陳 琳，張 艷，陳 勇*

1.湖北大學(xué) 藥物高通量篩選技術(shù)國家地方聯(lián)合工程研究中心，湖北大學(xué)中藥生物技術(shù)湖北省重點(diǎn)實(shí)驗室，湖北 武漢430062

2.湖北中醫(yī)藥大學(xué)檢驗學(xué)院，湖北 武漢 430065

速效救心丸由川芎、冰片等組成，具有擴(kuò)張冠狀動脈、舒張血管平滑肌、抗心肌缺血、保護(hù)心肌細(xì)胞、抑制粥樣動脈形成、降低血黏度、解痙鎮(zhèn)痛等作用，臨床常用于治療氣滯血瘀型冠心病和心絞痛[1-3]。研究發(fā)現(xiàn)，速效救心丸可改善動脈粥樣硬化大鼠脂質(zhì)代謝紊亂，抑制血管的氧化應(yīng)激與炎癥反應(yīng)，逆轉(zhuǎn)早期粥樣斑塊的形成[4-6]；可抑制動脈粥樣硬化大鼠主動脈管壁基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1（stromal cell-derived factor-1，SDF-1）及其受體CXCR4 的表達(dá)，從而發(fā)揮抗動脈粥樣硬化作用[7]；可調(diào)節(jié)ApoE缺陷小鼠心肌組織金屬蛋白酶與金屬蛋白酶組織抑制因子蛋白表達(dá)的平衡，增加動脈粥樣硬化斑塊的穩(wěn)定性[8]。此外，速效救心丸可緩解氧化損傷，擴(kuò)大冠脈血流量，減少心肌耗氧量，抑制犬心肌梗死面積[9]；缺血損傷導(dǎo)致心肌細(xì)胞線粒體膜上細(xì)胞色素C氧化酶亞基6A2、糖原合酶激酶3β（glycogen synthase kinase 3β，GSK3β）和磷脂酰肌醇-4,5-雙磷酸3-激酶催化亞基α mRNA 表達(dá)水平顯著降低，腺苷酸環(huán)化酶mRNA 表達(dá)水平顯著升高，速效救心丸可顯著逆轉(zhuǎn)心肌細(xì)胞上述指標(biāo)mRNA 表達(dá)水平，改善心肌細(xì)胞功能[10]；速效救心丸可抑制線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔的開放，保護(hù)線粒體膜功能的完整性，減少細(xì)胞色素C 的釋放，降低缺血/再灌注對大鼠心肌細(xì)胞的凋亡作用[11]，也可通過調(diào)節(jié)磷脂肌醇 3-激酶（phosphatidylinositide-3 kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）/GSK3β 通路，抑制低氧誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[12]；速效救心丸可抑制急性冠脈綜合征患者炎癥反應(yīng)，降低血漿纖維蛋白原水平與血小板聚集率，改善病人血管重建術(shù)后的臨床癥狀[13-14]。目前速效救心丸改善心肌缺血的作用機(jī)制尚不明確，本研究探討了速效救心丸對心肌缺血大鼠心肌組織中缺血損傷相關(guān)調(diào)控蛋白表達(dá)的影響，為闡明其改善心肌缺血的作用機(jī)制提供參考。

1 材料

1.1 動物

SPF 級雄性Wistar 大鼠50 只，6 周齡，體質(zhì)量（150±10）g，購自湖北省實(shí)驗動物研究中心，許可證號SCXK（鄂）2015-0018。動物分籠飼養(yǎng)于湖北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院SPF 級動物房，12 h 交替光照，自由飲水?dāng)z食，飼養(yǎng)溫度（22±2）℃，相對濕度（65±5）%。動物實(shí)驗經(jīng)湖北大學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號20170601）。

