張?zhí)旌辏罹磥?，張振?/p>

1.國科卓越（北京）醫(yī)藥科技研究有限公司，北京 100176；2.北京蘇雅醫(yī)藥科技有限責(zé)任公司，北京 102629

及時有效的止血是創(chuàng)傷后傷者或手術(shù)中患者預(yù)后甚至存活的關(guān)鍵因素［1-2］。作為止血手段之一，針對不同的應(yīng)用場景（體表出血或內(nèi)臟出血，輕微滲血，少量積血，中度流血）［3］，各種類型的可吸收止血材料已經(jīng)在全球廣泛使用。表1 總結(jié)了多種分類依據(jù)［4-5］，其中分子類型和制備工藝，直接關(guān)系到產(chǎn)品的理化性質(zhì)、體內(nèi)降解規(guī)律、療效、毒性反應(yīng)。

表1 已上市可吸收止血材料的分類

可吸收止血材料臨床使用中潛在的不良反應(yīng)主要分兩類：（1）過敏反應(yīng)，局部化學(xué)異物或感染引起的或炎癥反應(yīng)和肉芽腫，這與止血材料的降解速率和物理機械作用引發(fā)有關(guān)；（2）使用后，止血材料降解吸收過程中產(chǎn)生的毒性物質(zhì)的機體暴露。其中1 類不良反應(yīng)較為常見［6］，需要規(guī)范使用操作來解決；2 類不良反應(yīng)尚未見報道，但隨著新型止血材料的研發(fā)，不能排除這種風(fēng)險。為排除2 類風(fēng)險，新產(chǎn)品研發(fā)過程中，以體內(nèi)的處置動力學(xué)研究為基礎(chǔ)的，科學(xué)嚴(yán)格的安全性評價工作非常重要。

外源物的體內(nèi)動力學(xué)是藥理毒理學(xué)的基礎(chǔ)。詳盡闡明外源物在體內(nèi)的處置過程是解釋藥效和毒性的物質(zhì)基礎(chǔ)，也是確保應(yīng)用于人體后，病人免于危險物質(zhì)或危險水平暴露的關(guān)鍵。作為外源物質(zhì)（包括食物、藥物、毒物、化妝品等）的一種，可吸收止血材料的體內(nèi)代謝（metabolism）和處置（disposal）的動力學(xué)研究也遵循共同的研究策略。目前藥物代謝動力學(xué)研究比較充分，具備嚴(yán)謹(jǐn)?shù)睦碚摶A(chǔ)、豐富的文獻(xiàn)資料，因此本文重點借助藥物代謝動力學(xué)的理論和成果，結(jié)合可吸收止血材料自身的特點，討論該類產(chǎn)品體內(nèi)動力學(xué)研究的方法和策略。

與藥代動力學(xué)相比，可吸收止血材料的體內(nèi)代謝和處置的動力學(xué)具有自己獨特的特點。不同于經(jīng)典的給藥途徑，可吸收止血材料直接應(yīng)用于組織表面（創(chuàng)面），凝固并被包裹。典型的藥物體內(nèi)動力學(xué)過程包括了吸收、分別、代謝、排泄（absorption，distribution，metabolism，excretion，ADME），除個別情況外，例如某些苷類中藥在口服后于胃腸道分解為苷原的過程，藥物在給藥部位的代謝過程幾乎可以忽略。相比之下，止血材料在吸收前會在體液的作用下發(fā)生降解代謝，主要以降解產(chǎn)物的形式吸收。且這種吸收前的降解代謝往往受到反應(yīng)接觸面積的限制，反應(yīng)速率遠(yuǎn)慢于胃腸道中，并可能是這類物質(zhì)使用后體內(nèi)動力學(xué)過程的限速步驟。這種特殊的體內(nèi)動力學(xué)表現(xiàn)，也是本文開頭所提出的這類產(chǎn)品的所表現(xiàn)出的多數(shù)1 類毒副作用的原因。

