卞曉萍，劉 青，孔慶科，羅洪艷，李 沛

(西南大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，重慶 北碚 400700)

目前廣泛應(yīng)用于大腸桿菌基因敲除的方法有噬菌體重組酶介導(dǎo)的λ-Red重組系統(tǒng)，該技術(shù)的原理是將一段攜帶有靶基因兩側(cè)各40～60 bp 同源序列的 PCR 產(chǎn)物或合成的寡核苷酸片段，通過電轉(zhuǎn)化法導(dǎo)入宿主菌內(nèi)，然后在Red重組酶的作用下，使導(dǎo)入宿主菌內(nèi)的線性 DNA 片段與基因組上的特定靶序列進(jìn)行高效的同源重組，從而將靶基因置換下來[1-2]。雖然λ-Red同源重組系統(tǒng)是細(xì)菌基因敲除的有力技術(shù)，但是通過FLP重組酶去除抗生素標(biāo)記會(huì)在細(xì)菌的基因組上留下FRT疤痕[3]。在標(biāo)準(zhǔn)λ-Red同源重組系統(tǒng)中，每個(gè)轉(zhuǎn)入的線性 DNA 片段均編碼一個(gè)選擇性的抗生素抗性標(biāo)記，其兩側(cè)的FLP位點(diǎn)是 FRT疤痕的來源。如果使用該方法在同一個(gè)細(xì)菌中引入多個(gè)突變，則每次突變成功后遺留下的FRT疤痕都會(huì)影響下一個(gè)突變的成功率，比如：FLP重組酶可能會(huì)消除基因組上任意兩個(gè)相鄰的FRT位點(diǎn)，得到并非我們想要的突變；同時(shí)，過多的疤痕會(huì)使宿主菌的基因組變得不穩(wěn)定，有可能發(fā)生基因組的重排[4]。本研究應(yīng)用的無痕缺失方法與此相反，不會(huì)留下任何疤痕。除了λ-Red重組系統(tǒng)，自殺質(zhì)粒介導(dǎo)的同源重組基因敲除方法也應(yīng)用較為廣泛，但該方法對(duì)某些保守且敲除困難的基因篩選效率極低，這也限制了該技術(shù)的應(yīng)用。

在細(xì)菌和古細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)的CRISPR(clustered regularly interspaced short palindromic repeats)與Cas蛋白共同作用可協(xié)助細(xì)菌抵御外源質(zhì)粒、噬菌體等的侵害。其中，在嗜熱鏈球菌(Streptococcusthermophilus)中發(fā)現(xiàn)的Ⅱ型 CRISPR/Cas9系統(tǒng)組分較為簡單，操作較容易，是目前研究的熱門工具，也是本研究所應(yīng)用的CRISPR/Cas系統(tǒng)。CRISPR/Cas9系統(tǒng)需要轉(zhuǎn)錄兩個(gè)RNA片段，一個(gè)是前體CRISPR(precursorCRISPR RNA，pre-crRNA)，另一個(gè)是轉(zhuǎn)錄激活 RNA(trans-activating RNA，tracrRNA)。這兩個(gè)RNA通過堿基配對(duì)形成二聚體，與Cas9蛋白結(jié)合，形成復(fù)合物；然后，在pre-crRNA的介導(dǎo)下發(fā)揮Cas9蛋白的HNH與RuvC活性，切割基因組特定位置的DNA，形成DNA雙鏈斷裂[8]。JINEK等[9]將pre-crRNA和tracrRNA加工成一條單鏈RNA嵌合體，稱之為gRNA。CRISPR/Cas9中g(shù)RNA的3′端還有一段小的前間區(qū)序列鄰近基序( protospacer adjacent motifs，PAM)，目前證明PAM一般為NGG，是CRISPR/Cas9系統(tǒng)的必備區(qū)域。因?yàn)镃as9蛋白的切割作用不僅依靠crRNA序列與目標(biāo)序列的堿基匹配，還要依靠與目標(biāo)序列緊鄰的PAM序列。若沒有PAM序列或者該序列發(fā)生改變，那么Cas9蛋白就不能發(fā)揮作用，這也將限制CRISPR/Cas9系統(tǒng)的作用，使其不能應(yīng)用在任意序列上，但是這種機(jī)制也使該系統(tǒng)能分清自身和外來的入侵者?；贑RISPR/Cas9這一優(yōu)越的基因編輯工具，本研究以大腸桿菌W3310為背景菌株，建立大腸桿菌CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)，對(duì)其waaL和wecA基因進(jìn)行敲除，從而為大腸桿菌工程菌的構(gòu)建奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株、質(zhì)粒、培養(yǎng)基和抗生素E.coliTop10和E.coliW3110由本實(shí)驗(yàn)室保存。pCas9-CR4(#62655)、pKDsgRNA-p15(#62656)購自Addgene，其中，pKDsgRNA-p15是溫敏型質(zhì)粒；pKDsgRNA-Kan、pKDsgRNA-kan-DwaaL、pKDsgRNA-kan-DwecA由本研究構(gòu)建，pSW3337-kan由本實(shí)驗(yàn)室保存。培養(yǎng)基為LB培養(yǎng)基。抗生素：氨芐青霉素(ampicillin)終質(zhì)量濃度100 mg/L，卡那霉素(kanamycin)終質(zhì)量濃度50 mg/L，氯霉素(chloramphenicol)終質(zhì)量濃度25 mg/L，強(qiáng)力霉素(doxycycline)終質(zhì)量濃度1 mg/L，阿拉伯糖終濃度0.2%。

