卞曉萍，劉 青，孔慶科，羅洪艷，李 沛

(西南大學 動物科技學院，重慶 北碚 400700)

目前廣泛應用于大腸桿菌基因敲除的方法有噬菌體重組酶介導的λ-Red重組系統(tǒng)，該技術的原理是將一段攜帶有靶基因兩側各40～60 bp 同源序列的 PCR 產物或合成的寡核苷酸片段，通過電轉化法導入宿主菌內，然后在Red重組酶的作用下，使導入宿主菌內的線性 DNA 片段與基因組上的特定靶序列進行高效的同源重組，從而將靶基因置換下來[1-2]。雖然λ-Red同源重組系統(tǒng)是細菌基因敲除的有力技術，但是通過FLP重組酶去除抗生素標記會在細菌的基因組上留下FRT疤痕[3]。在標準λ-Red同源重組系統(tǒng)中，每個轉入的線性 DNA 片段均編碼一個選擇性的抗生素抗性標記，其兩側的FLP位點是 FRT疤痕的來源。如果使用該方法在同一個細菌中引入多個突變，則每次突變成功后遺留下的FRT疤痕都會影響下一個突變的成功率，比如：FLP重組酶可能會消除基因組上任意兩個相鄰的FRT位點，得到并非我們想要的突變；同時，過多的疤痕會使宿主菌的基因組變得不穩(wěn)定，有可能發(fā)生基因組的重排[4]。本研究應用的無痕缺失方法與此相反，不會留下任何疤痕。除了λ-Red重組系統(tǒng)，自殺質粒介導的同源重組基因敲除方法也應用較為廣泛，但該方法對某些保守且敲除困難的基因篩選效率極低，這也限制了該技術的應用。

在細菌和古細菌中發(fā)現(xiàn)的CRISPR(clustered regularly interspaced short palindromic repeats)與Cas蛋白共同作用可協(xié)助細菌抵御外源質粒、噬菌體等的侵害。其中，在嗜熱鏈球菌(Streptococcusthermophilus)中發(fā)現(xiàn)的Ⅱ型 CRISPR/Cas9系統(tǒng)組分較為簡單，操作較容易，是目前研究的熱門工具，也是本研究所應用的CRISPR/Cas系統(tǒng)。CRISPR/Cas9系統(tǒng)需要轉錄兩個RNA片段，一個是前體CRISPR(precursorCRISPR RNA，pre-crRNA)，另一個是轉錄激活 RNA(trans-activating RNA，tracrRNA)。這兩個RNA通過堿基配對形成二聚體，與Cas9蛋白結合，形成復合物；然后，在pre-crRNA的介導下發(fā)揮Cas9蛋白的HNH與RuvC活性，切割基因組特定位置的DNA，形成DNA雙鏈斷裂[8]。JINEK等[9]將pre-crRNA和tracrRNA加工成一條單鏈RNA嵌合體，稱之為gRNA。CRISPR/Cas9中gRNA的3′端還有一段小的前間區(qū)序列鄰近基序( protospacer adjacent motifs，PAM)，目前證明PAM一般為NGG，是CRISPR/Cas9系統(tǒng)的必備區(qū)域。因為Cas9蛋白的切割作用不僅依靠crRNA序列與目標序列的堿基匹配，還要依靠與目標序列緊鄰的PAM序列。若沒有PAM序列或者該序列發(fā)生改變，那么Cas9蛋白就不能發(fā)揮作用，這也將限制CRISPR/Cas9系統(tǒng)的作用，使其不能應用在任意序列上，但是這種機制也使該系統(tǒng)能分清自身和外來的入侵者?；贑RISPR/Cas9這一優(yōu)越的基因編輯工具，本研究以大腸桿菌W3310為背景菌株，建立大腸桿菌CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)，對其waaL和wecA基因進行敲除，從而為大腸桿菌工程菌的構建奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 菌株、質粒、培養(yǎng)基和抗生素E.coliTop10和E.coliW3110由本實驗室保存。pCas9-CR4(#62655)、pKDsgRNA-p15(#62656)購自Addgene，其中，pKDsgRNA-p15是溫敏型質粒；pKDsgRNA-Kan、pKDsgRNA-kan-DwaaL、pKDsgRNA-kan-DwecA由本研究構建，pSW3337-kan由本實驗室保存。培養(yǎng)基為LB培養(yǎng)基?？股兀喊逼S青霉素(ampicillin)終質量濃度100 mg/L，卡那霉素(kanamycin)終質量濃度50 mg/L，氯霉素(chloramphenicol)終質量濃度25 mg/L，強力霉素(doxycycline)終質量濃度1 mg/L，阿拉伯糖終濃度0.2%。