除了上述的給藥部位先代謝后吸收的特點，可吸收止血材料的另一個體內(nèi)動力學(xué)的獨特特點是，吸收入血的降解產(chǎn)物為不同分子量的一組低聚物，且多為內(nèi)源性成分。由于降解吸收限速的原因，這些內(nèi)源性降解產(chǎn)物組的非給藥部位暴露很低，持續(xù)時間長。這些特點給該類材料的體內(nèi)動力學(xué)研究帶來極大的挑戰(zhàn)，目前主流的解決方案是放射性標(biāo)記示蹤技術(shù)結(jié)合液相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（HPLC-MS）分析手段。本研究總結(jié)了該方法的原理、優(yōu)劣勢、試驗流程和相關(guān)重要的影響因素，以期為該類產(chǎn)品體內(nèi)動力學(xué)研究方案設(shè)計提供支持和選項。

另外，不同類型的可吸收止血材料的研發(fā)過程中經(jīng)常面臨體內(nèi)動力學(xué)研究策略的問題。例如，有些產(chǎn)品的理論代謝產(chǎn)物是內(nèi)源性物質(zhì)；有些是天然物質(zhì)進(jìn)行了部分修飾；有些則完全是非天然成分。這些產(chǎn)品在體外研究的基礎(chǔ)上，是否有必要進(jìn)行體內(nèi)動力學(xué)研究，是否需要采用放射性標(biāo)記，研究到什么程度，才能滿足注冊申報的證據(jù)標(biāo)準(zhǔn)。關(guān)于這些問題，我們提出的解決方案是，在充分理論和體外實驗評估的基礎(chǔ)上，將可吸收止血材料按降解產(chǎn)物風(fēng)險等級分為低、中、高三個水平，根據(jù)不同的風(fēng)險等級采用相應(yīng)的體內(nèi)代謝動力學(xué)研究策略和放射性標(biāo)記示蹤技術(shù)結(jié)合HPLC-MS 分析方案。

最后，按照三級風(fēng)險分類，分別總結(jié)了可吸收止血材料在體外降解規(guī)律和體內(nèi)代謝動力學(xué)的進(jìn)展，為此類產(chǎn)品的降解代謝評價策略和放射性標(biāo)記聯(lián)合HPLC-MS 技術(shù)應(yīng)用提供理論和實踐的支持。

1 放射性標(biāo)記示蹤技術(shù)結(jié)合HPLC-MS 分析

1.1 放射性標(biāo)記示蹤與HPLC-MS 的互補性

外源物的體內(nèi)動力學(xué)研究關(guān)注的是物質(zhì)的定位（location）、定量（quantitation）、定性（qualification），因此這門學(xué)科的發(fā)展強烈依賴于檢測手段的進(jìn)步。近20 年來，隨著檢測手段的更新進(jìn)步，尤其是HPLC-MS 聯(lián)用技術(shù)的成熟（在專屬性、定性鑒別和定量檢測靈敏度的優(yōu)勢），極大促進(jìn)了外源物的體內(nèi)動力學(xué)的學(xué)科發(fā)展。但由于化合物電離的影響因素復(fù)雜，導(dǎo)致HPLC-MS 定量依賴于標(biāo)準(zhǔn)品，并無法區(qū)分所測定物質(zhì)的外源性或內(nèi)源性。一旦受試物質(zhì)體內(nèi)代謝廣泛，面對眾多不同的代謝物，該技術(shù)將無法實現(xiàn)對外源物代謝特征的全面考察，包括總體代謝途徑和各途徑對總消除的相對貢獻(xiàn)。

與之互補的是放射性同位素標(biāo)記示蹤技術(shù)，已經(jīng)用于外源物體內(nèi)動力學(xué)研究60 年了，目前仍是一種全面的同時也是高靈敏度的體內(nèi)代謝處置動力學(xué)研究方法。雖然現(xiàn)有的分析技術(shù)突飛猛進(jìn)，但僅有放射性示蹤技術(shù)能夠直接、明了地揭示每一種代謝物占總外源物相關(guān)物質(zhì)暴露的百分比，因此該方法是創(chuàng)新藥物代謝研究不可或缺的手段。長期以來，放射性同位素標(biāo)記示蹤法被公認(rèn)為獲得全面代謝相關(guān)信息的最有效手段（金標(biāo)準(zhǔn)）（沒有之一）。美國FDA 審評的新藥中85%以上在藥物代謝和安全性評價中使用了放射性標(biāo)記示蹤技術(shù)。

