蘇鴻雨，黃程程，劉耀川，陳夢涵，朱曉明，劉利鵬，張德顯，劉明春

(沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué) 畜牧獸醫(yī)學(xué)院， 遼寧 沈陽 110866)

化膿隱秘桿菌(Trueperellapyogenes，T.pyogenes)是一種條件性致病菌，可黏附于動物的乳房、泌尿生殖道、呼吸道等部位，引起豬、牛、羊等動物的乳房炎、子宮內(nèi)膜炎等化膿性感染，給養(yǎng)殖業(yè)帶來較大的經(jīng)濟損失[1-3]。由于缺乏有效的疫苗，到目前為止，T.pyogenes引起的感染主要依靠使用抗菌藥物來進行治療。但隨著抗菌藥物的廣泛使用，有關(guān)T.pyogenes耐藥性的報道越來越多，尤其是對臨床常用的大環(huán)內(nèi)酯類和四環(huán)素類抗生素的耐藥問題，已引起人們的關(guān)注[4-6]。存在于細菌細胞膜上的外排蛋白的外排作用，可以使藥物在細菌細胞內(nèi)的聚集減少，從而使細菌逃避藥物的抑殺作用，該機制被普遍認為是細菌產(chǎn)生耐藥性的重要方式之一。外排基因mefA可介導(dǎo)革蘭陽性菌如金黃色葡萄球菌、鏈球菌對大環(huán)內(nèi)酯類藥物的耐藥性。在對大環(huán)丙酯類抗生素耐藥的肺炎鏈球菌中，外排基因mefA的檢出率為20.5%[7]。而有關(guān)T.pyogenes耐藥機制的研究報道較少。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，對大環(huán)丙酯類抗生素產(chǎn)生耐藥的T.pyogenes分離株中，mefA基因的檢出率為18.2%[8]。MefA蛋白的外排作用可能是介導(dǎo)該菌對大環(huán)內(nèi)酯類抗生素耐藥的主要機制之一。外排泵抑制劑可以通過抑制外排基因的表達來逆轉(zhuǎn)/消減耐藥菌株的耐藥性，有望成為抗耐藥菌新藥研發(fā)的主要策略[9]。

利血平是一種公認的外排泵抑制劑，可逆轉(zhuǎn)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌等細菌對氟喹諾酮類、四環(huán)素類等多種抗生素的耐藥性[10-12]。但尚未見有關(guān)利血平對T.pyogenes外排蛋白外排作用影響的相關(guān)報道。本試驗通過檢測利血平作用后T.pyogenes對大環(huán)內(nèi)酯類藥物的耐藥表型、外排基因mRNA表達水平及其編碼蛋白表達水平的變化情況，分析T.pyogenes對大環(huán)內(nèi)酯類藥物耐藥的主動外排機制，以期為深入研究T.pyogenes的耐藥機制及尋找抗耐藥菌藥物作用的新靶標奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗菌株與藥物2株攜帶mefA(17，20號)基因的T.pyogenes，由本實驗室分離鑒定并保存；利血平標準品購自成都曼斯特生物科技有限責(zé)任公司；乙酰螺旋霉素標準品購自大連美侖生物有限責(zé)任公司；紅霉素、羅紅霉素、替米考星、阿奇霉素及泰樂菌素標準品購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；2×Easy Taq PCR SuperMix、RNA Disslution、TransScrip ALL-in-One First-Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR均購自大連寶生物工程有限公司；一抗(自制兔抗T.pyogenesMefA蛋白多克隆抗體，效價為1∶64 000)；二抗(HRP標記的山羊抗兔IgG多克隆抗體)北京百奧萊博科技有限公司；熒光定量PCR儀購自ABI公司。

1.2 利血平逆轉(zhuǎn)T.pyogenes對大環(huán)內(nèi)酯類抗生素耐藥性試驗采用微量肉湯稀釋法分別測定紅霉素(erythromycin)、羅紅霉素(roxithromycinid)、乙酰螺旋霉素(acetylspiramycin)、泰樂菌素(tylosin)、阿奇霉素(azithromycin)和替米考星(tilmicosin)6種大環(huán)內(nèi)酯類抗生素及外排泵抑制劑利血平對2株攜帶攜帶mefA基因的T.pyogenes的最小抑菌濃度(MIC)，每種藥物進行3個平行，同時以ATCC 19411即T.pyogenes標準菌株為質(zhì)控菌[13]。