1.2 主要試劑胰蛋白胨、酵母提取物、氯化鈉和瓊脂粉購自英國 OXOID公司；氯霉素、氨芐青霉素、卡那霉素、Tet啟動子誘導劑強力霉素和阿拉伯糖購自生工生物工程(上海) 股份有限公司；Gibson assembly?master mix購自美國 NEB 公司；PrimerStar高保真酶購自大連寶生物公司；2×prime mix、DNA 產物純化試劑盒、質粒提取試劑盒及Marker Ⅲ購自天根生化科技(北京)有限公司。

1.3 PCR引物根據(jù)GenBank中公布的W3110菌株waaL和wecA的基因序列，用Snapgene軟件設計引物(表1)，并送往生工生物工程(上海) 股份有限公司合成。

1.4 pKDsgRNA-kan-DwaaL質粒的構建原質粒pKDsgRNA-p15是壯觀霉素抗性，為了后續(xù)的研究方便，將其換成卡那霉素抗性，并命名為pKDsgRNA-kan。通過網站http://crispor.tefor.net/crispor.py設計waaL基因的Spacer，然后將Spacer的20 bp序列加入引物gRNA-DwaaL-1F的5′端。以質粒pKDsgRNA-kan為模板，gRNA-DwaaL-1F和pair with F、pair with R和gRNA-DwaaL-2R為引物，使用PrimerStar高保真酶PCR擴增片段1和片段2。PCR產物經核酸凝膠電泳鑒定、回收后，用環(huán)形PCR法連接片段1和片段2[10]。獲得的產物電轉化至E.coliTop10感受態(tài)細胞中，小提質粒，用測序引物pKD_Seq5測序鑒定。將構建好的質粒命名為pKDsgRNA-kan-DwaaL。

1.5waaL基因同源修復供體DNA片段的擴增以E.coliW3110基因組為模板，DwaaL-1F和DwaaL-1R、DwaaL-2F和DwaaL-2R為引物，使用PrimerStar高保真酶PCR擴增片段3和片段4。PCR產物經核酸凝膠電泳鑒定、回收后，以DwaaL-1F和DwaaL-2R為引物，使用PrimerStar高保真酶將片段3和片段4用重疊延伸PCR法擴增同源修復供體DNA片段。

1.6 感受態(tài)細胞的制備及細菌的轉化按照《分子生物學實驗技術》中的方法制備E.coliW3110電轉化感受態(tài)細胞。將pCas9-CR4質粒轉化至該感受態(tài)細胞中，制備含有pCas9-CR4質粒的E.coliW3110電轉化感受態(tài)細胞。將質粒pKDsgRNA-kan-DwaaL轉化至感受態(tài)細胞中，最后制備同時含有pCas9-CR4和pKDsgRNA-kan-DwaaL質粒的E.coliW3110電轉化感受態(tài)細胞。本次制備感受態(tài)與前兩次不同，感受態(tài)細胞在30℃生長至D600=0.8，然后加入終濃度0.2%的阿拉伯糖，繼續(xù)培養(yǎng)30 min，以誘導重組酶基因的表達，最后再制備電轉化感受態(tài)細胞[11]。將200～1 000 ng供體DNA加入到感受態(tài)細胞中，電轉產物復蘇后，稀釋100倍，涂布于含卡那霉素、氯霉素以及強力霉素(1 mg/L)的LB平板上,30℃過夜培養(yǎng)，用引物DwaaL-1F和DwaaL-2R鑒定單克隆。

表1 引物序列

1.7 pKDsgRNA-kan-waaL質粒的消除將鑒定正確的突變株轉接至LB液體培養(yǎng)基中，置于37℃過夜培養(yǎng)以消除pKDsgRNA-kan-DwaaL溫敏質粒。圖1為敲除模式示意圖。

圖1 CRISPR/Cas9系統(tǒng)敲除基因示意圖[10]