1.2 主要試劑胰蛋白胨、酵母提取物、氯化鈉和瓊脂粉購自英國 OXOID公司；氯霉素、氨芐青霉素、卡那霉素、Tet啟動(dòng)子誘導(dǎo)劑強(qiáng)力霉素和阿拉伯糖購自生工生物工程(上海) 股份有限公司；Gibson assembly?master mix購自美國 NEB 公司；PrimerStar高保真酶購自大連寶生物公司；2×prime mix、DNA 產(chǎn)物純化試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒及Marker Ⅲ購自天根生化科技(北京)有限公司。

1.3 PCR引物根據(jù)GenBank中公布的W3110菌株waaL和wecA的基因序列，用Snapgene軟件設(shè)計(jì)引物(表1)，并送往生工生物工程(上海) 股份有限公司合成。

1.4 pKDsgRNA-kan-DwaaL質(zhì)粒的構(gòu)建原質(zhì)粒pKDsgRNA-p15是壯觀霉素抗性，為了后續(xù)的研究方便，將其換成卡那霉素抗性，并命名為pKDsgRNA-kan。通過網(wǎng)站http://crispor.tefor.net/crispor.py設(shè)計(jì)waaL基因的Spacer，然后將Spacer的20 bp序列加入引物gRNA-DwaaL-1F的5′端。以質(zhì)粒pKDsgRNA-kan為模板，gRNA-DwaaL-1F和pair with F、pair with R和gRNA-DwaaL-2R為引物，使用PrimerStar高保真酶PCR擴(kuò)增片段1和片段2。PCR產(chǎn)物經(jīng)核酸凝膠電泳鑒定、回收后，用環(huán)形PCR法連接片段1和片段2[10]。獲得的產(chǎn)物電轉(zhuǎn)化至E.coliTop10感受態(tài)細(xì)胞中，小提質(zhì)粒，用測序引物pKD_Seq5測序鑒定。將構(gòu)建好的質(zhì)粒命名為pKDsgRNA-kan-DwaaL。

1.5waaL基因同源修復(fù)供體DNA片段的擴(kuò)增以E.coliW3110基因組為模板，DwaaL-1F和DwaaL-1R、DwaaL-2F和DwaaL-2R為引物，使用PrimerStar高保真酶PCR擴(kuò)增片段3和片段4。PCR產(chǎn)物經(jīng)核酸凝膠電泳鑒定、回收后，以DwaaL-1F和DwaaL-2R為引物，使用PrimerStar高保真酶將片段3和片段4用重疊延伸PCR法擴(kuò)增同源修復(fù)供體DNA片段。