根據(jù)利血平對T.pyogenesMIC的測定結(jié)果，將利血平稀釋成對應(yīng)菌株的1/2,1/4,1/8,1/16 MIC作為工作濃度，測定大環(huán)內(nèi)酯類抗生素對亞抑菌濃度利血平作用后的各菌株的MIC值，分析利血平作用前后T.pyogenes對抗生素耐藥性的變化情況，并確定各菌株恢復(fù)對抗生素敏感性的最佳作用條件，用于后續(xù)試驗。

1.3 熒光定量PCR引物的設(shè)計與合成選擇GenBank中收錄的T.pyogenes16S rRNA作為實時熒光定量PCR試驗的內(nèi)參基因(KY694370.1)。根據(jù)mefA基因序列的測序結(jié)果，分別設(shè)計mefA和16S rRNA的熒光定量PCR引物，將設(shè)計完成的引物序列提交到生工生物官方網(wǎng)站上進行合成[14]。引物信息詳見1。

1.4 利血平作用前后T.pyogenes總RNA的提取分別取藥物作用前和1/2 MIC利血平作用36 h的T.pyogenes菌液，按照說明書采用Trizol法提取T.pyogenes的總RNA。利用分光光度計檢測總RNA濃度和純度，使用瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性。最后利用RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA[15]，于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 mefA和16S rRNA基因引物序列

1.5 利血平作用前后菌株的mefAmRNA表達量的檢測以利血平作用前后菌株的cDNA為模板，以熒光定量PCR的引物為特異性引物，采用實時熒光定量PCR方法進行擴增，建立標準曲線。以標準曲線判斷熒光定量PCR引物的擴增效率，當目的基因與內(nèi)參基因的擴增效率幾乎一致，而且都接近于100%時，計算目的基因mRNA的相對轉(zhuǎn)錄水平[16]。

1.6 利血平作用前后菌株的MefA蛋白表達水平的檢測分別取利血平作用前后的T.pyogenes菌液，采用溶菌酶破壁、超聲處理的方法提取其總蛋白；用BCA法測定蛋白質(zhì)的含量，加入Loading Buffer，98℃變性10 min，進行SDS-PAGE；將蛋白濕轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，脫脂奶粉4℃封閉。BSA 4℃一抗過夜孵育，37℃二抗孵育1.5 h，最后曝光檢測[17]。

1.7 數(shù)據(jù)處理與分析按文獻[18]的方法，基因轉(zhuǎn)錄水平相對表達倍數(shù)計算結(jié)果為2-△△Ct。利用Azure Biosystems軟件對蛋白灰度值進行分析。

使用SPSS 17.0軟件對利血平作用前后目的基因mefA的mRNA表達量及MefA蛋白表達量的差異顯著性進行分析。使用GraphPad Prism 5.0對處理后的數(shù)據(jù)進行作圖分析。

2 結(jié)果

2.1 利血平逆轉(zhuǎn)T.pyogenes耐藥性的檢測結(jié)果見表2。利血平對17和20號T.pyogenes的MIC值均為32 mg/L。亞抑菌濃度利血平作用T.pyogenes后，篩選出利血平逆轉(zhuǎn)T.pyogenes耐藥性的最佳條件為1/2 MIC作用36 h。依據(jù)各藥對T.pyogenesATCC19411的MIC值，判定T.pyogenes對羅紅霉素、乙酰螺旋霉素、替米考星、泰樂菌素、阿奇霉素和紅霉素的耐藥臨界點分別為2,1,8,2,4,1 mg/L。據(jù)此判斷，利血平作用后的17號和20號菌株對替米考星和阿奇霉素均由耐藥轉(zhuǎn)為敏感。利血平作用后6種大環(huán)內(nèi)酯類抗生素對攜帶mefA基因的17號T.pyogenes的MIC值下降到利血平作用前的 1/4～1/32，而20號菌株的MIC值下降到利血平作用前的1/2～1/8。

表2 1/2 MIC利血平作用前后T.pyogenes對大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的MIC值 mg/L