1.8wecA基因的敲除為驗證該系統(tǒng)能夠有效地應用于大腸桿菌的基因敲除，用同樣的方法將大腸桿菌W3110的wecA基因進行敲除。

1.9 pCas9-CR4質粒的消除由于pCas9-CR4質粒是p15a的復制子，而pKDsgRNA-kan質粒上的Spacer是針對p15a的復制子，因此將pKDsgRNA-kan質粒轉入已敲除目的基因的宿主菌中，涂布于只含卡那霉素的LB瓊脂平板上，置于30℃培養(yǎng)。挑取轉化子檢測其對氯霉素的抗性，若對氯霉素敏感，則已消除pCas9-CR4質粒。隨后37℃過夜培養(yǎng)即可消除轉入的pKDsgRNA-kan溫敏質粒。

2 結果

2.1 pKDsgRNA-kan質粒的構建以pKDsgRNA-p15為模板，pKDsgRNA-2F和pKDsgRNA-2R為引物擴增pKDsgRNA載體DNA片段a；以pSW-3337-kan為模板，pKDsgRNA-1F-kan和pK-DsgRNA-1R為引物擴增卡那霉素基因 DNA片段b(圖2)。將擴增產物經核酸凝膠電泳鑒定、回收后，用環(huán)式PCR法連接2個DNA片段，連接產物轉化至E.coliTop10感受態(tài)細胞中。小提質粒，命名為pKDsgRNA-kan，并將其送至生工生物工程(上海) 股份有限公司測序，測序結果與預期序列一樣，可用于下一步試驗。

M.DNA Marker；1.DNA fragment a；2.DNA fragment b

2.2 pKDsgRNA-kan-waaL質粒的構建用PrimerStar高保真酶擴增片段1、片段2(圖3)，產物經核酸凝膠電泳鑒定、回收后，用Gibson assembly?master mix組裝，組裝產物轉化到E.coliTop10感受態(tài)細胞中，小提質粒，命名為pKDsgRNA-kan-waaL，并將其送至生工生物工程(上海) 股份有限公司測序，測序結果顯示Spacer與gRNA序列與預期序列一樣(圖4)，可用于下一步試驗。

M.DNA Marker；1.DNA fragment 1；2.DNA fragment 2

圖4 pKDsgRNA-kan-DwaaL質粒Spacer與gRNA測序圖

2.3waaL基因同源修復供體DNA的擴增以提取的W3110基因組為模板，DwaaL-1F和DwaaL-1R為引物擴增DNA片段3，DwaaL-2F和DwaaL-2R為引物擴增DNA片段4，核酸凝膠電泳結果與預期條帶大小均一致(圖5)?；厥丈舷峦幢?，通過重疊延伸PCR法將上下同源臂融合，核酸凝膠電泳結果與預期條帶大小均一致(圖6)。

2.4waaL基因的敲除通過電轉化法將供體DNA轉入含pCas9-CR4和pKDsgRNA-kan-DwaaL質粒的E.coliW3110，轉化產物涂布于含氯霉素、卡那霉素以及強力霉素的LB瓊脂平板。待平板上長出單克隆，用引物DwaaL-1F和DwaaL-2R對單克隆進行鑒定(圖7)。waaL基因沒有被敲除修復的菌，PCR顯示約2 000 bp的條帶，反之出現(xiàn)754 bp的條帶。測序結果與設計的同源臂序列一致，表明敲除后的waaL基因在人工設計的供體序列下發(fā)生了同源修復。

M.DNA Marker；1.DNA fragment 3；2.DNA fragment 4

M.DNA Marker；1.overlap DNA fragment

M.DNA Marker；1～6.PCR identification of waaL gene in W3110；7.Negative control；8.Positive control

2.5wecA基因的敲除為驗證該系統(tǒng)能夠確切地應用于大腸桿菌基因的敲除，對W3110的wecA基因進行敲除。構建pKDsgRNA-kan-DwecA質粒的DNA片段擴增結果如圖8所示，該質粒測序結果如圖9所示，同源修復供體DNA的擴增如圖10所示。轉化子鑒定如圖11所示，測序結果與設計的同源臂序列一致，表明敲除后的wecA基因在人工設計的供體序列下發(fā)生了同源修復。以上結果均表明，本研究構建的CRISPR/Cas9系統(tǒng)在人工同源修復下，可對大腸桿菌基因進行高效敲除。

