趙 珂，趙 玉，陳少峰，李 重，孫 遠(yuǎn)，王 福，耿 強(qiáng)*

1.天津市中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院 婦科，天津 300091

2.天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院 男科，天津 300193

3.中國中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院 男科，北京 100091

男性不育癥是影響社會穩(wěn)定及家庭和諧的全球性問題[1]，世界范圍內(nèi)有7000 萬對夫妻存在生育力低下或不育的狀況[2]，其中接近40%由男方因素引起[3]。少弱精子癥是引起男性不育癥的重要因素之一，目前現(xiàn)代醫(yī)學(xué)針對少弱精子癥的治療無特效藥物[4]，亦或選擇輔助生殖技術(shù)孕育子代，但仍存在高成本、患者接受度低以及后續(xù)子代健康風(fēng)險(xiǎn)等諸多問題。中醫(yī)藥治療男性不育癥歷史悠久，積累了大量的臨床經(jīng)驗(yàn)并取得了較好的療效，如以補(bǔ)腎益精為主要功效的中成藥五子衍宗丸可改善精子質(zhì)量，治療少弱精子癥[5]。蠶蛾公補(bǔ)合劑是一種以名貴藥材雄蠶蛾提取物為君藥配伍制成的現(xiàn)代中藥制劑，具有補(bǔ)腎助陽、養(yǎng)血填精之功效，同時(shí)現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn) Wnt（一類分泌性糖蛋白）/β-鏈蛋白（β-catenin）信號通路參與睪丸的生精過程[6]。本研究擬通過運(yùn)用蠶蛾公補(bǔ)合劑治療少弱精子癥患者，評價(jià)其臨床療效并探討其作用機(jī)制，為中醫(yī)藥治療少弱精子癥提供臨床參考和試驗(yàn)依據(jù)。

1 研究對象

1.1 病例選擇

選取2018年1月—2019年12月就診于天津市中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院、天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院和中國中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院門診患者60 例，入組前均簽署知情同意書，將納入患者按照隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為治療組及對照組，每組30 例，平均年齡（29.50±3.26）歲，平均病史（16.10±3.34）月。兩組基線資料間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。本實(shí)驗(yàn)通過中國中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院實(shí)驗(yàn)倫理審查委員會審批（批準(zhǔn)號2018XLA084-2）。

1.2 納入標(biāo)準(zhǔn)

（1）符合西醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)，包括男性不育癥和少弱精子癥的診斷。診斷標(biāo)準(zhǔn)參考《世界衛(wèi)生組織人類精液檢查與處理實(shí)驗(yàn)室手冊》第5 版。男性不育癥：在未采取避孕措施情況下，同居1年或1年以上，配偶未懷孕，并排除女方因素。少精癥：精子濃度低于下限值即1.5×107/mL；弱精子癥：表現(xiàn)為精子活力降低，前向運(yùn)動精子活動率＞10%，且＜32%。（2）符合中醫(yī)腎陽虛的診斷標(biāo)準(zhǔn)。參照《中藥新藥臨床研究指導(dǎo)原則》[7]，主癥：腰膝酸軟，性欲減退，畏寒肢冷；次癥：精神萎靡，夜尿頻多，下肢浮腫，動則氣促，發(fā)槁齒搖，舌質(zhì)淡苔白，脈沉遲，尺無力。具備以上主癥2 項(xiàng)，次癥2項(xiàng)，即可診斷腎陽虛證。（3）20 歲＜年齡＜40 歲。（4）患者存在2 次及以上精液異常。（5）所有患者均在本研究治療前2 周內(nèi)未服用任何避孕藥。

1.3 排除標(biāo)準(zhǔn)

（1）近期服用過腫瘤化療藥、柳氨磺胺吡啶、呋喃妥英等對精子生成、活力具有影響的藥物；（2）存在嚴(yán)重肝、心等系統(tǒng)性疾??；（3）存在藥物過敏史；（4）存在中、重度附屬性腺或生殖道感染。