1.2 藥品與試劑

丙硫氧嘧啶（50 mg/片，批號160101）購自廣東華南藥業(yè)集團(tuán)有限公司；速效救心丸（40 mg/粒，批號616154）購自天津中新藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司；垂體后葉素（6 U/mL，批號160401）購自南京新百藥業(yè)有限公司；高脂飼料（含10%蛋黃粉、2%膽固醇、10%豬油、0.5%膽酸鈉、0.2%丙硫氧嘧啶、77.3%基礎(chǔ)飼料）購自湖北省實(shí)驗動物研究中心；RIPA 裂解液（批號P0013B）、蛋白酶抑制劑PMSF（批號ST506）、上樣緩沖液（批號P0015）、抗體稀釋液（批號010917170306）、化學(xué)發(fā)光液（批號040617170602）購自上海碧云天生物科技有限公司；蛋白酶抑制劑Cocktail（批號15205300）、磷酸酶抑制劑（批號41659200）購自Roche 生物科技公司；BCA 蛋白定量試劑盒（批號SK258368）購自美國Thermo Fisher Scientific 公司；蘇木素-伊紅（HE）染液（批號G1005）購自谷歌生物科技公司；肌酸激酶同工酶（creatine kinase isoenzyme，CK-MB）、心肌肌鈣蛋白T（cardiac troponin T，cTnT）、心肌肌鈣蛋白I（cardiac troponin I，cTnI）、血栓素B2（thromboxane B2，TXB2）、6-酮-前列環(huán)素F-1α（6-ketone-prostacycline F-1α，PGF-1α）和內(nèi)皮素-1（endothelin 1，ET-1）血清檢測試劑盒（批號為20170323）購自南京建成生物科技有限公司；鼠抗小鼠β-actin 單克隆抗體（批號SC-47778）購自Santa 生物科技公司；兔抗大鼠血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）多克隆抗體（批號F05142393）、兔抗大鼠ET-1 多克隆抗體（批號G01182780）、兔抗大鼠內(nèi)皮型一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase，eNOS）多克隆抗體（批號G02251789）、兔抗大鼠低氧誘導(dǎo)因子-1α（hypoxia inducing factor-1α，HIF-1α）多克隆抗體（批號G02101607）、兔抗大鼠蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）多克隆抗體（批號G01230003）、兔抗大鼠磷酸化Akt（p-Akt）多克隆抗體（批號15090820）購自沈陽萬類生物科技公司；PVDF 膜購自Millipore生物科技有限公司；HRP 標(biāo)記的羊抗兔及羊抗小鼠IgG 抗體（批號分別為10312942、10283379）購自KPL 生物科技有限公司。

1.3 儀器

iMARKTM 酶標(biāo)儀（美國BIO-RAD 公司）；Pannoramic MIDI 病理切片掃描儀配分析軟件Image-pro-plus 6.0（匈牙利3D Histech 公司）；5810R臺式低溫高速離心機(jī)（德國Eppendorf 公司）；DYC-40A型垂直電泳槽、電轉(zhuǎn)儀（中國北京六一儀器廠）。

2 方法

2.1 心肌缺血模型的制備、分組與給藥

小鼠ig 速效救心丸的半數(shù)致死量（lethal dose，LD50）為15.7 g/kg，折算成大鼠ig 速效救心丸的LD50為10.9 g/kg[15]。大鼠隨機(jī)分為對照組、模型組及速效救心丸低、中、高劑量（250、500、1000 mg/kg，相當(dāng)于大鼠LD50值的1/40、1/20、1/10）組，每組10 只。對照組以普通飼料飼養(yǎng)，其余各組以高脂飼料飼養(yǎng)24 周。速效救心丸混懸于0.5% CMC-Na，分別配制成質(zhì)量濃度為25、50、100 mg/mL 的溶液。第24 周，各給藥組ig 相應(yīng)藥物（10 mL/kg），對照組與模型組ig 0.5% CMC-Na 溶液，1 次/d，連續(xù)7 d。給藥第5 天，模型組與各給藥組ip 垂體后葉素（30 U/kg），1 次/d，連續(xù)3 d[16]。最后一次ip 垂體后葉素后，腹主動脈取血，分離血清備用；大鼠脫頸椎處死，心臟灌流后取心臟組織。