1.6 感受態(tài)細(xì)胞的制備及細(xì)菌的轉(zhuǎn)化按照《分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)》中的方法制備E.coliW3110電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞。將pCas9-CR4質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至該感受態(tài)細(xì)胞中，制備含有pCas9-CR4質(zhì)粒的E.coliW3110電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞。將質(zhì)粒pKDsgRNA-kan-DwaaL轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞中，最后制備同時(shí)含有pCas9-CR4和pKDsgRNA-kan-DwaaL質(zhì)粒的E.coliW3110電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞。本次制備感受態(tài)與前兩次不同，感受態(tài)細(xì)胞在30℃生長至D600=0.8，然后加入終濃度0.2%的阿拉伯糖，繼續(xù)培養(yǎng)30 min，以誘導(dǎo)重組酶基因的表達(dá)，最后再制備電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞[11]。將200～1 000 ng供體DNA加入到感受態(tài)細(xì)胞中，電轉(zhuǎn)產(chǎn)物復(fù)蘇后，稀釋100倍，涂布于含卡那霉素、氯霉素以及強(qiáng)力霉素(1 mg/L)的LB平板上,30℃過夜培養(yǎng)，用引物DwaaL-1F和DwaaL-2R鑒定單克隆。

表1 引物序列

1.7 pKDsgRNA-kan-waaL質(zhì)粒的消除將鑒定正確的突變株轉(zhuǎn)接至LB液體培養(yǎng)基中，置于37℃過夜培養(yǎng)以消除pKDsgRNA-kan-DwaaL溫敏質(zhì)粒。圖1為敲除模式示意圖。

圖1 CRISPR/Cas9系統(tǒng)敲除基因示意圖[10]

1.8wecA基因的敲除為驗(yàn)證該系統(tǒng)能夠有效地應(yīng)用于大腸桿菌的基因敲除，用同樣的方法將大腸桿菌W3110的wecA基因進(jìn)行敲除。

1.9 pCas9-CR4質(zhì)粒的消除由于pCas9-CR4質(zhì)粒是p15a的復(fù)制子，而pKDsgRNA-kan質(zhì)粒上的Spacer是針對(duì)p15a的復(fù)制子，因此將pKDsgRNA-kan質(zhì)粒轉(zhuǎn)入已敲除目的基因的宿主菌中，涂布于只含卡那霉素的LB瓊脂平板上，置于30℃培養(yǎng)。挑取轉(zhuǎn)化子檢測其對(duì)氯霉素的抗性，若對(duì)氯霉素敏感，則已消除pCas9-CR4質(zhì)粒。隨后37℃過夜培養(yǎng)即可消除轉(zhuǎn)入的pKDsgRNA-kan溫敏質(zhì)粒。

2 結(jié)果

2.1 pKDsgRNA-kan質(zhì)粒的構(gòu)建以pKDsgRNA-p15為模板，pKDsgRNA-2F和pKDsgRNA-2R為引物擴(kuò)增pKDsgRNA載體DNA片段a；以pSW-3337-kan為模板，pKDsgRNA-1F-kan和pK-DsgRNA-1R為引物擴(kuò)增卡那霉素基因 DNA片段b(圖2)。將擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)核酸凝膠電泳鑒定、回收后，用環(huán)式PCR法連接2個(gè)DNA片段，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至E.coliTop10感受態(tài)細(xì)胞中。小提質(zhì)粒，命名為pKDsgRNA-kan，并將其送至生工生物工程(上海) 股份有限公司測序，測序結(jié)果與預(yù)期序列一樣，可用于下一步試驗(yàn)。

M.DNA Marker；1.DNA fragment a；2.DNA fragment b

2.2 pKDsgRNA-kan-waaL質(zhì)粒的構(gòu)建用PrimerStar高保真酶擴(kuò)增片段1、片段2(圖3)，產(chǎn)物經(jīng)核酸凝膠電泳鑒定、回收后，用Gibson assembly?master mix組裝，組裝產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到E.coliTop10感受態(tài)細(xì)胞中，小提質(zhì)粒，命名為pKDsgRNA-kan-waaL，并將其送至生工生物工程(上海) 股份有限公司測序，測序結(jié)果顯示Spacer與gRNA序列與預(yù)期序列一樣(圖4)，可用于下一步試驗(yàn)。

