李 琳，賀 冰，馬本玲

湖南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院 婦科，湖南 長沙 410005

子宮內(nèi)膜容受性是子宮對胚胎定位、黏附、入侵子宮內(nèi)膜的接受能力，可影響胚胎著床、妊娠過程，子宮內(nèi)膜容受性不良是導(dǎo)致女性不孕的重要因素之一[1-2]。目前，西醫(yī)治療子宮內(nèi)膜容受性不良多以藥物、手術(shù)為主，但藥物不良反應(yīng)影響了藥物的長期應(yīng)用，手術(shù)治療具有術(shù)后并發(fā)癥多、易復(fù)發(fā)等不足。中醫(yī)認為子宮內(nèi)膜容受性屬“癥瘕”“月經(jīng)不調(diào)”“不孕癥”等范疇，血瘀證為常見辨證分型之一，治療需以活血化瘀、溫經(jīng)散寒為主。研究表明，中藥可促進子宮內(nèi)膜、胚胎同步發(fā)育，提升臨床妊娠率[3]。少腹逐瘀湯由生蒲黃、當歸、赤芍、五靈脂等組成，具有活血化瘀、溫陽散寒、舒經(jīng)通絡(luò)的功效。少腹逐瘀湯能提升臨床妊娠率[4]，提示該方可能在調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜容受性上也有一定作用，本研究建立血瘀型子宮內(nèi)膜容受性不良大鼠模型，考察少腹逐瘀湯對大鼠子宮內(nèi)膜容受性及胚胎著床率的影響。

1 材料

1.1 動物

清潔級雌性SD 大鼠50 只，8 周齡，體質(zhì)量（240±20）g；清潔級雄性SD 大鼠25 只，8 周齡，體質(zhì)量（320±20）g，購自北京科興中維生物技術(shù)有限公司，許可證號SYXK（京）2019-0052。大鼠于溫度（22±2）℃、濕度（40±10）%、12 h/12 h 晝夜周期照明下，自由進食飲水，適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d。動物實驗經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院動物倫理委員會審核批準（批準號IACUC-2019-005）。

1.2 藥材

少腹逐瘀湯（批號181104）由湖南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院提供。少腹逐瘀湯由生蒲黃9 g、當歸9 g、赤芍6 g、五靈脂6 g、延胡索3 g、小茴香3 g、川芎3 g、沒藥3 g、肉桂3 g、炮姜0.6 g 組成，以上藥材經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院陳衛(wèi)紅副主任藥師分別鑒定為香蒲科植物水燭香蒲Typha angustifoliaL.的干燥花粉、傘形科植物當歸Angelica sinensis(Oliv.) Diels 的干燥根、毛茛科植物川赤芍Paeonia veithiiLynch 的干燥根、鼯鼠科動物復(fù)齒鼯鼠Trogopterus ranthipesMilne-Edwards 的干燥糞便、罌粟科植物延胡索Corydalis yanhusuoW.T.Wang 的干燥塊莖、傘形科植物茴香Forniculum vulgareMill.的果實、傘形科植物川芎Ligusticum chuanxiong Hort.的干燥根莖、橄欖科植物地丁樹Commiphora myrrhaEngl.的干燥樹脂、無患子科植物龍眼Dimocarpus longanLour.的假種皮、姜科植物姜Zingiber officinaleRosc.的干燥根莖。

1.3 藥品與試劑

戊酸雌二醇片（1 mg/片，批號130109）購自拜耳醫(yī)藥保健有限公司；羥基脲（批號101129）購自美國Sigma 公司；腎上腺素（批號170324）購自華潤雙鶴藥業(yè)股份有限公司；蘇木精-伊紅（HE）染色試劑盒（批號200110）購自上海邁基生物技術(shù)有限公司；腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、白細胞介素-8（interleukin-8，IL-8）ELISA 試劑盒（批號分別為120415、150301、111207）購自武漢博士德生物工程有限公司；活性氧（reactive oxygen species，ROS）、丙二醛試劑盒（批號分別為070514、100417）購自上海晶抗生物有限公司；血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）抗體（批號091104）、血管內(nèi)皮生長因子受體2（vascular endothelial growth factor receptor 2，KDR）抗體（批號100527）、山羊抗兔IgG 抗體（批號121107）購自上海彩佑生物技術(shù)發(fā)展有限公司。