2.2 速效救心丸對心肌缺血大鼠心肌組織病理變化的影響

心臟組織固定于多聚甲醛中24 h，依次用梯度乙醇脫水，經(jīng)無水乙醇和二甲苯處理10 min 使組織透明；浸蠟處理1 h，用包埋機(jī)進(jìn)行包埋，并切成5 μm 厚度的切片；于40 ℃水浴展開切片并負(fù)載于防脫載玻片，于60 ℃烘干后依次經(jīng)蘇木素染色8 min和伊紅染液染色2 min，最后用中性樹膠封片。于顯微鏡下觀察并拍照。

2.3 速效救心丸對心肌缺血大鼠血清關(guān)鍵指標(biāo)的影響

按照試劑盒說明書測定大鼠血清中CK-MB、TXB2、cTnT、cTnI、PGF-1α、ET-1 水平。

2.4 速效救心丸對心肌缺血大鼠心肌關(guān)鍵蛋白表達(dá)的影響

心臟組織經(jīng)液氮冷凍后敲碎，取50 mg 心臟組織加入500 μL RIPA 裂解液（含PMSF、Cocktail、磷酸酶抑制劑），4 ℃裂解30 min 后，4 ℃、12 000×g離心10 min，取上清液測定蛋白含量。取50 μg 心臟組織總蛋白加入適量上樣緩沖液混勻，100 ℃變性處理10 min 后，于?80 ℃保存?zhèn)溆?。蛋白樣品?jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)至PVDF 膜，室溫封閉2 h，分別加入ET-1、VEGF、eNOS、HIF-1α、Akt、p-Akt、β-actin 抗體（1∶1000），4 ℃孵育過夜；加入HRP 標(biāo)記的羊抗兔IgG 抗體（1∶1000），室溫孵育1.5 h。加入化學(xué)發(fā)光液顯色后暗室曝光，采用Image J 軟件對蛋白條帶進(jìn)行掃描和定量分析。

2.5 統(tǒng)計分析

實(shí)驗數(shù)據(jù)以±s表示，采用SPSS 軟件對實(shí)驗數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，對各組數(shù)據(jù)進(jìn)行方差齊性檢驗后，進(jìn)行各組數(shù)據(jù)間的t檢驗。

3 結(jié)果

3.1 速效救心丸對心肌缺血大鼠心肌組織病理變化的影響

如圖1所示，對照組大鼠心肌細(xì)胞橫切面呈圓形，細(xì)胞核位于細(xì)胞中間，形態(tài)結(jié)構(gòu)正常。與對照組相比，模型組大鼠心肌細(xì)胞間質(zhì)有充血和炎性細(xì)胞浸潤現(xiàn)象，中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞及淋巴細(xì)胞增多，有少量紅細(xì)胞漏出，表現(xiàn)出急性炎癥反應(yīng)；此外，模型組還存在明顯的細(xì)胞萎縮，表現(xiàn)為細(xì)胞體積減少、細(xì)胞核變小、細(xì)胞間質(zhì)水腫增寬，偶有細(xì)胞壞死與細(xì)胞核消失；合并心肌細(xì)胞橫向斷裂，提示存在心肌缺血損傷。與模型組相比，各給藥組心肌細(xì)胞間質(zhì)充血和炎性細(xì)胞浸潤現(xiàn)象有所緩解，中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞數(shù)量以及紅細(xì)胞漏出較少；此外，細(xì)胞萎縮和細(xì)胞核變小的比例降低，細(xì)胞間質(zhì)水腫增寬程度、細(xì)胞壞死、細(xì)胞核消失及心肌細(xì)胞橫向斷裂現(xiàn)象亦明顯減少，速效救心丸高劑量組效果最佳。