M.DNA Marker；1.DNA fragment 1；2.DNA fragment 2

圖4 pKDsgRNA-kan-DwaaL質(zhì)粒Spacer與gRNA測序圖

2.3waaL基因同源修復(fù)供體DNA的擴(kuò)增以提取的W3110基因組為模板，DwaaL-1F和DwaaL-1R為引物擴(kuò)增DNA片段3，DwaaL-2F和DwaaL-2R為引物擴(kuò)增DNA片段4，核酸凝膠電泳結(jié)果與預(yù)期條帶大小均一致(圖5)?；厥丈舷峦幢郏ㄟ^重疊延伸PCR法將上下同源臂融合，核酸凝膠電泳結(jié)果與預(yù)期條帶大小均一致(圖6)。

2.4waaL基因的敲除通過電轉(zhuǎn)化法將供體DNA轉(zhuǎn)入含pCas9-CR4和pKDsgRNA-kan-DwaaL質(zhì)粒的E.coliW3110，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布于含氯霉素、卡那霉素以及強(qiáng)力霉素的LB瓊脂平板。待平板上長出單克隆，用引物DwaaL-1F和DwaaL-2R對(duì)單克隆進(jìn)行鑒定(圖7)。waaL基因沒有被敲除修復(fù)的菌，PCR顯示約2 000 bp的條帶，反之出現(xiàn)754 bp的條帶。測序結(jié)果與設(shè)計(jì)的同源臂序列一致，表明敲除后的waaL基因在人工設(shè)計(jì)的供體序列下發(fā)生了同源修復(fù)。

M.DNA Marker；1.DNA fragment 3；2.DNA fragment 4

M.DNA Marker；1.overlap DNA fragment

M.DNA Marker；1～6.PCR identification of waaL gene in W3110；7.Negative control；8.Positive control

2.5wecA基因的敲除為驗(yàn)證該系統(tǒng)能夠確切地應(yīng)用于大腸桿菌基因的敲除，對(duì)W3110的wecA基因進(jìn)行敲除。構(gòu)建pKDsgRNA-kan-DwecA質(zhì)粒的DNA片段擴(kuò)增結(jié)果如圖8所示，該質(zhì)粒測序結(jié)果如圖9所示，同源修復(fù)供體DNA的擴(kuò)增如圖10所示。轉(zhuǎn)化子鑒定如圖11所示，測序結(jié)果與設(shè)計(jì)的同源臂序列一致，表明敲除后的wecA基因在人工設(shè)計(jì)的供體序列下發(fā)生了同源修復(fù)。以上結(jié)果均表明，本研究構(gòu)建的CRISPR/Cas9系統(tǒng)在人工同源修復(fù)下，可對(duì)大腸桿菌基因進(jìn)行高效敲除。

M.DNA Marker；1.DNA fragment 1；2.DNA fragment 2

圖9 pKDsgRNA-kan-DwecA質(zhì)粒測序圖

3 討論

雖然CRISPR/Cas系統(tǒng)最初是在細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)的，但是大多數(shù)基于CRISPR/Cas系統(tǒng)的基因編輯則廣泛應(yīng)用于真核生物中[1,11]。與真核生物不同，細(xì)菌的非同源末端連接(non-homologous end-joining，NHEJ)修復(fù)能力比較弱，且在許多情況下，若無外源重組酶的協(xié)助，其同源定向修復(fù)(homology-directed repair，HDR)也不一定有效，因此CRISPR/Cas9系統(tǒng)誘導(dǎo)的基因組DNA雙鏈斷裂對(duì)細(xì)菌而言往往是致死性的?；诩?xì)菌的這一特點(diǎn)，研究者將CRISPR/Cas9系統(tǒng)與噬菌體重組酶介導(dǎo)的λ-Red重組系統(tǒng)相結(jié)合，使得供體DNA序列不需要克隆到載體上，可以直接轉(zhuǎn)化DNA片段的PCR產(chǎn)物，從而提升CRISPR/Cas9誘導(dǎo)的同源修復(fù)效率，實(shí)現(xiàn)對(duì)大腸桿菌基因組更高效的編輯[12]。

M.DNA Marker；1.wecA gene homology repair DNA fragment 1；2.wecA gene homology repair DNA fragment 2；3.wecA gene homology repair DNA fragment fusion

M.DNA Marker；1～14.PCR identification of wecA gene in W3110；15.Positive control；16.Negative control

