田 野 唐忠尉 張 磊 胡 陽 李新喜

1新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院血管外科，新疆 烏魯木齊 830000

2新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院泌尿外科，新疆 烏魯木齊 830000

血栓閉塞性脈管炎（thromboangiitis obliterans，TAO）是一種以非動脈硬化性、炎性、血栓性、閉塞性和非化膿性血管受累為病理特征的周圍血管疾病，多為四肢中、小動靜脈受累，臨床表現(xiàn)為肢體缺血、疼痛、間歇性跛行、血栓性靜脈炎，常發(fā)生于35～50歲的男性患者[1-2]。傳統(tǒng)治療及藥物治療TAO的臨床效果不佳，并具有較高的復(fù)發(fā)率及截肢率[3]。目前，研究顯示TAO的發(fā)生與吸煙密切相關(guān)，但其發(fā)病機制仍尚未清晰[4]。目前TAO發(fā)生機制的研究主要集中于炎性反應(yīng)及免疫應(yīng)答的調(diào)控。炎性反應(yīng)貫穿TAO的整個過程，可損傷血管內(nèi)皮、聚集并導(dǎo)致血栓形成[5]。有研究發(fā)現(xiàn)，刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞的Toll樣受體-4（Toll-like receptor 4，TLR-4）后，可啟動髓樣分化因子88（myeloid differentiation factor 88，MyD88），從而激活核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB），最終導(dǎo)致大量炎性因子釋放[6-7]。而且“炎性反應(yīng)學(xué)說”已成為TAO發(fā)病機制的主流學(xué)說，進一步研究TAO炎性反應(yīng)信號通路或其關(guān)鍵的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，對從炎性反應(yīng)角度干預(yù)TAO病變過程具有重要價值。同時，建立TAO病理特點的動物模型，對于探索該病的發(fā)病機制及治療藥物的研發(fā)具有重要的意義。手術(shù)結(jié)合化學(xué)造模法是通過手術(shù)經(jīng)股動脈注射月桂酸鈉，利用月桂酸鈉對血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷誘導(dǎo)血栓形成，從而建立TAO大鼠模型。因此，本研究以大鼠為實驗動物，應(yīng)用手術(shù)結(jié)合化學(xué)造模法建立TAO動物模型，同時探討靶向抑制NF-κB通路對TAO大鼠病變過程的影響，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

選用60只SPF級Wistar雄性大鼠（IACUC201902-15），平均體重（350±50）g。實驗動物飼養(yǎng)于新疆醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心，飼養(yǎng)環(huán)境溫度（22±2）℃，可自由進食、進水，飼養(yǎng)室每隔12 h明暗交替。本研究獲得新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院動物實驗醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，實驗動物購于新疆醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心。

1.2 材料及儀器

生理鹽水（上海源葉生物科技有限公司，R21479）、10%水合氯醛（上海源葉生物科技有限公司，R21477）、青霉素（索萊寶，A8180）、月桂酸鈉（上海源葉生物科技有限公司，S30244）、NF-κB抑制劑（pyrrolidinedithiocarbamate ammonium，PDTC；AbMole，M4005）、10%甲醛（索萊寶，G2161）、脫蠟液（索萊寶，YA0031）、磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffer saline，PBS）（索萊寶，P1010）、蘇木素（索萊寶，BL700B）、樹膠（索萊寶，G8590）、蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司，AR1180）、隔水式恒溫培養(yǎng)箱（上海博迅實業(yè)有限公司，B6-270）、烘干箱（上海博迅實業(yè)有限公司，BXH-280）、漩渦混合器（海門市其林貝爾儀器制造有限公司，GL-88B）、離心機（精騏，MLX-206）、光學(xué)顯微鏡（Leica Microsystems Ltd，DM4000）。

1.3 實驗動物分組及標(biāo)本采集

根據(jù)隨機數(shù)字表法分為六組，各10只。（1）正常對照組，大鼠正常飼養(yǎng)，不做任何處理；（2）模型組，大鼠進行TAO模型構(gòu)建，術(shù)后第2天開始進行腹腔注射生理鹽水，100 mg/（kg·d），連續(xù)注射21 d后進行取材；（3）假手術(shù)組，大鼠進行手術(shù)時不給月硅酸溶液，注入等量生理鹽水，然后術(shù)后第2天開始進行腹腔注射生理鹽水，100 mg/（kg·d），連續(xù)注射21 d后進行取材；（4）NF-κB抑制7 d組，大鼠造模成功后第2天開始腹腔注射PDTC，100 mg/（kg·d），給藥7 d后取材；（5）NF-κB抑制14 d組，給藥開始時間及劑量同NF-κB抑制7 d組，給藥14 d后取材；（6）NF-κB抑制21 d組，給藥開始時間及劑量同NF-κB抑制7 d組，給藥21 d后取材。