放射性同位素示蹤法的優(yōu)點［7］：（1）可去除干擾，區(qū)分內(nèi)源性和外源性物質(zhì)，發(fā)揮示蹤作用。（2）標(biāo)記物與非標(biāo)記物的化學(xué)結(jié)構(gòu)完全一致，物理、化學(xué)性質(zhì)及生物活性非常相近。（3）生物細(xì)胞不能區(qū)分同一元素的各種同位素，而是一視同仁地對待。（4）靈敏度高，例如，可吸收止血材料降解吸收緩慢，導(dǎo)致體內(nèi)非給藥部位暴露極低，要求檢測方法必須具有極高的靈敏度。（5）定量方法無需標(biāo)準(zhǔn)品，簡便直接，對于某個特定的放射性原子，其放射性（在單位時間內(nèi)發(fā)生衰變的概率、輻射形式）與鄰近原子的情況無關(guān)，也與原子的化學(xué)狀態(tài)及物理條件無關(guān)（因為它們只影響外層電子）。（6）適用于代謝途徑復(fù)雜廣泛或代謝產(chǎn)物標(biāo)準(zhǔn)品不易獲得的外源物體內(nèi)動力學(xué)研究。

放射性同位素示蹤法的缺點：（1）產(chǎn)生放射性污染；（2）考慮到輻射安全的因素，需具備研究資質(zhì)；（3）無法進(jìn)行物質(zhì)定性，即無法鑒定標(biāo)記分子的形式?？梢?，放射性同位素示蹤法與HPLC-MS 法具有高度的互補性。二者聯(lián)合研究是目前主流的方法，具體研究策略見圖1。

圖1 放射性同位素示蹤技術(shù)聯(lián)合HPLC-MS研究策略

1.2 放射性標(biāo)記示蹤技術(shù)流程

1.2.1 放射性標(biāo)記物的制備 目前常用于外源物體內(nèi)動力學(xué)研究的放射性核素有14C、3H、32P、33P、35S、125I 和131I 等。核素的選擇和標(biāo)記合成試驗設(shè)計原則：（1）14C 優(yōu)于3H，14C 標(biāo)記在分子骨架中，3H 位于分子骨架的側(cè)枝，體內(nèi)存在1H-3H 交換的風(fēng)險，從而影響示蹤結(jié)果。（2）分子內(nèi)標(biāo)優(yōu)于分子外標(biāo)，分子內(nèi)標(biāo)（如3H 或14C）的標(biāo)記物與非標(biāo)記物的化學(xué)結(jié)構(gòu)完全一致，物質(zhì)在生物機體內(nèi)的化學(xué)變化和生物學(xué)過程相同，但對于大于10 KDa 的大分子采用125I 的分子外贅合標(biāo)記，也是可以接受的。同時，實驗中需要對脫標(biāo)記進(jìn)行監(jiān)測，一旦脫標(biāo)記占比過高，將影響數(shù)據(jù)質(zhì)量。（3）定位標(biāo)記優(yōu)于非定位標(biāo)記，定位標(biāo)記的實驗結(jié)果明確。以1H-3H 交換法為基礎(chǔ)的非定位標(biāo)記，不可控因素較多，實驗中應(yīng)關(guān)注脫標(biāo)記質(zhì)控。（4）在可商業(yè)化購買的放射性標(biāo)記原料和合成實驗可行性的前提下，選擇盡量短的合成路線，縮短試驗周期，提高產(chǎn)率。（5）3H 定位標(biāo)記位點選擇時，應(yīng)注意避開氧化代謝軟點；14C 標(biāo)記位點應(yīng)選擇分解代謝后分子所關(guān)注的部分，否則損失體內(nèi)示蹤的代表性。（6）對于預(yù)期分解代謝為不同分子結(jié)構(gòu)的產(chǎn)品，可選擇不同核素雙標(biāo)記，節(jié)省實驗資源。

1.2.2 放射性標(biāo)記物的表征 放射性標(biāo)記物的表征包括：（1）物理化學(xué)特性表征，應(yīng)與非標(biāo)產(chǎn)品一致。（2）通過高效液相色譜（HPLC），質(zhì)譜（MS），核磁共振（NMR）等手段表征，應(yīng)與非標(biāo)產(chǎn)品一致。（3）HPLC 放射性色譜等手段鑒定放化純度。（4）通過總放射性活度檢測，計算比活度，應(yīng)滿足實驗動物需求。（5）測定標(biāo)記樣品的穩(wěn)定性。