2.2 利血平作用后T.pyogenes外排基因mefAmRNA表達水平的變化利血平作用后T.pyogenes外排基因mefAmRNA相對表達量變化情況如圖1所示。設(shè)利血平處理前T.pyogenesmefA基因mRNA相對表達量為1，1/2 MIC利血平作用耐大環(huán)內(nèi)酯類藥物分離株36 h后， 2株分離株mefA基因mRNA表達水平(利血平作用前是作用后的5.18，17.54倍)均極顯著降低(P<0.01)，而溶劑對T.pyogenesmefA基因mRNA的相對表達水平無顯著性影響。

2.3 利血平作用后T.pyogenes外排蛋白MefA表達水平的變化采用Western blot技術(shù)檢測外排蛋白MefA的表達量，設(shè)利血平作用前T.pyogenes的MefA表達量為1，利血平作用前后T.pyogenesMefA的表達量及其變化情況如圖2，3所示。1/2 MIC利血平作用耐藥菌株36 h后，外排蛋白MefA較藥物作用前也分別顯著降低(利血平作用前是作用后的1.08，1.70倍)。

圖1 利血平作用前后T.pyogenes mefA mRNA的轉(zhuǎn)錄水平(**P<0.01，下同)

1,2.利血平作用前17,20號T.pyogenes分離株；3,4.利血平作用后17,20號T.pyogenes分離株

圖3 利血平對T.pyogenes外排蛋白MefA表達量的影響

3 討論

T.pyogenes可引起牛、羊、豬等多種經(jīng)濟類動物的化膿性感染，給養(yǎng)殖業(yè)帶來了較大的經(jīng)濟損失。目前臨床上治療T.pyogenes感染性疾病的藥物主要有大環(huán)內(nèi)酯類、頭孢菌素類和四環(huán)素類等抗生素[19]。但是由于大環(huán)內(nèi)酯類抗生素在畜牧行業(yè)的應(yīng)用極其廣泛，導(dǎo)致T.pyogenes對該類抗生素產(chǎn)生了嚴重的耐藥性，因此開展與耐藥機制相關(guān)的研究、研發(fā)新藥已經(jīng)成為當前研究的熱點[20]。據(jù)報道，介導(dǎo)T.pyogenes對大環(huán)內(nèi)酯類藥物耐藥的外排基因有msr和mef等，由它們編碼的膜蛋白能夠?qū)⑦M入菌體內(nèi)的大環(huán)內(nèi)酯類藥物外排，從而使抗生素的藥效降低甚至失效[21]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，耐大環(huán)內(nèi)酯類藥物的T.pyogenes分離株中外排基因mefA的檢出率為18.2%，且攜帶mefA基因的菌株對大環(huán)內(nèi)酯類抗生素存在多重藥耐現(xiàn)象[22]。

外排泵抑制劑是一類具有抑制細菌外排泵作用的物質(zhì)，可通過抑制外排基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯來逆轉(zhuǎn)或消減細菌的耐藥性。據(jù)相關(guān)文獻報道，外排泵抑制劑氫氯苯腙(CCCP)可以抑制鮑曼不動桿菌(Acinetobacterbaumannii)外排基因adeB的表達；奧美拉唑(omeprazole)可以抑制金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)NorA的表達量[22-23]。與耐藥相關(guān)的外排泵Bmr的氨基酸序列中纈氨酸和苯丙氨酸能夠與公認的外排泵抑制劑利血平結(jié)合，從而抑制枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)向外泵出藥物；還可以抑制金黃色葡萄球菌耐藥泵NorA的活性，提高耐諾氟沙星菌株對其的敏感性[24-26]。

到目前為止，有關(guān)外排泵抑制劑利血平對細菌耐藥基因及耐藥蛋白的影響鮮有報道。本試驗主要從利血平作用前后2株攜帶mefA基因的T.pyogenes的耐藥性變化情況、外排基因及其編碼蛋白表達水平的變化情況，探究利血平對T.pyogenes外排基因mefA的影響。研究發(fā)現(xiàn)，1/2MIC 利血平作用菌體 36 h 后，T.pyogenes對大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的耐藥性明顯降低，甚至逆轉(zhuǎn)了菌株對替米考星和阿奇霉素的耐藥性；利血平亦顯著抑制了外排基因mefA的mRNA轉(zhuǎn)錄水平及其編碼蛋白MefA的表達水平。提示利血平可能是通過影響外排蛋白MefA的表達減少菌體對大環(huán)內(nèi)酯類藥物的外排作用，從而消減了T.pyogenes對大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的耐藥性。但由于攜帶mefA基因的菌株數(shù)量較少，尚需進一步驗證。