陳 琳，張 艷，陳 勇*

1.湖北大學(xué) 藥物高通量篩選技術(shù)國家地方聯(lián)合工程研究中心，湖北大學(xué)中藥生物技術(shù)湖北省重點實驗室，湖北 武漢430062

2.湖北中醫(yī)藥大學(xué)檢驗學(xué)院，湖北 武漢 430065

速效救心丸由川芎、冰片等組成，具有擴張冠狀動脈、舒張血管平滑肌、抗心肌缺血、保護心肌細胞、抑制粥樣動脈形成、降低血黏度、解痙鎮(zhèn)痛等作用，臨床常用于治療氣滯血瘀型冠心病和心絞痛[1-3]。研究發(fā)現(xiàn)，速效救心丸可改善動脈粥樣硬化大鼠脂質(zhì)代謝紊亂，抑制血管的氧化應(yīng)激與炎癥反應(yīng)，逆轉(zhuǎn)早期粥樣斑塊的形成[4-6]；可抑制動脈粥樣硬化大鼠主動脈管壁基質(zhì)細胞衍生因子-1（stromal cell-derived factor-1，SDF-1）及其受體CXCR4 的表達，從而發(fā)揮抗動脈粥樣硬化作用[7]；可調(diào)節(jié)ApoE缺陷小鼠心肌組織金屬蛋白酶與金屬蛋白酶組織抑制因子蛋白表達的平衡，增加動脈粥樣硬化斑塊的穩(wěn)定性[8]。此外，速效救心丸可緩解氧化損傷，擴大冠脈血流量，減少心肌耗氧量，抑制犬心肌梗死面積[9]；缺血損傷導(dǎo)致心肌細胞線粒體膜上細胞色素C氧化酶亞基6A2、糖原合酶激酶3β（glycogen synthase kinase 3β，GSK3β）和磷脂酰肌醇-4,5-雙磷酸3-激酶催化亞基α mRNA 表達水平顯著降低，腺苷酸環(huán)化酶mRNA 表達水平顯著升高，速效救心丸可顯著逆轉(zhuǎn)心肌細胞上述指標mRNA 表達水平，改善心肌細胞功能[10]；速效救心丸可抑制線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔的開放，保護線粒體膜功能的完整性，減少細胞色素C 的釋放，降低缺血/再灌注對大鼠心肌細胞的凋亡作用[11]，也可通過調(diào)節(jié)磷脂肌醇 3-激酶（phosphatidylinositide-3 kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）/GSK3β 通路，抑制低氧誘導(dǎo)的細胞凋亡[12]；速效救心丸可抑制急性冠脈綜合征患者炎癥反應(yīng)，降低血漿纖維蛋白原水平與血小板聚集率，改善病人血管重建術(shù)后的臨床癥狀[13-14]。目前速效救心丸改善心肌缺血的作用機制尚不明確，本研究探討了速效救心丸對心肌缺血大鼠心肌組織中缺血損傷相關(guān)調(diào)控蛋白表達的影響，為闡明其改善心肌缺血的作用機制提供參考。

1 材料

1.1 動物

SPF 級雄性Wistar 大鼠50 只，6 周齡，體質(zhì)量（150±10）g，購自湖北省實驗動物研究中心，許可證號SCXK（鄂）2015-0018。動物分籠飼養(yǎng)于湖北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院SPF 級動物房，12 h 交替光照，自由飲水攝食，飼養(yǎng)溫度（22±2）℃，相對濕度（65±5）%。動物實驗經(jīng)湖北大學(xué)倫理委員會批準（批準號20170601）。