1.4 儀器

FLx 800 熒光酶標儀（美國Bio-Tek 公司）；BX 50 光學(xué)顯微鏡（日本Olympus 公司）；Dolphin-Doc凝膠成像系統(tǒng)（美國Wealtec 公司）；Allegra X-30高速離心機（美國貝克曼庫爾特有限公司）。

2 方法

2.1 少腹逐瘀湯的制備

除肉桂外的其他藥物加300 mL 水浸泡1 h，文火煎煮1 h；后下肉桂，煎煮20 min，濾過，濃縮至質(zhì)量濃度為8 mg/mL（以生藥量計）的混懸液。

2.2 模型的制備

隨機選取10 只雌性大鼠作為對照組，其余雌性大鼠建立血瘀型子宮內(nèi)膜容受性不良模型[5]：大鼠每日9:00 時進行陰道涂片檢查，當陰道分泌物內(nèi)出現(xiàn)大量白細胞，或夾雜少許核扁平上皮細胞，且未出現(xiàn)角化細胞，即為靜止期，開始建模。大鼠ig羥基脲（450 mg/kg，4 mL/kg），1 次/d，持續(xù)10 d；自第4 天開始，同時sc 腎上腺素（0.3 mg/kg），1次/d，持續(xù)7 d。大鼠出現(xiàn)蜷縮少動、拱背、反應(yīng)遲鈍、大便偏稀、背部皮毛疏松或脫落等癥狀，即為造模成功。

2.3 分組與給藥

將造模成功的36 只大鼠隨機分為模型組、戊酸雌二醇（0.27 mg/kg，相當于臨床等效劑量）組及少腹逐瘀湯低、高劑量（144、288 mg/kg，相當于臨床等效劑量、2 倍劑量）組，每組9 只[6]。各給藥組ig 相應(yīng)藥物，對照組和模型組ig 等體積生理鹽水（10 mL/kg），1 次/d，持續(xù)10 d。自給藥后第1 天開始，每日18:00 時至次日8:00 時，按2∶1將雌性、雄性大鼠合籠，合籠后對雌性大鼠進行陰栓、陰道涂片檢查，觀察出現(xiàn)精蟲或陰栓的時間，記為妊娠第1 天。妊娠第5 天，各組大鼠ip 2%戊巴比妥鈉（2.5 mL/kg）麻醉，仰臥位固定于手術(shù)臺，迅速解剖腹腔，觀察子宮胚泡著床情況，記錄胚胎著床率、平均胚胎著床數(shù)；取子宮內(nèi)膜組織，以0.9%氯化鈉溶液沖洗后于液氮中保存?zhèn)溆谩?/p>

2.4 少腹逐瘀湯對大鼠子宮內(nèi)膜TNF-α、IL-6 和IL-8 水平的影響

子宮內(nèi)膜組織加入預(yù)冷PBS，于冰上研磨，4℃、13 000 r/min 離心15 min，取上清液。按照酶聯(lián)免疫吸附法試劑盒說明書分別檢測子宮內(nèi)膜組織中TNF-α、IL-6、IL-8 水平。

2.5 少腹逐瘀湯對大鼠子宮內(nèi)膜ROS 和丙二醛水平的影響

子宮內(nèi)膜組織加入預(yù)冷PBS，于冰上研磨，4℃、13 000 r/min 離心15 min，取上清液。按照試劑盒說明書檢測子宮內(nèi)膜組織ROS 和丙二醛水平。

2.6 少腹逐瘀湯對大鼠子宮內(nèi)膜病理變化、子宮腺體數(shù)、子宮血管數(shù)和子宮內(nèi)膜厚度的影響

子宮內(nèi)膜組織于4%多聚甲醛中固定，流水沖洗，以梯度乙醇脫水、二甲苯透明、包埋后切片（厚度5μm）。脫蠟后切片進行HE 染色、脫水、透明、封片。于顯微鏡下觀察大鼠子宮內(nèi)膜組織病理變化，記錄大鼠子宮腺體數(shù)、子宮血管數(shù)；采用Leica QWin 軟件分析子宮內(nèi)膜厚度，評估子宮內(nèi)膜容受性。