1.2.3 放射性標(biāo)記物臨床前試驗 本部分實驗?zāi)康氖牵哼\用經(jīng)驗證的定量、定性測定方法，在可靠的物質(zhì)平衡數(shù)據(jù)（回收率＞85%）支持下，充分展示給藥后受試物相關(guān)物質(zhì)體內(nèi)暴露情況，原形物和代謝產(chǎn)物總體和分別的動力學(xué)過程［8］。具體包括：（1）確定血液、組織、排泄物中總體（總放射性）動力學(xué)規(guī)律；（2）確定血液和排泄物中的代謝產(chǎn)物全譜；（3）給藥位點總體消除過程；（4）確定人和動物體外代謝產(chǎn)物譜、顯示種屬差異、以便正確選擇毒理研究動物種屬；（5）通過放射性代謝產(chǎn)物鑒定人體代謝酶，早期發(fā)現(xiàn)人體高比例代謝產(chǎn)物，并為藥物相互作用研究的試驗設(shè)計提供依據(jù)。對于可吸收止血材料，基本不涉及后2 點。

實驗過程包括以下步驟（以3H 和14C 為例）。

藥物配置：將非標(biāo)的受試物與標(biāo)記受試物按一定比例混合，配制與臨床應(yīng)用一致的劑型?？紤]到可吸收止血材料的代謝特點（吸收慢，體內(nèi)暴露低，研究周期長），可提高放射劑量，以滿足檢測需求。

動物給藥：盡可能模擬臨床給藥方式。

樣品采集：樣品包括血、組織、排泄物。對于藥物體內(nèi)物質(zhì)平衡研究，采集周期應(yīng)滿足排泄物中回收到總給藥放射性的85%（3H）或90%（14C）以上，或日排泄放射性占總給藥量的1%以下。但對于可吸收止血材料，由于體內(nèi)過程較慢，需依據(jù)自身特點或預(yù)實驗結(jié)果，參考藥物研究的標(biāo)準(zhǔn)，設(shè)置合理的采樣周期。組織分布研究中除血、肝、腎、腦等重要器官外，另應(yīng)重點關(guān)注給藥部位，采樣時盡可能擴大范圍，以免損失放射性，造成給藥部位藥量的低估。尿糞回收采樣周期結(jié)束后，動物應(yīng)進(jìn)行全面的組織采樣測定，這對于解釋物質(zhì)平衡的數(shù)據(jù)非常關(guān)鍵。

樣品處理：液體樣品（血漿，尿液）可直接或稀釋后與閃爍液混合；固體樣品（糞便，組織）需經(jīng)勻漿均質(zhì)化后取樣，氧化燃燒后回收到閃爍液中；全血干斑也需經(jīng)氧化燃燒后測定。實驗中注意平行插入質(zhì)控樣品，以隨時監(jiān)測氧化燃燒效率的穩(wěn)定性和均一性。

基于液體閃爍計數(shù)（liquid scintillation counting）總放射性活度測定：各種待測樣品的基質(zhì)不同，可能影響到閃爍計數(shù)效率和猝滅，需要分別進(jìn)行標(biāo)定和質(zhì)控驗證。

液相放射性色譜檢測技術(shù)（liquid radiochromatography）：結(jié)合分離HPLC 和MS 手段代謝物譜，如圖1 所示，可采用在線或離線放射性檢測。

放射性自顯影技術(shù)（radioautography）：尸體冷凍，整體切片，放射自顯影［9］。本質(zhì)上等同于組織分布實驗，優(yōu)勢是更直觀。

2 可吸收止血材料體內(nèi)動力學(xué)研究策略

全球，包括FDA，沒有針對可吸收醫(yī)療器械體內(nèi)處置動力學(xué)研究技術(shù)指導(dǎo)原則。本研究參考藥代動力學(xué)研究的相關(guān)原則，針對可吸收醫(yī)療器械體所獨有的給藥方式和可能的體內(nèi)處置規(guī)律特點，嘗試提出一個初步解決方案，拋磚引玉。