1.2 藥品與試劑

丙硫氧嘧啶（50 mg/片，批號160101）購自廣東華南藥業(yè)集團有限公司；速效救心丸（40 mg/粒，批號616154）購自天津中新藥業(yè)集團股份有限公司；垂體后葉素（6 U/mL，批號160401）購自南京新百藥業(yè)有限公司；高脂飼料（含10%蛋黃粉、2%膽固醇、10%豬油、0.5%膽酸鈉、0.2%丙硫氧嘧啶、77.3%基礎(chǔ)飼料）購自湖北省實驗動物研究中心；RIPA 裂解液（批號P0013B）、蛋白酶抑制劑PMSF（批號ST506）、上樣緩沖液（批號P0015）、抗體稀釋液（批號010917170306）、化學(xué)發(fā)光液（批號040617170602）購自上海碧云天生物科技有限公司；蛋白酶抑制劑Cocktail（批號15205300）、磷酸酶抑制劑（批號41659200）購自Roche 生物科技公司；BCA 蛋白定量試劑盒（批號SK258368）購自美國Thermo Fisher Scientific 公司；蘇木素-伊紅（HE）染液（批號G1005）購自谷歌生物科技公司；肌酸激酶同工酶（creatine kinase isoenzyme，CK-MB）、心肌肌鈣蛋白T（cardiac troponin T，cTnT）、心肌肌鈣蛋白I（cardiac troponin I，cTnI）、血栓素B2（thromboxane B2，TXB2）、6-酮-前列環(huán)素F-1α（6-ketone-prostacycline F-1α，PGF-1α）和內(nèi)皮素-1（endothelin 1，ET-1）血清檢測試劑盒（批號為20170323）購自南京建成生物科技有限公司；鼠抗小鼠β-actin 單克隆抗體（批號SC-47778）購自Santa 生物科技公司；兔抗大鼠血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）多克隆抗體（批號F05142393）、兔抗大鼠ET-1 多克隆抗體（批號G01182780）、兔抗大鼠內(nèi)皮型一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase，eNOS）多克隆抗體（批號G02251789）、兔抗大鼠低氧誘導(dǎo)因子-1α（hypoxia inducing factor-1α，HIF-1α）多克隆抗體（批號G02101607）、兔抗大鼠蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）多克隆抗體（批號G01230003）、兔抗大鼠磷酸化Akt（p-Akt）多克隆抗體（批號15090820）購自沈陽萬類生物科技公司；PVDF 膜購自Millipore生物科技有限公司；HRP 標記的羊抗兔及羊抗小鼠IgG 抗體（批號分別為10312942、10283379）購自KPL 生物科技有限公司。

1.3 儀器

iMARKTM 酶標儀（美國BIO-RAD 公司）；Pannoramic MIDI 病理切片掃描儀配分析軟件Image-pro-plus 6.0（匈牙利3D Histech 公司）；5810R臺式低溫高速離心機（德國Eppendorf 公司）；DYC-40A型垂直電泳槽、電轉(zhuǎn)儀（中國北京六一儀器廠）。

2 方法

2.1 心肌缺血模型的制備、分組與給藥

小鼠ig 速效救心丸的半數(shù)致死量（lethal dose，LD50）為15.7 g/kg，折算成大鼠ig 速效救心丸的LD50為10.9 g/kg[15]。大鼠隨機分為對照組、模型組及速效救心丸低、中、高劑量（250、500、1000 mg/kg，相當于大鼠LD50值的1/40、1/20、1/10）組，每組10 只。對照組以普通飼料飼養(yǎng)，其余各組以高脂飼料飼養(yǎng)24 周。速效救心丸混懸于0.5% CMC-Na，分別配制成質(zhì)量濃度為25、50、100 mg/mL 的溶液。第24 周，各給藥組ig 相應(yīng)藥物（10 mL/kg），對照組與模型組ig 0.5% CMC-Na 溶液，1 次/d，連續(xù)7 d。給藥第5 天，模型組與各給藥組ip 垂體后葉素（30 U/kg），1 次/d，連續(xù)3 d[16]。最后一次ip 垂體后葉素后，腹主動脈取血，分離血清備用；大鼠脫頸椎處死，心臟灌流后取心臟組織。

2.2 速效救心丸對心肌缺血大鼠心肌組織病理變化的影響

心臟組織固定于多聚甲醛中24 h，依次用梯度乙醇脫水，經(jīng)無水乙醇和二甲苯處理10 min 使組織透明；浸蠟處理1 h，用包埋機進行包埋，并切成5 μm 厚度的切片；于40 ℃水浴展開切片并負載于防脫載玻片，于60 ℃烘干后依次經(jīng)蘇木素染色8 min和伊紅染液染色2 min，最后用中性樹膠封片。于顯微鏡下觀察并拍照。

2.3 速效救心丸對心肌缺血大鼠血清關(guān)鍵指標的影響

按照試劑盒說明書測定大鼠血清中CK-MB、TXB2、cTnT、cTnI、PGF-1α、ET-1 水平。

2.4 速效救心丸對心肌缺血大鼠心肌關(guān)鍵蛋白表達的影響

心臟組織經(jīng)液氮冷凍后敲碎，取50 mg 心臟組織加入500 μL RIPA 裂解液（含PMSF、Cocktail、磷酸酶抑制劑），4 ℃裂解30 min 后，4 ℃、12 000×g離心10 min，取上清液測定蛋白含量。取50 μg 心臟組織總蛋白加入適量上樣緩沖液混勻，100 ℃變性處理10 min 后，于?80 ℃保存?zhèn)溆?。蛋白樣品?jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)至PVDF 膜，室溫封閉2 h，分別加入ET-1、VEGF、eNOS、HIF-1α、Akt、p-Akt、β-actin 抗體（1∶1000），4 ℃孵育過夜；加入HRP 標記的羊抗兔IgG 抗體（1∶1000），室溫孵育1.5 h。加入化學(xué)發(fā)光液顯色后暗室曝光，采用Image J 軟件對蛋白條帶進行掃描和定量分析。