圖1 速效救心丸對心肌缺血大鼠心肌組織病理變化的影響 (HE,×100)Fig.1 Effect of Suxiao Jiuxin Pill on pathological changes of myocardiac tissues in myocardial ischemia rats model (HE,× 100)

3.2 速效救心丸對心肌缺血大鼠血清關(guān)鍵指標(biāo)的影響

血清中CK-MB、cTnT、cTnI 水平是臨床評價心肌缺血的重要指標(biāo)，TXB2、PGF-1α、ET-1 水平是臨床評價心肌梗死的重要指標(biāo)。如表1所示，與對照組比較，模型組大鼠血清中CK-MB、cTnT、cTnI、TXB2、PGF-1α、ET-1 水平顯著升高（P＜0.05），表明造模成功。與模型組比較，速效救心丸中、高劑量組大鼠血清中CK-MB、cTnT、cTnI、PGF-1α、ET-1 水平均顯著降低（P＜0.05），高劑量組大鼠血清中TXB2水平顯著降低（P＜0.05），表明速效救心丸可有效降低模型大鼠發(fā)生心肌缺血與梗死的風(fēng)險。

3.3 速效救心丸對心肌缺血大鼠心肌關(guān)鍵蛋白表達(dá)的影響

如圖2所示，與對照組比較，模型組大鼠心臟組織中HIF-1α、VEGF 和ET-1 蛋白表達(dá)水平均顯著升高（P＜0.05、0.01），p-Akt/Akt 和eNOS 蛋白表達(dá)水平均顯著降低（P＜0.05）；與模型組比較，速效救心丸高劑量組心臟組織中HIF-1α、VEGF 和ET-1 蛋白表達(dá)水平均顯著降低（P＜0.05、0.01），p-Akt/Akt和eNOS 蛋白表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05）；中劑量組心臟組織中HIF-1α、ET-1 蛋白表達(dá)水平均顯著降低（P＜0.05），p-Akt/Akt 蛋白表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05）；低劑量組心臟組織中ET-1 蛋白表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05）。表明速效救心丸能改善心肌缺血對上述關(guān)鍵蛋白表達(dá)的影響。

表1 速效救心丸對心肌缺血大鼠血清關(guān)鍵指標(biāo)的影響 (x s,n=6)Table 1 Effect of Suxiao Jiuxin Pill on myocardial ischemia-related key serum indexes in myocardial ischemia rats model(x s,n=6)

圖2 速效救心丸對心肌缺血大鼠心肌關(guān)鍵蛋白表達(dá)的影響 (x s,n=3)Fig.2 Effect of Suxiao Jiuxin Pill on expression of myocardial ischemia-related proteins in myocardiac tissues of myocardial ischemia rats model (x s,n=3)

4 討論

CK-MB 主要分布于心肌，心肌損傷可觸發(fā)其釋放進(jìn)入細(xì)胞外液，提升其血清水平，是早期臨床診斷缺血再灌注損傷的標(biāo)志物，但特異性不高[17]。心肌肌鈣蛋白僅存在于心肌，包括T、I、C 3 種亞基，cTnT 和cTnI是主要的心肌損傷標(biāo)志物。血清中cTnT和cTnI 水平主要用于急性心肌梗死的診斷、不穩(wěn)定型心絞痛的預(yù)后判斷等，已成為臨床上心肌梗死診斷的金標(biāo)準(zhǔn)[18]。血清中TXA2、PGI2水平升高易導(dǎo)致血小板聚集與血栓形成，但二者穩(wěn)定性差，通常檢測其穩(wěn)定代謝物TXB2和PGF-1α 的水平[19]。ET-1 參與調(diào)節(jié)血管收縮、血管重塑、血管生成和細(xì)胞外基質(zhì)合成，其血清水平是判斷冠心病心絞痛嚴(yán)重程度的重要指標(biāo)[20]。研究結(jié)果顯示，速效救心丸可顯著降低心肌缺血大鼠血清中上述指標(biāo)水平，且呈劑量相關(guān)性。結(jié)合心臟組織病理切片結(jié)果，表明速效救心丸對心肌缺血損傷具有明顯預(yù)防作用。