本研究的最終目的是充分闡明止血材料體內(nèi)降解后ADME 過程，包括受試物在給藥部位消除的動力學(xué)過程，體內(nèi)主要降解產(chǎn)物體內(nèi)暴露曲線，相關(guān)代謝終產(chǎn)物排泄動力學(xué)過程等。簡單說，就是降解機制，降解特性，降解產(chǎn)物譜和相關(guān)產(chǎn)物的動力學(xué)過程。一般這些研究均在非臨床階段完成，主要包括體外降解試驗和體內(nèi)研究。因此，試驗設(shè)計應(yīng)以簡單、非標(biāo)方法優(yōu)先為原則，綜合考慮受試化合物的分子結(jié)構(gòu)信息和體外實驗的代謝物結(jié)果，確定項目的總體研究策略和放射性標(biāo)記示蹤技術(shù)結(jié)合HPLC-MS 分析方案。具體見圖2。

圖2 可吸收止血材料體內(nèi)處置動力學(xué)研究策略

從化學(xué)分子結(jié)構(gòu)角度，止血材料為經(jīng)化學(xué)修飾改性或化學(xué)反應(yīng)聚合而成的含有重復(fù)單元的高分子材料。首先應(yīng)分析判斷止血材料的化學(xué)分子結(jié)構(gòu)中是否含有非天然的潛在安全性擔(dān)憂的化學(xué)基團。據(jù)此可將止血材料按降解產(chǎn)物風(fēng)險等級分為低、中、高三個水平，分別對應(yīng)表1 中按制備工藝分類的三個類別。

體內(nèi)分析中會遭遇諸如基質(zhì)復(fù)雜，代謝產(chǎn)物與內(nèi)源性物質(zhì)一致等困難，另外按臨床植入方式給藥后，受試物完全降解消除可能耗時較長，更加降低代謝產(chǎn)物的體內(nèi)暴露濃度，以上因素給定性和定量分析帶來挑戰(zhàn)。因此，首先需要進(jìn)行體外降解試驗（試驗1），并與體內(nèi)研究（試驗2）相互配合。

在試驗1 中，可利用生物相關(guān)的酶或其他加速降解手段，對受試物的降解能力（穩(wěn)定性）進(jìn)行初步判斷，并鑒定溶出液體中可能的代謝物譜，判定降解途徑和是否產(chǎn)生非內(nèi)源性代謝產(chǎn)物。

如果在試驗1 中沒有非內(nèi)源性物質(zhì)的生成，且受試物分子結(jié)構(gòu)中沒有非天然的潛在安全性擔(dān)憂的化學(xué)基團，例如低風(fēng)險類，或中風(fēng)險類中符合以上判斷標(biāo)準(zhǔn)的產(chǎn)品，可進(jìn)行非標(biāo)記體內(nèi)研究（試驗2-1），按臨床植入方式給藥后，觀察受試物在給藥部位消除的動力學(xué)過程。由于產(chǎn)物均為內(nèi)源性物質(zhì)，可不必考察主要降解產(chǎn)物體內(nèi)暴露曲線和排泄動力學(xué)過程。

如果在試驗1 中發(fā)現(xiàn)非內(nèi)源性物質(zhì)的生成，或止血材料的化學(xué)分子結(jié)構(gòu)中含有非天然的潛在安全性擔(dān)憂的化學(xué)基團，二者滿足其一，即啟動放射性標(biāo)記試驗（試驗2-2），按3 項下進(jìn)行全面的體內(nèi)動力學(xué)考察。例如高風(fēng)險類，或中風(fēng)險類中符合以上判斷標(biāo)準(zhǔn)的產(chǎn)品。

總結(jié)以上的研究策略（具體決策樹見圖2），可見低風(fēng)險類可進(jìn)行非標(biāo)記研究；高風(fēng)險類必須進(jìn)行放射性標(biāo)記的體內(nèi)處置研究；中風(fēng)險類的研究策略選擇需結(jié)合體外試驗代謝物譜結(jié)果，和分子結(jié)構(gòu)分析，綜合判斷。

另外，不能排除其他有效的可接受的標(biāo)記示蹤手段，例如熒光標(biāo)記等，以及未來創(chuàng)新的研究方法，在可吸收止血材料體內(nèi)ADME 研究中的貢獻(xiàn)。