2.5 統(tǒng)計分析

實驗數(shù)據(jù)以±s表示，采用SPSS 軟件對實驗數(shù)據(jù)進行分析，對各組數(shù)據(jù)進行方差齊性檢驗后，進行各組數(shù)據(jù)間的t檢驗。

3 結(jié)果

3.1 速效救心丸對心肌缺血大鼠心肌組織病理變化的影響

如圖1所示，對照組大鼠心肌細胞橫切面呈圓形，細胞核位于細胞中間，形態(tài)結(jié)構(gòu)正常。與對照組相比，模型組大鼠心肌細胞間質(zhì)有充血和炎性細胞浸潤現(xiàn)象，中性粒細胞、巨噬細胞及淋巴細胞增多，有少量紅細胞漏出，表現(xiàn)出急性炎癥反應(yīng)；此外，模型組還存在明顯的細胞萎縮，表現(xiàn)為細胞體積減少、細胞核變小、細胞間質(zhì)水腫增寬，偶有細胞壞死與細胞核消失；合并心肌細胞橫向斷裂，提示存在心肌缺血損傷。與模型組相比，各給藥組心肌細胞間質(zhì)充血和炎性細胞浸潤現(xiàn)象有所緩解，中性粒細胞、巨噬細胞、淋巴細胞數(shù)量以及紅細胞漏出較少；此外，細胞萎縮和細胞核變小的比例降低，細胞間質(zhì)水腫增寬程度、細胞壞死、細胞核消失及心肌細胞橫向斷裂現(xiàn)象亦明顯減少，速效救心丸高劑量組效果最佳。

圖1 速效救心丸對心肌缺血大鼠心肌組織病理變化的影響 (HE,×100)Fig.1 Effect of Suxiao Jiuxin Pill on pathological changes of myocardiac tissues in myocardial ischemia rats model (HE,× 100)

3.2 速效救心丸對心肌缺血大鼠血清關(guān)鍵指標的影響

血清中CK-MB、cTnT、cTnI 水平是臨床評價心肌缺血的重要指標，TXB2、PGF-1α、ET-1 水平是臨床評價心肌梗死的重要指標。如表1所示，與對照組比較，模型組大鼠血清中CK-MB、cTnT、cTnI、TXB2、PGF-1α、ET-1 水平顯著升高（P＜0.05），表明造模成功。與模型組比較，速效救心丸中、高劑量組大鼠血清中CK-MB、cTnT、cTnI、PGF-1α、ET-1 水平均顯著降低（P＜0.05），高劑量組大鼠血清中TXB2水平顯著降低（P＜0.05），表明速效救心丸可有效降低模型大鼠發(fā)生心肌缺血與梗死的風險。

3.3 速效救心丸對心肌缺血大鼠心肌關(guān)鍵蛋白表達的影響

如圖2所示，與對照組比較，模型組大鼠心臟組織中HIF-1α、VEGF 和ET-1 蛋白表達水平均顯著升高（P＜0.05、0.01），p-Akt/Akt 和eNOS 蛋白表達水平均顯著降低（P＜0.05）；與模型組比較，速效救心丸高劑量組心臟組織中HIF-1α、VEGF 和ET-1 蛋白表達水平均顯著降低（P＜0.05、0.01），p-Akt/Akt和eNOS 蛋白表達水平顯著升高（P＜0.05）；中劑量組心臟組織中HIF-1α、ET-1 蛋白表達水平均顯著降低（P＜0.05），p-Akt/Akt 蛋白表達水平顯著升高（P＜0.05）；低劑量組心臟組織中ET-1 蛋白表達水平顯著降低（P＜0.05）。表明速效救心丸能改善心肌缺血對上述關(guān)鍵蛋白表達的影響。

表1 速效救心丸對心肌缺血大鼠血清關(guān)鍵指標的影響 (x s,n=6)Table 1 Effect of Suxiao Jiuxin Pill on myocardial ischemia-related key serum indexes in myocardial ischemia rats model(x s,n=6)

圖2 速效救心丸對心肌缺血大鼠心肌關(guān)鍵蛋白表達的影響 (x s,n=3)Fig.2 Effect of Suxiao Jiuxin Pill on expression of myocardial ischemia-related proteins in myocardiac tissues of myocardial ischemia rats model (x s,n=3)