2.7 少腹逐瘀湯對大鼠子宮內(nèi)膜VEGF 和KDR 蛋白表達的影響

取子宮內(nèi)膜組織，加入全細胞裂解液（10 mL/g），于冰上研磨，4 ℃、13 000 r/min 離心15 min，取上清液。蛋白定量后，加入蛋白上樣緩沖液，沸水浴10 min 使蛋白變性。蛋白樣品經(jīng)10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)至PVDF 膜，室溫封閉2 h。分別加入VEGF、KDR 抗體（1∶1000），4 ℃孵育過夜；緩沖鹽溶液洗滌后，加入山羊抗兔IgG 抗體（1∶5000），孵育2 h；緩沖鹽溶液洗滌3次，10 min/次。加入ECL 試劑反應(yīng)5 min，曝光、顯影、定影。采用Image J2x 軟件，對蛋白條帶灰度值進行分析。

2.8 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 19.0 統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)，計量資料以±s表示，多樣本計量資料比較采用單因素方差分析，兩兩樣本比較采用LSD 檢驗，多個獨立樣本采用χ2檢驗。

3 結(jié)果

3.1 少腹逐瘀湯對大鼠子宮內(nèi)膜TNF-α、IL-6 和IL-8 水平的影響

如表1所示，與對照組比較，模型組大鼠子宮內(nèi)膜TNF-α、IL-6 和IL-8 水平均顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，各給藥組大鼠子宮內(nèi)膜TNF-α、IL-6 和IL-8 水平均顯著降低（P＜0.05），且少腹逐瘀湯呈劑量相關(guān)性。

表1 少腹逐瘀湯對大鼠子宮內(nèi)膜TNF-α、IL-6 和IL-8 水平的影響 (±s)Table 1 Effect of Shaofu Zhuyu Decoction on TNF-α,IL-6,and IL-8 levels in endometrium of rats (±s)

表1 少腹逐瘀湯對大鼠子宮內(nèi)膜TNF-α、IL-6 和IL-8 水平的影響 (±s)Table 1 Effect of Shaofu Zhuyu Decoction on TNF-α,IL-6,and IL-8 levels in endometrium of rats (±s)

與對照組比較：*P＜0.05；與模型組比較：△P＜0.05；與戊酸雌二醇組比較：■P＜0.05；與少腹逐瘀湯（144 mg·kg?1）組比較：▲P＜0.05，下表同*P < 0.05 vs control group; △P < 0.05 vs model group; ■P < 0.05 vs estradiol valerate group; ▲P < 0.05 vs Shaofu Zhuyu Decoction (144 mg·kg?1)group,same as below tables

組別 劑量/(mg·kg?1) n/只 TNF-α/(ng·L?1) IL-6/(ng·L?1) IL-8/(ng·L?1)對照 — 10 122.63±25.63 35.66±5.22 112.63±15.74模型 — 9 240.55±30.06* 80.34±4.24* 240.66±21.15*戊酸雌二醇 000.27 9 178.44±24.16△ 53.62±4.15△ 135.24±20.11△少腹逐瘀湯 144 9 198.66±24.35△■ 60.41±3.52△■ 157.96±21.05△■288 9 172.15±25.03△■▲ 45.12±3.85△■▲ 127.54±15.99△■▲

3.2 少腹逐瘀湯對大鼠子宮內(nèi)膜ROS 和丙二醛水平的影響

如表2所示，與對照組比較，模型組大鼠子宮內(nèi)膜ROS 和丙二醛水平均顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，各給藥組大鼠子宮內(nèi)膜ROS 和丙二醛水平均顯著降低（P＜0.05），且少腹逐瘀湯呈劑量相關(guān)性。