2 方法

2.1 給藥方案

治療組給予蠶蛾公補(bǔ)合劑（批號2017011，太極集團(tuán)四川南充制藥有限公司），口服3 次/d，每次10 mL。對照組給予口服五子衍宗丸（60 g/瓶，水丸制劑，北京同仁堂股份有限公司同仁堂制藥廠，批號Z11020241），每次6 g，2 次/d，兩組均以12周為1 個(gè)療程，治療1 個(gè)療程。

2.2 療效標(biāo)準(zhǔn)

顯效：精子數(shù)量及精子活力增加2/3；有效：精子數(shù)量及精子活力增加1/3；無效：精子數(shù)量及精子活力增加不明顯或降低；總有效率＝(顯效例數(shù)＋有效例數(shù))/總例數(shù)。

2.3 精液常規(guī)指標(biāo)檢測

囑受試者禁欲2～7 d，采用手淫取精液，液化后做精液常規(guī)分析，采用精液全自動分析系統(tǒng)（北京偉力科技有限公司生產(chǎn)）進(jìn)行精子密度和精子活力的分析。剩余標(biāo)本在低速水平離心機(jī)（北京白洋醫(yī)療器械有限公司）中以3000×g離心15 min，用一次性吸管進(jìn)行精漿及精液沉淀物分離，分別放置在潔凈EP 管內(nèi)，冰箱?4 ℃冷凍層內(nèi)保存待用。

2.4 RT-PCR 檢測Wnt/β-catenin mRNA 表達(dá)

液氮保存組織解凍，移入研缽中，加入1 mL TRIzol，反復(fù)研磨，將勻漿樣品在室溫放置5 min；于2～8 ℃、10 000 r/min 離心10 min，取上清；每使用1 mL TRIzol 加入0.2 mL 氯仿，劇烈振蕩15 s，室溫放置3 min；2～8 ℃ 10 000 r/min 離心15 min。樣品分為黃色有機(jī)相、無色水相和中間層。將水相轉(zhuǎn)移到新管中，用異丙醇沉淀水相中的RNA。移去上清，用75%乙醇洗滌RNA 沉淀。2～8 ℃不超過7500 r/min 離心5 min，棄上清；室溫放置干燥或真空抽干RNA 沉淀，晾5～10 min。加入25～200 μL無RNase 的水或0.5% SDS，用槍頭吸打幾次，55～60 ℃放置10 min 防止RNA 溶解，?70 ℃保存。以U6 作為內(nèi)參對照，使用SYBR 熒光染料試劑盒進(jìn)行熒光定量 PCR 檢測，采用 2???Ct方法對Wnt/β-catenin mRNA 的相對表達(dá)量進(jìn)行分析。

2.5 Western blotting檢測Wnt/β-catenin蛋白表達(dá)

取液氮保存的組織解凍，與裂解液一起加入研磨器中，冰上研磨裂解10 min，移入離心管中，在超速冷凍離心機(jī)中4 ℃、14 000 r/min 離心15 min，收集上清于Eppendorf 管中，BCA 法測定總蛋白濃度，將蛋白樣品與蛋白電泳上樣緩沖液混合，沸水煮10 min，備用。采用Western blotting 法檢測：10%SDS-PAGE 凝膠電泳，使用多功能電泳儀將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF 膜，將該膜在室溫下封閉2 h，PBST 液漂洗3 次，每次10 min，與一抗（1∶500）4 ℃孵育過夜，PBST 漂洗3 次，辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG（1∶1000）孵育2 h，PBST 液洗膜3 次，每次10 min，ECL 化學(xué)發(fā)光顯影。用Jmage 分析軟件掃描雜交條帶灰度值。結(jié)果用目的蛋白條帶與肌動蛋白（Actin）條帶灰度值的比值表示，并且使用Actin 進(jìn)行校正。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS19.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料采用±s表示，數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布，t檢驗(yàn)兩組間差異。

3 結(jié)果

3.1 病例脫落情況

本研究納入60 例患者，試驗(yàn)完成時(shí)，兩組均沒有病例脫落，患者依從性好。

3.2 兩組療效比較

治療組總有效率高于對照組，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，即蠶蛾公補(bǔ)合劑與五子衍宗丸治療總有效率無明顯差異。結(jié)果見表1。