VEGF 與血管生成、血管通透性密切相關(guān)[21]。低氧、低氧預(yù)適應(yīng)是誘導(dǎo)VEGF表達(dá)的重要原因[22]，HIF 通路和PGC-lα 通路是低氧介導(dǎo)VEGF 形成大腦新血管的重要通路[23-24]。HIF 是低氧反應(yīng)的中心介質(zhì)，其中HIF-1 對缺血壞死后新生血管的形成和低氧誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡起關(guān)鍵調(diào)控作用[25]。HIF-1 由α、β 亞單位組成，其中α 亞單位是其特異性蛋白，對體內(nèi)氧含量敏感，低氧能誘導(dǎo)HIF-1α 蛋白表達(dá)。VEGF 是HIF-1α 的重要靶點(diǎn)之一，腦缺氧后HIF-1α表達(dá)上調(diào)，誘導(dǎo)VEGF 蛋白表達(dá)，促進(jìn)微循環(huán)重建，增加缺血組織血流灌注和供氧量[26]。內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生的NO和ET-1對維持基礎(chǔ)血管張力與心血管系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)起重要作用，其表達(dá)異常是引起心肌缺血等心血管疾病的重要因素[27-28]。VEGF 可通過活化磷脂酶Cγ 促進(jìn)前列腺素的生成，提高血管通透性；也可作為eNOS 的上游激活物，通過Akt 促進(jìn)一氧化氮（nitric oxide，NO）合成與內(nèi)皮細(xì)胞增生，增加細(xì)胞通透性[29]。研究表明，PI3K/Akt 信號通路的激活是缺血后機(jī)體的保護(hù)機(jī)制之一，eNOS 是該途徑的下游靶點(diǎn)[30]。在內(nèi)皮細(xì)胞中，VEGF 可通過激活NO 下游效應(yīng)物PI3K、Akt 和eNOS，從而調(diào)控NO 的生成[31]。NO 和HIF-1 信號通路間高度串?dāng)_[32]，如在活化的巨噬細(xì)胞和近端小管細(xì)胞共培養(yǎng)系統(tǒng)中，NO 可調(diào)節(jié)缺氧及炎癥下的HIF-1α 累積反應(yīng)[33]，HIF-1 可通過誘導(dǎo)心肌細(xì)胞中誘導(dǎo)型一氧化氮合酶和細(xì)胞色素C 氧化酶亞單位4-2 mRNA 和蛋白表達(dá)水平，同時降低eNOS mRNA 和蛋白表達(dá)水平，協(xié)同調(diào)控NO 的生成[34]。HIF-NO 信號通路對減少缺血再灌注誘導(dǎo)的氧化損傷和梗死面積有著重要作用[35-36]。

如圖3所示，心腦缺血相關(guān)蛋白VEGF、HIF-1α、p-Akt、eNOS 與HIF-1 信號通路密切相關(guān)，且相互間調(diào)控關(guān)系密切。本研究發(fā)現(xiàn)，速效救心丸能夠顯著降低心肌缺血大鼠心肌HIF-1α、VEGF 和ET-1的蛋白表達(dá)水平，升高p-Akt 和eNOS 蛋白表達(dá)水平，呈劑量相關(guān)性，表明速效救心丸改善心肌缺血損傷的作用機(jī)制與其調(diào)控上述關(guān)鍵蛋白表達(dá)相關(guān)，且受HIF-1 信號通路調(diào)控。

圖3 心腦缺血相關(guān)蛋白與HIF-1 信號通路的聯(lián)系Fig.3 Relationship between cardiac and cerebral ischemia-related proteins and HIF-1 signaling pathway

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突