3.3 少腹逐瘀湯對大鼠胚胎著床率和平均胚泡著床數(shù)的影響

如表3所示，與對照組比較，模型組大鼠胚胎著床率、平均胚泡著床數(shù)顯著降低（P＜0.05）；與模型組比較，各給藥組大鼠大鼠胚胎著床率、平均胚泡著床數(shù)均顯著升高（P＜0.05），且少腹逐瘀湯呈劑量相關(guān)性。

3.4 少腹逐瘀湯對大鼠子宮內(nèi)膜病理變化的影響

如圖1所示，對照組大鼠子宮內(nèi)膜組織較完整，內(nèi)膜、肌層及外膜結(jié)構(gòu)清晰，子宮腺上皮細胞核大、圓，形態(tài)無異常，肌層肌纖維排列整齊、緊密。模型組大鼠子宮內(nèi)膜增生明顯，細胞成分增多，部分上皮細胞壞死，子宮腺排列稀疏，固有層間質(zhì)內(nèi)存在炎性細胞浸潤。各給藥組大鼠子宮內(nèi)膜組織較為完整，少量子宮內(nèi)膜上皮細胞空泡變性，腺上皮細胞排列較為規(guī)則，固有層間質(zhì)內(nèi)炎性細胞浸潤減少，肌層肌纖維排列較整齊，尤以少腹逐瘀湯高劑量組改善作用更顯著。

3.5 少腹逐瘀湯對大鼠子宮腺體數(shù)、子宮血管數(shù)和子宮內(nèi)膜厚度的影響

如表4所示，與對照組比較，模型組大鼠子宮腺體數(shù)、子宮血管數(shù)、子宮內(nèi)膜厚度均顯著降低（P＜0.05）；與模型組比較，各給藥組大鼠子宮腺體數(shù)、子宮血管數(shù)、子宮內(nèi)膜厚度均顯著升高（P＜0.05），且少腹逐瘀湯呈劑量相關(guān)性。

表2 少腹逐瘀湯對大鼠子宮內(nèi)膜ROS 和丙二醛水平的影響 (±s)Table 2 Effect of Shaofu Zhuyu Decoction on ROS and malondialdehyde levels in endometrium of rats (±s)

表2 少腹逐瘀湯對大鼠子宮內(nèi)膜ROS 和丙二醛水平的影響 (±s)Table 2 Effect of Shaofu Zhuyu Decoction on ROS and malondialdehyde levels in endometrium of rats (±s)

組別 劑量/(mg·kg?1) n/只 ROS/(U·mL?1) 丙二醛/(μmol·L?1)對照 — 10 180.03±16.32 03.13±1.02模型 — 9 258.16±19.62* 10.58±1.55*戊酸雌二醇 000.27 9 216.58±16.05△ 05.55±1.11△少腹逐瘀湯 144 9 235.74±18.55△■ 07.84±1.27△■288 9 200.54±15.75△■▲ 05.12±1.03△■▲

表3 少腹逐瘀湯對大鼠胚胎著床率和平均胚泡著床數(shù)的影響 (±s)Table 3 Effect of Shaofu Zhuyu Decoction on embryo implantation rate and average number of blastocyst implantation of rats (±s)

表3 少腹逐瘀湯對大鼠胚胎著床率和平均胚泡著床數(shù)的影響 (±s)Table 3 Effect of Shaofu Zhuyu Decoction on embryo implantation rate and average number of blastocyst implantation of rats (±s)

組別 劑量/(mg·kg?1) n/只 胚胎著床率/% 平均胚泡著床數(shù)目/個對照 — 10 100.00 13.55±0.42模型 — 9 033.33* 08.46±0.31*戊酸雌二醇 000.27 9 055.56△ 11.56±0.43△少腹逐瘀湯 144 9 044.44△■ 10.22±0.42△■288 9 088.89△■▲ 12.05±0.38△■▲

圖1 少腹逐瘀湯對大鼠子宮內(nèi)膜病理變化的影響 (HE,×100)Fig.1 Effect of Shaofu Zhuyu Decoction on pathological change of endometrium in rats (HE,× 100)

