莫家金 聶 璐

1.廣東省羅定市人民醫(yī)院檢驗科，廣東羅定 527300；2.廣東省佛山市第一人民醫(yī)院，廣東佛山 528010

近年來隨著抗生素的廣泛使用，細(xì)菌對抗生素的耐藥性也不斷提高[1]。耐碳青霉烯G-桿菌（CRGNB）是一種超級細(xì)菌，目前臨床針對CRGNB的分離效率提升，但是這種細(xì)菌對碳青霉烯類廣譜抗生素有著非常強的耐藥性[2]。這種細(xì)菌耐藥性不斷上升以及快速傳播成為當(dāng)前臨床預(yù)防和控制CRGNB感染的重要研究課題[3]。本文選取羅定地區(qū)作為研究對象，分析臨床CRGNB常見碳青霉烯酶基因檢測及流行病學(xué)，為CRGNB感染預(yù)防提供科學(xué)臨床參考依據(jù)，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 菌株材料的收集

選取羅定地區(qū)作為研究對象，收集羅定地區(qū)2019年5月至2020年6月臨床CRGNB共計150株。主要包括大腸埃希菌、銅綠假單胞菌等6種細(xì)菌。所有菌株采用法國梅里埃生物科技有限公司生產(chǎn)的微生物檢測儀Vitek-2（生產(chǎn)批號為VK2C7499）檢測，將分純后的菌株儲存在脫脂牛奶管中，并放置在零下20 ℃的環(huán)境中保存。

1.2 實驗試劑和儀器

（1）水解酪蛋白培養(yǎng)基干粉：美國BD公司。（2）甘油凍：difco公司。（3）胰蛋白胨：difco公司。（4）酵母提取物：美國BD公司。（5）NaCl（AR）：法國 Bio-Meriuex公司。（6）DNA Marker、PCR 反應(yīng)鏈以及Taq酶：法國Bio-Meriuex公司。（7）PCR引物：由上海生工生物工程公司和invitrogen公司合成。（8）主要儀器：PCR在PTC-200型PCR（MJ Reserch）儀上進行。（9）ABI PRISM自動測序儀：美國應(yīng)用生物系統(tǒng)（ABI）公司，批號3730XL。（10）微生物檢測儀Vitek-2：法國梅里埃生物科技有限公司，生產(chǎn)批號為VK2C7499。

1.3 實驗方法

1.3.1 改良Hodge實驗 先采用無菌生理鹽水將大腸埃希菌懸液調(diào)至0.5 mcf，按照1∶10稀釋，然后將菌液接種在瓊脂平板上干燥5～10 min，采用10 μg厄他培南紙片，挑取3～5種待測菌種接種，如果被測菌株與大腸埃希菌抑菌交匯處出現(xiàn)大腸埃希菌生長增強，即產(chǎn)生碳青霉烯酶[4]。

1.3.2 DNA提取 采用煮沸法提取細(xì)菌組DNA，將測試菌株接種在中國藍(lán)平板上，在37 ℃環(huán)境的培養(yǎng)箱下放置過夜，次日測試單個菌落在中國藍(lán)平板分純，第3天跳轉(zhuǎn)多個菌落入盛裝300 μl的雙蒸水EP管中，加熱煮沸10 min后，在1.3萬rpm離心機下離心3 min，去上清液放在EP管中并置于-20 ℃的環(huán)境中保存[5]。

1.3.3 利用聚合酶鏈反應(yīng)（PCR檢測法） 首先對菌株進行碳青霉烯酶基因和其他β-內(nèi)酰胺酶基因PCR擴增，擴增的基因包括Ambler A組酶基因，主要包括 blakpc、Blanmc、blasme、blaIMI、blacms；Ambler B 組 酶 基 因 blaIMP、BlaSPM、blaSIM、blaGIM、blaIMI。擴增的其他β-內(nèi)酰胺酶基因包括AmPC基因，陽性和陰性質(zhì)控標(biāo)本跟隨每批PCR實驗。

1.3.4 PCR產(chǎn)物電泳 37 ℃檢測CRGNB的全基因組DNA，PCR產(chǎn)物5 μl上樣，1%瓊脂糖電泳40 min，電壓設(shè)置 110 V，0.5 μg/ml EB 染色，在紫外線光照等下看掃描成像。

1.3.5 測序 采用QIAquick離心柱[ABI PRISM自動測序儀[美國應(yīng)用生物系統(tǒng)（ABI）公司，批號為3730XL]純化PCR產(chǎn)品，對每個PCR產(chǎn)物均用正反向引物進行雙向測序，測序采用雙脫氧鏈末端終止法，在ABI PRISM（ABI公司，生產(chǎn)批號為3730XL）自動測序儀上進行，測序試劑為BigDye terminatorV3.1，對于長片段的測序可以采用步移法設(shè)計中間引物，直到測通為止。測序結(jié)果分析在Genbank數(shù)據(jù)中進行[6]。

2 結(jié)果

2.1 藥敏性結(jié)果分析

本實驗總計有10株對ETP耐藥，耐藥率為6.7%；8株對IMP耐藥，耐藥率為5.3%；6株對MEM耐藥，耐藥率為4.0%。見表1。

表1 碳青霉烯類抗生素藥敏性結(jié)果分析

2.2 碳青霉烯酶的表型測試情況

根據(jù)碳青霉烯類抗生素藥敏性結(jié)果，本實驗10株在EDTA協(xié)同實驗中顯示陽性結(jié)果，EDTA協(xié)同實驗陽性率6.7%，具體菌種分布見表2。