4 討論

CK-MB 主要分布于心肌，心肌損傷可觸發(fā)其釋放進入細胞外液，提升其血清水平，是早期臨床診斷缺血再灌注損傷的標志物，但特異性不高[17]。心肌肌鈣蛋白僅存在于心肌，包括T、I、C 3 種亞基，cTnT 和cTnI是主要的心肌損傷標志物。血清中cTnT和cTnI 水平主要用于急性心肌梗死的診斷、不穩(wěn)定型心絞痛的預(yù)后判斷等，已成為臨床上心肌梗死診斷的金標準[18]。血清中TXA2、PGI2水平升高易導(dǎo)致血小板聚集與血栓形成，但二者穩(wěn)定性差，通常檢測其穩(wěn)定代謝物TXB2和PGF-1α 的水平[19]。ET-1 參與調(diào)節(jié)血管收縮、血管重塑、血管生成和細胞外基質(zhì)合成，其血清水平是判斷冠心病心絞痛嚴重程度的重要指標[20]。研究結(jié)果顯示，速效救心丸可顯著降低心肌缺血大鼠血清中上述指標水平，且呈劑量相關(guān)性。結(jié)合心臟組織病理切片結(jié)果，表明速效救心丸對心肌缺血損傷具有明顯預(yù)防作用。

VEGF 與血管生成、血管通透性密切相關(guān)[21]。低氧、低氧預(yù)適應(yīng)是誘導(dǎo)VEGF表達的重要原因[22]，HIF 通路和PGC-lα 通路是低氧介導(dǎo)VEGF 形成大腦新血管的重要通路[23-24]。HIF 是低氧反應(yīng)的中心介質(zhì)，其中HIF-1 對缺血壞死后新生血管的形成和低氧誘導(dǎo)的細胞凋亡起關(guān)鍵調(diào)控作用[25]。HIF-1 由α、β 亞單位組成，其中α 亞單位是其特異性蛋白，對體內(nèi)氧含量敏感，低氧能誘導(dǎo)HIF-1α 蛋白表達。VEGF 是HIF-1α 的重要靶點之一，腦缺氧后HIF-1α表達上調(diào)，誘導(dǎo)VEGF 蛋白表達，促進微循環(huán)重建，增加缺血組織血流灌注和供氧量[26]。內(nèi)皮細胞產(chǎn)生的NO和ET-1對維持基礎(chǔ)血管張力與心血管系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)起重要作用，其表達異常是引起心肌缺血等心血管疾病的重要因素[27-28]。VEGF 可通過活化磷脂酶Cγ 促進前列腺素的生成，提高血管通透性；也可作為eNOS 的上游激活物，通過Akt 促進一氧化氮（nitric oxide，NO）合成與內(nèi)皮細胞增生，增加細胞通透性[29]。研究表明，PI3K/Akt 信號通路的激活是缺血后機體的保護機制之一，eNOS 是該途徑的下游靶點[30]。在內(nèi)皮細胞中，VEGF 可通過激活NO 下游效應(yīng)物PI3K、Akt 和eNOS，從而調(diào)控NO 的生成[31]。NO 和HIF-1 信號通路間高度串擾[32]，如在活化的巨噬細胞和近端小管細胞共培養(yǎng)系統(tǒng)中，NO 可調(diào)節(jié)缺氧及炎癥下的HIF-1α 累積反應(yīng)[33]，HIF-1 可通過誘導(dǎo)心肌細胞中誘導(dǎo)型一氧化氮合酶和細胞色素C 氧化酶亞單位4-2 mRNA 和蛋白表達水平，同時降低eNOS mRNA 和蛋白表達水平，協(xié)同調(diào)控NO 的生成[34]。HIF-NO 信號通路對減少缺血再灌注誘導(dǎo)的氧化損傷和梗死面積有著重要作用[35-36]。

如圖3所示，心腦缺血相關(guān)蛋白VEGF、HIF-1α、p-Akt、eNOS 與HIF-1 信號通路密切相關(guān)，且相互間調(diào)控關(guān)系密切。本研究發(fā)現(xiàn)，速效救心丸能夠顯著降低心肌缺血大鼠心肌HIF-1α、VEGF 和ET-1的蛋白表達水平，升高p-Akt 和eNOS 蛋白表達水平，呈劑量相關(guān)性，表明速效救心丸改善心肌缺血損傷的作用機制與其調(diào)控上述關(guān)鍵蛋白表達相關(guān)，且受HIF-1 信號通路調(diào)控。

圖3 心腦缺血相關(guān)蛋白與HIF-1 信號通路的聯(lián)系Fig.3 Relationship between cardiac and cerebral ischemia-related proteins and HIF-1 signaling pathway

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突