表4 少腹逐瘀湯對大鼠子宮腺體數(shù)、子宮血管數(shù)和子宮內(nèi)膜厚度的影響 (±s)Table 4 Effect of Shaofu Zhuyu Decoction on number of uterine glands,uterine blood vessels and endometrial thickness in rats (±s)

表4 少腹逐瘀湯對大鼠子宮腺體數(shù)、子宮血管數(shù)和子宮內(nèi)膜厚度的影響 (±s)Table 4 Effect of Shaofu Zhuyu Decoction on number of uterine glands,uterine blood vessels and endometrial thickness in rats (±s)

組別 劑量/(mg·kg?1) n/只 子宮腺體數(shù)目/個 子宮血管數(shù)目/個 子宮內(nèi)膜厚度/mm對照 — 10 2.85±0.65 4.12±0.84 415.25±33.65模型 — 9 1.01±0.41* 1.52±0.76* 294.84±37.15*戊酸雌二醇 000.27 9 1.98±0.45△ 3.45±0.89△ 371.05±35.78△少腹逐瘀湯 144 9 1.69±0.55△■ 3.02±0.81△■ 324.15±36.15△■288 9 2.24±0.56△■▲ 3.72±0.91△■▲ 395.84±38.55△■▲

3.6 少腹逐瘀湯對大鼠子宮內(nèi)膜VEGF 和KDR 蛋白表達的影響

如圖2和表5所示，與對照組比較，模型組大鼠子宮內(nèi)膜VEGF 和KDR 蛋白表達水平顯著降低（P＜0.05）；與模型組比較，各給藥組大鼠子宮內(nèi)膜VEGF和KDR 蛋白表達水平均顯著升高（P＜0.05），且少腹逐瘀湯呈劑量相關(guān)性。

4 討論

圖2 少腹逐瘀湯對大鼠子宮內(nèi)膜VEGF 和KDR 蛋白表達的影響Fig.2 Effect of Shaofu Zhuyu Decoction on expressions of VEGF and KDR in endometrium of rats

表5 少腹逐瘀湯對大鼠子宮內(nèi)膜VEGF 和KDR 蛋白表達的影響 (±s)Table 5 Effect of Shaofu Zhuyu Decoction on expressions of VEGF and KDR in endometrium of rats (±s)

表5 少腹逐瘀湯對大鼠子宮內(nèi)膜VEGF 和KDR 蛋白表達的影響 (±s)Table 5 Effect of Shaofu Zhuyu Decoction on expressions of VEGF and KDR in endometrium of rats (±s)

蛋白相對表達量組別 劑量/(mg·kg?1) n/只 VEGF KDR對照 — 10 0.58±0.08 0.55±0.05模型 — 9 0.13±0.09* 0.10±0.08*戊酸雌二醇 000.27 9 0.35±0.09△ 0.30±0.09△少腹逐瘀湯 144 9 0.31±0.08△■ 0.28±0.09△■288 9 0.45±0.08△■▲ 0.44±0.09△■▲

近年來，隨著生殖醫(yī)學(xué)快速發(fā)展，特別是體外受精-胚胎移植技術(shù)的不斷完善，較多不孕夫婦生育問題得到解決，但不孕癥患者臨床妊娠率仍為30%～40%[7]。胚胎植入失敗是影響臨床妊娠率的關(guān)鍵，子宮內(nèi)膜容受性不良是其常見誘因之一[8-9]。目前臨床尚無有效治療子宮內(nèi)膜容受性不良的方法[10-12]。中醫(yī)認為，子宮內(nèi)膜容受性不良病因復(fù)雜，包括氣血虧虛、氣滯血瘀、腎氣不足、任沖二脈失養(yǎng)、胞脈瘀滯等，其中血瘀證尤為多見[13]。少腹逐瘀湯為治療婦科疾病的常用方劑，方中小茴香理氣舒肝、散寒止痛，炮姜回陽通脈、溫中散寒，肉桂溫腎助陽，延胡索活血化瘀、理氣舒肝，沒藥消腫生肌、活血祛瘀，赤芍、當歸、川芎、五靈脂等活血行氣、祛瘀散結(jié)，生蒲黃化瘀、通淋、止血，諸藥合用，共奏活血化瘀、溫陽散寒、理氣疏肝之功效。研究表明，少腹逐瘀湯能夠減輕原發(fā)性痛經(jīng)大鼠宮腔組織炎癥反應(yīng)，且可促進子宮內(nèi)膜異位癥大鼠血管新生，營造良好宮腔環(huán)境[14-15]。

