEGFP-C1-MPO表達(dá)載體成功轉(zhuǎn)染NSC-34細(xì)胞，結(jié)果證實(shí)MPO主要表達(dá)在細(xì)胞質(zhì)中，MPO 基因體外過表達(dá)可促進(jìn)nNOS表達(dá)，抑制NADPH的表達(dá)。本研究為MPO基因功能及信號(hào)通路的研究提供理論依據(jù)。