與以往應(yīng)用于原核生物中的CRISPR/Cas9系統(tǒng)相比，本研究所用的CRISPR/Cas9無痕缺失系統(tǒng)無需使用任何選擇性標(biāo)記即可進(jìn)行單步基因組改變，該系統(tǒng)含有靶向宿主細(xì)胞基因組的非溫敏型pCas9-CR4和溫敏型pKDsgRNA-kan兩個(gè)質(zhì)粒[11]。當(dāng)運(yùn)用該系統(tǒng)成功缺失一個(gè)基因后，若需繼續(xù)缺失下一個(gè)基因，則可快速高效地消除溫敏型pKDsgRNA-kan質(zhì)粒；此時(shí)，由于宿主菌中仍含有非溫敏型pCas9-CR4質(zhì)粒，因此可直接用于下一個(gè)基因的缺失，無需再次轉(zhuǎn)化pCas9-CR4質(zhì)粒，這大大提高了試驗(yàn)效率。pCas9-CR4和pKDsgRNA-kan質(zhì)粒都含有Tet調(diào)控表達(dá)系統(tǒng)，當(dāng)無誘導(dǎo)藥物(如強(qiáng)力霉素)存在時(shí)，TetR阻遏蛋白會(huì)與TetO操縱子結(jié)合，從而阻斷Cas9蛋白和sgRNA的表達(dá)；當(dāng)有誘導(dǎo)藥物存在時(shí)，TetR阻遏蛋白的構(gòu)象會(huì)發(fā)生改變，并從TetO操縱子上脫離下來，使得Cas9蛋白和sgRNA可以同時(shí)順利表達(dá)，繼而發(fā)揮CRISPR/Cas9系統(tǒng)的剪切基因組作用。為了更加嚴(yán)謹(jǐn)?shù)卣{(diào)控表達(dá)Cas9蛋白，在Cas9蛋白相應(yīng)序列的C末端添加了SsrA標(biāo)簽，SsrA標(biāo)簽可被ClpP蛋白酶識(shí)別；當(dāng)Cas9蛋白“漏”表達(dá)時(shí)，由于SsrA標(biāo)簽的存在，ClpP蛋白酶可快速高效地降解Cas9蛋白，這使Cas9蛋白的調(diào)控表達(dá)更加嚴(yán)謹(jǐn)。該質(zhì)粒還含有由阿拉伯糖誘導(dǎo)型啟動(dòng)子araCPBAD調(diào)控表達(dá)的Red 同源重組系統(tǒng)，以提高大腸桿菌同源重組效率。該系統(tǒng)與在真核生物中使用的CRISPR/Cas9系統(tǒng)情況不同，在大腸桿菌中，CRISPR/Cas9系統(tǒng)的主要作用不是用來“編輯”，而是用來篩選(負(fù)篩)；用來去除那些沒有發(fā)生基于修復(fù)片段(供體DNA)同源重組的菌株，留下那些經(jīng)同源重組修復(fù)后的突變株，其強(qiáng)大的負(fù)篩系統(tǒng)確保了較高的突變效率。JIANG等[13]也將CRISPR/Cas9系統(tǒng)與λ-Red 重組結(jié)合，與本試驗(yàn)應(yīng)用的CRISPR/Cas9系統(tǒng)相比，本研究的2個(gè)質(zhì)粒包含所需的所有組件，不需要額外的修飾，并且沒有宿主特異性。除此之外，本研究所應(yīng)用的方法在做單突變時(shí)，需要5 d，包括gRNA靶向所需的所有克隆步驟，這與其他基因敲除方法所需時(shí)間差不多。但是，在做多個(gè)突變時(shí)，由于宿主菌已經(jīng)包含pCas9-CR4質(zhì)粒，后續(xù)的試驗(yàn)可在短短3 d之內(nèi)完成，這大大提高了試驗(yàn)效率。

綜上，本研究應(yīng)用 CRISPR/Cas9 系統(tǒng)，在大腸桿菌W3110菌株中建立起利用該系統(tǒng)進(jìn)行基因敲除的試驗(yàn)平臺(tái)，并獲得了高效率的突變株。該方法高效簡單，經(jīng)濟(jì)快捷，為構(gòu)建大腸桿菌基因工程菌奠定了基礎(chǔ)。