表2 碳青霉烯酶的表型測試情況

2.3 腸桿菌基因間一致重復(fù)序列-聚合酶鏈（ERICPCR）同源性結(jié)果

肺炎克雷伯菌產(chǎn)IMP類型的金屬酶有12株，其中有4中克隆類型，KP8-KP17類型有8株是相同的克隆類型金屬酶，KP6與KP7二者屬于相同的克隆類型金屬酶，KP15和KP18兩者屬于相同克隆類型金屬酶，但是KP5是單獨的克隆類型金屬酶，KP5的產(chǎn)物經(jīng)過電泳圖聚類后顯示如圖1所示。

肺炎克雷伯菌產(chǎn)KPC類型的金屬酶有4株，再擴增后得到的產(chǎn)物經(jīng)過電泳凝膠成像后，每條帶的數(shù)量與規(guī)格相同，均屬于相同的克隆類型，且產(chǎn)物經(jīng)過電泳圖聚類后顯示見圖2。

陰溝腸桿菌產(chǎn)IMP類型的金屬酶有3株，其中E2和E3屬于相同克隆類型菌株，E1是其他類型的克隆菌株，其產(chǎn)物經(jīng)過電泳圖聚類后顯示見圖3。

圖1 肺炎克雷伯菌產(chǎn)IMP類型的金屬酶克隆類型示意圖

圖2 肺炎克雷伯菌產(chǎn)KPC類型的金屬酶克隆類型示意圖

圖3 陰溝腸桿菌產(chǎn)IMP類型的金屬酶克隆類型示意圖

3 討論

目前國內(nèi)外在臨床細(xì)菌感染方面以G-桿菌為主要菌種[7]。根據(jù)2005—2018年我國在CHINRT細(xì)菌耐藥性監(jiān)測數(shù)據(jù)報告中指出，中國耐藥指標(biāo)呈現(xiàn)明顯下降趨勢[8]，住院患者對于抗生素藥物的使用率的13個指標(biāo)中有11個呈現(xiàn)平穩(wěn)或下降趨勢[9]。報告指出在抗菌藥物的使用中，2017年碳青霉烯類抗生素藥物使用量比2016年呈現(xiàn)上升趨勢[10]，但是值得關(guān)注的是碳青霉烯類藥物的耐藥性也呈現(xiàn)上升趨勢[11]，且不同地區(qū)間碳青霉烯類藥物有明顯差異[12]，應(yīng)該重點關(guān)注不同地區(qū)和不同人群對碳青霉烯類藥物的耐藥性問題[13]。在報告中列舉的所有細(xì)菌數(shù)量和種類數(shù)據(jù)中心，G-桿菌占比最高，比例＞70%。此外有文獻數(shù)據(jù)研究指出，大腸埃希菌和克雷伯菌的占比最大，分別位居第一和第二，比例是細(xì)菌總數(shù)的8%～20%[14]。而碳青霉烯類抗生素對應(yīng)的細(xì)菌譜較廣，針對細(xì)菌的抑制殺滅活性較強，尤其是對β-內(nèi)酰胺酶的抗菌穩(wěn)定性有較明顯的優(yōu)勢，對頭孢菌素能夠產(chǎn)生抗藥細(xì)菌類型較廣，因此能夠發(fā)揮抵抗治療的作用[15]。近年來，臨床研究著重分析了抗生素使用愈發(fā)頻繁的問題，尤其是碳青霉烯類抗生素在臨床醫(yī)學(xué)中運用的次數(shù)越來越多，其中G-桿菌在所有細(xì)菌數(shù)據(jù)和類型中占據(jù)比重最多，其次是大腸埃希菌、克雷伯菌、銅綠假單胞菌的CRGNB菌屬的比例也呈現(xiàn)逐年上漲的趨勢。

本研究選取羅定地區(qū)作為研究對象，分析臨床CRGNB常見碳青霉烯酶基因檢測及流行病學(xué)，為CRGNB感染預(yù)防提供科學(xué)臨床參考依據(jù)。本實驗對ETP耐藥率為6.7%，對IMP耐藥率為5.3%，對MEM耐藥率為4.0%。從碳青霉烯類抗生素藥敏性結(jié)果對比來看，本實驗總計有10株對ETP耐藥，其中10株在EDTA協(xié)同實驗中顯示陽性結(jié)果，EDTA協(xié)同實驗陽性率6.7%。肺炎克雷伯菌產(chǎn)IMP類型的金屬酶有12株，肺炎克雷伯菌產(chǎn)KPC類型的金屬酶有4株，陰溝腸桿菌產(chǎn)IMP類型的金屬酶有3株，三種菌種均出現(xiàn)了多種克隆型。由此可見大部分均為對碳青霉烯類抗生素、藥物產(chǎn)生耐藥性最為明顯。

綜上所述，CRGNB常見的常見碳青霉烯酶基因以IMP類型為主，KPC類型排名第二，沒有發(fā)現(xiàn)其他的新基因亞型。在碳青霉烯菌株產(chǎn)生過程中會出現(xiàn)多種克隆細(xì)菌類型，這個問題需要醫(yī)院著重關(guān)注，并開展有效的掌控耐藥菌株的克隆式傳播。