1.4 TAO模型構(gòu)建

TAO大鼠模型建立前，禁食12 h，取大鼠右后肢進行造模。腹腔注射10%水合氯醛（3 ml/kg），以腹股溝中點切開1.5 cm切口，鈍性分離皮下組織與肌肉組織，暴露股動脈鞘，游離腹壁淺動脈上段股動脈，長度0.5 cm，近心端用動脈夾阻斷血流，向遠(yuǎn)心端注入0.1 ml月桂酸鈉溶液（10 g/L）后脫脂棉球按壓穿刺點止血。15 min后檢查無活動性出血即縫合皮膚。手術(shù)完畢后給予青霉素40萬單位腹腔注射，預(yù)防感染。造模后，大鼠右后肢出現(xiàn)缺血表現(xiàn)，如皮膚蒼白青紫、皮膚溫度降低、壞疽、潰爛、壞死等，則表明造模成功。

1.5 觀察指標(biāo)及檢測方法

通過HE染色觀察六組大鼠右后肢動脈血管組織病理學(xué)變化，將六組大鼠右后肢動脈血管10%甲醛浸泡7 d以固定，然后進行常規(guī)的石蠟包埋固定后進行切片，厚度4～8 μm。將切片放于二甲苯中，充分浸泡10 min，浸泡完后更換二甲苯繼續(xù)浸泡10 min，將浸泡過二甲苯的切片先放入無水乙醇中浸泡5 min，再依次置于95%、85%、70%乙醇中各浸泡5 min。將水化后的切片使用PBS浸泡清洗，每次浸泡5 min，共3次，清洗后行蘇木素染色，每組大鼠組織切片滴加100 μl蘇木素，染色10 min。再使用1%的鹽酸乙醇使蘇木素染色的組織切片返藍，讓細(xì)胞核染藍色。返藍結(jié)束后先用清水進行清洗，再用雙蒸水將組織切片沖洗干凈。然后再滴加伊紅染液使組織染色3 min后，80%乙醇脫水5 s，95%乙醇脫水2 min，無水乙醇脫水2 min。將脫水后的組織切片使用二甲苯浸泡2次，每次4 min，然后晾干組織切片并使用中性樹膠封片。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

應(yīng)用R-X-64-4.0.3的R程序軟件包進行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料以（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析；計數(shù)資料以n表示；P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 六組大鼠取材時體重比較

取材時，對照組大鼠體重（346.0±25.5）g，模型組大鼠體重（356.4±23.0）g，假手術(shù)組大鼠體重（353.9±25.5）g，NF-κB抑制7 d組大鼠體重（350.3±23.9）g，NF-κB抑制14 d組大鼠體重（354.2±24.3）g，NF-κB抑制21 d組大鼠體重（351.6±26.2）g，六組大鼠體重比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（F＝0.218，P＝0.953）。

2.2 造模情況

造模（模型組、NF-κB抑制7 d組、NF-κB抑制14 d組、NF-κB抑制21 d組）大鼠均成功，技術(shù)成功率100%，無大鼠死亡。造模前，大鼠右后肢毛色柔順、足爪部正常；造模時，當(dāng)大鼠注射月桂酸鈉溶液15 min后，皮膚蒼白、皮膚溫度降低；造模后第2天，大鼠右后肢足爪部呈不同程度的青紫色、腫脹，患肢均有缺血表現(xiàn)；嚴(yán)重者足趾變黑，并逐漸向上發(fā)展成壞疽。造模3～5 d后，病變進一步加劇，造模大鼠患肢處出現(xiàn)潰爛、滲液、惡臭味，部分壞疽有脫落，部分大鼠呈現(xiàn)腹脹、拒動、消瘦、少食等癥狀。模型組大鼠右后肢肌肉群出現(xiàn)不同程度壞死，多為干酪樣，伴有感染、惡臭味；遠(yuǎn)端肢體呈干性壞疽，木乃伊化，部分脫落，右后肢可見骨骼外露，雖然部分造模大鼠右后肢外形完整無壞疽，僅呈跛行和拖拽狀，但解剖后其后肢仍有肌肉壞死。各NF-κB抑制組大鼠右后肢有不同程度的改善。（圖1）