3 可吸收止血材料體內(nèi)動力學(xué)研究進(jìn)展

總結(jié)現(xiàn)有的公開發(fā)表的文獻(xiàn)資料，可以發(fā)現(xiàn)，可吸收止血材料體內(nèi)動力學(xué)研究策略和放射性標(biāo)記示蹤技術(shù)結(jié)合HPLC-MS 分析方案基本遵循了上述決策樹的原則，具體如下。

低風(fēng)險產(chǎn)品由于沒有生成非內(nèi)源性物質(zhì)的潛在安全性擔(dān)憂，僅進(jìn)行非標(biāo)記代謝研究，即按臨床植入方式給藥后，僅觀察受試物在給藥部位消除的動力學(xué)過程。例如淀粉類，主要降解為寡糖或單糖，通過碘-淀粉顯色反應(yīng)等手段，觀察到受試物在植入部位7 d 即完全清除［10-11］；殼聚糖類，在體內(nèi)經(jīng)巨噬細(xì)胞的幾丁質(zhì)酶和溶菌酶作用下生成殼寡糖，再進(jìn)一步生成 β-葡萄糖胺，通過病理切片和染色，顯微鏡下觀察手段，發(fā)現(xiàn)受試物在植入部位3～6 周即完全清除［12-15］；明膠及膠原可通過酶解（主要是明膠酶和組織蛋白酶）的方式降解為氨基酸，植入體內(nèi)后降解時間分別為4～6 周及8～12 周［16-19］。

高風(fēng)險產(chǎn)品由于具有生成非內(nèi)源性物質(zhì)的潛在安全性擔(dān)憂，需通過放射性標(biāo)記方法，進(jìn)行全面的體內(nèi)動力學(xué)考察。例如，氰基丙烯酸酯類粘合劑或聚乙二醇類密封膠，主要通過水解（合成的逆過程）的方式降解［20-21］，體內(nèi)的降解周期至少為3～8 周［22］。

中風(fēng)險產(chǎn)品來源于天然物質(zhì)經(jīng)化學(xué)修飾或改性而獲得的，可根據(jù)圖2 的決策樹，首先進(jìn)行體外降解實驗，獲得代謝物譜的數(shù)據(jù)，綜合受試物分子結(jié)構(gòu)中是否含有非天然的潛在安全性擔(dān)憂的化學(xué)基團，判斷是否需要開展放射性標(biāo)記全面的ADME 研究。一般的，如果本類產(chǎn)品中修飾簡單（氧化，羧甲基化），可按低風(fēng)險產(chǎn)品的研究策略，如修飾過程中引入復(fù)雜修飾（交聯(lián)劑），則按高風(fēng)險產(chǎn)品的研究策略執(zhí)行。例如，采用前者研究策略的氧化再生纖維類止血材料，體外降解為不同聚合度的寡聚糖或寡聚糖醛酸［23-33］，體內(nèi)降解周期至少3 周［34-35］；采用后者研究策略的某纖維素止血材料，采用交聯(lián)劑修飾后，經(jīng)體內(nèi)放射性標(biāo)記示蹤結(jié)合HPLC-MS分析發(fā)現(xiàn)此交聯(lián)劑以某小分子形式排出體外。這體現(xiàn)了中風(fēng)險產(chǎn)品不同分子采取不同研究策略。

4 總結(jié)

綜上，可吸收止血材料作為外源物，為了臨床安全使用，需全面闡明體內(nèi)代謝和處置動力學(xué)過程。放射性標(biāo)記示蹤技術(shù)結(jié)合HPLC-MS 分析，是此類產(chǎn)品體內(nèi)動力學(xué)研究的主要手段。本研究充分討論此方法的優(yōu)劣勢和實驗關(guān)鍵考慮因素，提出在充分理論和體外實驗評估的基礎(chǔ)上，將可吸收止血材料按降解產(chǎn)物風(fēng)險等級分為低、中、高三個水平，從科學(xué)的、全面的、經(jīng)濟的角度分別優(yōu)化研究策略和放射性標(biāo)記示蹤技術(shù)結(jié)合HPLC-MS 分析方案，并總結(jié)了目前各風(fēng)險等級產(chǎn)品在體外降解規(guī)律和體內(nèi)代謝動力學(xué)的進(jìn)展。以上為個人觀點，不代表任何機構(gòu)，僅供參考。