本研究發(fā)現(xiàn)，與模型組比較，少腹逐瘀湯組大鼠子宮腺體數(shù)、子宮血管數(shù)、子宮內(nèi)膜厚度均明顯升高，呈劑量相關(guān)性，提示少腹逐瘀湯可改善子宮內(nèi)膜容受性不良大鼠的子宮內(nèi)膜容受性；少腹逐瘀湯組大鼠胚胎著床率、平均胚胎著床數(shù)均明顯升高，提示少腹逐瘀湯可提升大鼠胚胎著床率，與改善子宮內(nèi)膜容受性有關(guān)。子宮內(nèi)膜容受性不良與宮腔局部氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)密切相關(guān)[16]。機體缺氧狀態(tài)時，巨噬細胞分泌TNF-α、IL-6 等炎癥因子，產(chǎn)生免疫排斥作用，影響子宮內(nèi)膜容受性，阻礙胚胎著床。ROS、丙二醛等氧化應(yīng)激指標升高可促進細胞增殖，引發(fā)局部炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致子宮內(nèi)膜容受性降低。本研究結(jié)果顯示，與模型組比較，少腹逐瘀湯組大鼠子宮內(nèi)膜TNF-α、IL-6、IL-8、ROS、丙二醛水平均明顯降低，提示少腹逐瘀湯可減輕子宮內(nèi)膜氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)。董建新等[17]發(fā)現(xiàn)，少腹逐瘀湯中當歸、川芎等具有抗氧化活性，可清除ROS，減輕氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)，與本研究結(jié)果一致。

子宮內(nèi)膜發(fā)育、分化、植入均受血管生成的影響，且與胚泡著床、胎盤形成密切相關(guān)。炎癥、氧化應(yīng)激反應(yīng)可促進子宮內(nèi)膜細胞凋亡，抑制子宮內(nèi)膜及血管發(fā)育，影響血管生成，使子宮內(nèi)膜容受性降低。研究發(fā)現(xiàn)[18]，圍著床期VEGF 表達的升高可促使子宮內(nèi)膜容受性增加，蛻膜化期VEGF 表達的升高可促進早期絨毛血管形成。王健等[19]提出，VEGF 通路不僅可調(diào)控細胞增殖、遷移、分化，還參與炎癥、氧化應(yīng)激、免疫等過程。VEGF 結(jié)合KDR受體后，可介導(dǎo)內(nèi)皮細胞增殖，并促進血管生成[20]。Jing 等[21]發(fā)現(xiàn)，相較于未妊娠組，妊娠組大鼠子宮內(nèi)膜VEGF 表達升高。辛明蔚等[22]發(fā)現(xiàn)，中藥可通過作用于VEGF/KDR 通路調(diào)節(jié)血管生成，減輕炎癥反應(yīng)及氧化應(yīng)激反應(yīng)，提升子宮內(nèi)膜容受性。以上研究表明，子宮內(nèi)膜組織內(nèi)VEGF/KDR 通路的表達，可影響子宮內(nèi)膜容受性和胚胎著床率。本研究結(jié)果顯示，少腹逐瘀湯組大鼠子宮內(nèi)膜VEGF、KDR 蛋白表達水平明顯升高，且呈劑量相關(guān)性，提示少腹逐瘀湯改善大鼠子宮內(nèi)膜容受性、提升胚胎著床率的作用機制可能與調(diào)節(jié)VEGF/KDR 通路、促進血管形成有關(guān)。

綜上所述，少腹逐瘀湯可減輕子宮內(nèi)膜容受性不良大鼠氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)，改善子宮內(nèi)膜容受性，提升胚胎著床率，其作用機制與調(diào)控VEGF/KDR 通路有關(guān)。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突