M.DNA Marker；1.DNA fragment 1；2.DNA fragment 2

圖9 pKDsgRNA-kan-DwecA質粒測序圖

3 討論

雖然CRISPR/Cas系統(tǒng)最初是在細菌中發(fā)現(xiàn)的，但是大多數(shù)基于CRISPR/Cas系統(tǒng)的基因編輯則廣泛應用于真核生物中[1,11]。與真核生物不同，細菌的非同源末端連接(non-homologous end-joining，NHEJ)修復能力比較弱，且在許多情況下，若無外源重組酶的協(xié)助，其同源定向修復(homology-directed repair，HDR)也不一定有效，因此CRISPR/Cas9系統(tǒng)誘導的基因組DNA雙鏈斷裂對細菌而言往往是致死性的?；诩毦倪@一特點，研究者將CRISPR/Cas9系統(tǒng)與噬菌體重組酶介導的λ-Red重組系統(tǒng)相結合，使得供體DNA序列不需要克隆到載體上，可以直接轉化DNA片段的PCR產物，從而提升CRISPR/Cas9誘導的同源修復效率，實現(xiàn)對大腸桿菌基因組更高效的編輯[12]。

M.DNA Marker；1.wecA gene homology repair DNA fragment 1；2.wecA gene homology repair DNA fragment 2；3.wecA gene homology repair DNA fragment fusion

M.DNA Marker；1～14.PCR identification of wecA gene in W3110；15.Positive control；16.Negative control

與以往應用于原核生物中的CRISPR/Cas9系統(tǒng)相比，本研究所用的CRISPR/Cas9無痕缺失系統(tǒng)無需使用任何選擇性標記即可進行單步基因組改變，該系統(tǒng)含有靶向宿主細胞基因組的非溫敏型pCas9-CR4和溫敏型pKDsgRNA-kan兩個質粒[11]。當運用該系統(tǒng)成功缺失一個基因后，若需繼續(xù)缺失下一個基因，則可快速高效地消除溫敏型pKDsgRNA-kan質粒；此時，由于宿主菌中仍含有非溫敏型pCas9-CR4質粒，因此可直接用于下一個基因的缺失，無需再次轉化pCas9-CR4質粒，這大大提高了試驗效率。pCas9-CR4和pKDsgRNA-kan質粒都含有Tet調控表達系統(tǒng)，當無誘導藥物(如強力霉素)存在時，TetR阻遏蛋白會與TetO操縱子結合，從而阻斷Cas9蛋白和sgRNA的表達；當有誘導藥物存在時，TetR阻遏蛋白的構象會發(fā)生改變，并從TetO操縱子上脫離下來，使得Cas9蛋白和sgRNA可以同時順利表達，繼而發(fā)揮CRISPR/Cas9系統(tǒng)的剪切基因組作用。為了更加嚴謹?shù)卣{控表達Cas9蛋白，在Cas9蛋白相應序列的C末端添加了SsrA標簽，SsrA標簽可被ClpP蛋白酶識別；當Cas9蛋白“漏”表達時，由于SsrA標簽的存在，ClpP蛋白酶可快速高效地降解Cas9蛋白，這使Cas9蛋白的調控表達更加嚴謹。該質粒還含有由阿拉伯糖誘導型啟動子araCPBAD調控表達的Red 同源重組系統(tǒng)，以提高大腸桿菌同源重組效率。該系統(tǒng)與在真核生物中使用的CRISPR/Cas9系統(tǒng)情況不同，在大腸桿菌中，CRISPR/Cas9系統(tǒng)的主要作用不是用來“編輯”，而是用來篩選(負篩)；用來去除那些沒有發(fā)生基于修復片段(供體DNA)同源重組的菌株，留下那些經同源重組修復后的突變株，其強大的負篩系統(tǒng)確保了較高的突變效率。JIANG等[13]也將CRISPR/Cas9系統(tǒng)與λ-Red 重組結合，與本試驗應用的CRISPR/Cas9系統(tǒng)相比，本研究的2個質粒包含所需的所有組件，不需要額外的修飾，并且沒有宿主特異性。除此之外，本研究所應用的方法在做單突變時，需要5 d，包括gRNA靶向所需的所有克隆步驟，這與其他基因敲除方法所需時間差不多。但是，在做多個突變時，由于宿主菌已經包含pCas9-CR4質粒，后續(xù)的試驗可在短短3 d之內完成，這大大提高了試驗效率。

綜上，本研究應用 CRISPR/Cas9 系統(tǒng)，在大腸桿菌W3110菌株中建立起利用該系統(tǒng)進行基因敲除的試驗平臺，并獲得了高效率的突變株。該方法高效簡單，經濟快捷，為構建大腸桿菌基因工程菌奠定了基礎。