3.3 精子質(zhì)量情況變化

對照組和治療組較服藥前，精子密度和精子活力均顯著增加（P＜0.01）；治療后，與對照組比較，治療組精子密度和精子活力顯著增加（P＜0.01）。見表2。

表1 兩組患者療效比較Table 1 Comparison of efficacy between two groups

表2 精子質(zhì)量變化Table 2 Change of sperm quality

3.4 精液中Wnt/β-catenin mRNA 和蛋白表達(dá)情況

與對照組相比，治療組精液中Wnt/β-catenin mRNA 和蛋白表達(dá)增加，差異顯著（P＜0.01）。見圖1、2。

3.5 不良反應(yīng)

治療組患者中出現(xiàn)1 例惡心、胃脘不適癥狀，經(jīng)抑酸護(hù)胃等對癥治療后消失。對照組未出現(xiàn)嚴(yán)重不良反應(yīng)，兩組均無因不良反應(yīng)退出本次臨床觀察的情況。

4 討論

圖1 精液中Wnt/β-catenin mRNA 表達(dá)情況Fig.1 Expression of Wnt/β-catenin mRNA in sperm

圖2 精液中Wnt/β-catenin 蛋白表達(dá)情況Fig.2 Expression of Wnt/β-catenin protein in sperm

中醫(yī)學(xué)對男性不育癥的認(rèn)識已有數(shù)千年歷史，屬“精冷”“無子”范疇。《黃帝內(nèi)經(jīng)》中就記載了以天癸為媒介，以腎為中心的經(jīng)典生殖學(xué)說，并沿用至今。腎為先天之本，主生殖，腎中陽氣不足，命門火衰以致無力生發(fā)腎中陽氣以生精，可引起男子精冷、精少而不嗣，故在治療時(shí)以補(bǔ)腎作為治療少弱精子癥的基本法則[8]。另有報(bào)道顯示，現(xiàn)代男性不育癥的主要證型以腎陽虛證為主[9]。蠶蛾公補(bǔ)合劑由雄蠶蛾、人參、熟地黃、當(dāng)歸、補(bǔ)骨脂、枸杞子、菟絲子、仙茅、肉蓯蓉、淫羊藿、蛇床子組成，具有補(bǔ)腎壯陽、養(yǎng)血填精之功效。蠶蛾由蠶蛹蛻皮羽化而成，成蟲期的雄性蠶蛾生殖器官十分發(fā)達(dá)[10]，同時(shí)亦可藥用，《本草述鉤元》中記載：“雄蛾，味咸，氣溫?zé)?，主益精氣，止泄精尿血，治遺精赤白濁”，故本方以雄蠶蛾固精壯陽為君藥，人參、熟地黃、補(bǔ)骨脂益氣補(bǔ)腎助陽，共為臣藥；佐以當(dāng)歸活血補(bǔ)血，枸杞子滋陰填精，仙茅、菟絲子、肉蓯蓉、淫羊藿、蛇床子益腎助陽。

Wnt/β-catenin 信號通路作為最為經(jīng)典的Wnt 信號通路，參與眾多體細(xì)胞的生命活動及進(jìn)程[11-12]。有研究發(fā)現(xiàn)，Wnt/β-catenin 信號通路能夠在腎陽虛的患者體內(nèi)表達(dá)[13]；另有研究發(fā)現(xiàn)，成年男性睪丸支持細(xì)胞中存在Wnt/β-catenin 信號通路的表達(dá)，并且激活Wnt/β-catenin信號通路能夠促進(jìn)睪丸支持細(xì)胞的增殖，從而改善生精功能[6]。本研究表明，具有補(bǔ)腎助陽填精功效的蠶蛾公補(bǔ)合劑能夠顯著改善少弱精子癥患者的精子質(zhì)量和活力（P＜0.01）；激活少弱精子癥患者睪丸中Wnt/β-catenin 信號通路，通過調(diào)控此通路進(jìn)而改善睪丸生精功能，提升精子質(zhì)量。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突