2.3 右后肢動脈血管組織變化

對照組大鼠右后肢動脈血管無明顯變化；假手術(shù)組大鼠右后肢動脈血管周邊有少量炎性反應(yīng)；模型組大鼠右后肢動脈血管腔內(nèi)有血栓形成并且機化，血管周邊纖維組織增生伴炎性反應(yīng)；NF-κB抑制7 d大鼠右后肢動脈血管腔內(nèi)有機化血栓，周邊炎性肉芽組織增生，組織間有出血；NF-κB抑制14 d組大鼠右后肢動脈壁增厚，周圍有炎性纖維組織增生伴炎性反應(yīng)，血管腔內(nèi)有炎性纖維組織增生；NF-κB抑制21 d組大鼠右后肢動脈血管周邊纖維組織增生，有炎性反應(yīng)并有炎性肉芽組織。（圖2、圖3）

圖2 六組大鼠右后肢動脈血管組織變化情況

圖3 大鼠右后肢動脈血管HE染色（×100）

3 討論

TAO是一種以中小動脈和靜脈節(jié)段性閉塞為特征的疾病，主要涉及四肢的血管[8]。目前，吸煙、寒冷和感染等因素被認(rèn)為與TAO發(fā)展有關(guān)，但該病的確切發(fā)病機制目前仍不清晰[9]。非化膿性炎性反應(yīng)是TAO的病理特征，即炎性反應(yīng)過度激活和免疫反應(yīng)紊亂，導(dǎo)致多種細(xì)胞因子大量分泌使血管內(nèi)皮浸潤，破壞內(nèi)皮完整性進而形成血栓導(dǎo)致血管閉塞[10]。早期治療TAO具有明顯的臨床療效，治療方式包括防治下肢血栓、控制及治療缺血性疼痛等[3]。TAO主要發(fā)生在年輕人群中并有較高的截肢率[11]。因此，一旦確診TAO應(yīng)及時治療，以改善肢體缺血的癥狀，防止因壞死而截肢，從而影響生活質(zhì)量[12]。

目前制作TAO模型的方法：（1）損傷動脈內(nèi)膜法，即損傷血管內(nèi)膜使血小板聚集形成血栓；（2）注入凝血酶法，向血管內(nèi)注入藥物，使血液黏稠，易于凝固形成血栓；（3）向血管內(nèi)填充血凝塊堵塞管腔，誘導(dǎo)血栓形成。注入凝血酶法或損傷動脈內(nèi)膜法為經(jīng)典的血栓模型制備法，注入凝血酶法雖然方法簡單，但形成的血栓結(jié)構(gòu)松散，不符合人體自發(fā)性血栓形成的組織學(xué)特征；而損傷動脈內(nèi)膜法操作困難，成本高，不易用于大量造模。本實驗采用股動脈注射月桂酸鈉的方法建立TAO大鼠模型，通過參考判定標(biāo)準(zhǔn)，經(jīng)股動脈注射月桂酸鈉可以成功建立TAO大鼠模型，方法簡便有效，模型穩(wěn)定，可用于TAO病理變化及藥物研制等研究[13]。

本研究模型組大鼠HE染色顯示，右后肢動脈血管腔內(nèi)有血栓形成，血管周圍有纖維組織增生。這是由于炎性反應(yīng)的過度激活及免疫應(yīng)答的紊亂對血管內(nèi)皮功能造成損傷，引起血小板在內(nèi)皮損傷的部位發(fā)生激活、聚集，并促進血栓形成。而隨著NF-κB抑制組的抑制時間增加，HE染色顯示炎性纖維組織增生和血管組織周圍的炎性肉芽增生，而無血栓形成，表明隨著NF-κB抑制劑的作用可以抑制炎性反應(yīng)，阻止TAO的病情發(fā)展，其機制是由于抑制核因子κB抑制因子α的磷酸化、阻止NF-κB易位入核并減少下游細(xì)胞因子的表達。NF-κB是調(diào)節(jié)炎性反應(yīng)和免疫反應(yīng)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，是多種機體信號通路的啟動因子[14]。隨著NF-κB的抑制，其阻止TAO病情發(fā)展的具體下游信號通路尚不清楚，因為本研究缺少炎性因子、相關(guān)蛋白的檢測，無法明確延緩TAO病情發(fā)展的具體NF-κB信號通路。因此，NF-κB信號通路對TAO發(fā)生、發(fā)展的機制仍需進一步探索及研究。

本研究通過手術(shù)結(jié)合化學(xué)造模法制作了一種簡單、可重復(fù)性高的大鼠TAO模型，并用該模型初步證實靶向抑制NF-κB通路可阻止TAO病情發(fā)展。