何 慶，陳萍萍，李 昊，呂沐瀚，梁思成，齊曉怡，熊 霞，葛廣波

1.西南醫(yī)科大學附屬醫(yī)院 皮膚科，四川 瀘州 646000

2.西南醫(yī)科大學附屬醫(yī)院 消化內(nèi)科，四川 瀘州 646000

3.上海中醫(yī)藥大學交叉科學研究院，上海 201203

細胞色素P450 酶1A1（cytochrome P450 1A1，CYP1A1）是人體內(nèi)重要的細胞色素P450 酶。CYP1A1 結(jié)構(gòu)中共含有512 個氨基酸，相對分子質(zhì)量為5.816×104，包含12 個α 螺旋和3 個β 折疊。其中，α 螺旋部分形成了6 個底物識別位點[1]，可選擇性識別、結(jié)合和催化不同類型的化合物[2]。研究表明，CYP1A1 的活性與急慢性炎癥、肺損傷、動脈粥樣硬化、腫瘤等多種疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[3]。CYP1A1 能夠代謝和活化雜環(huán)芳胺、工業(yè)芳胺、多環(huán)芳烴類[4-5]等多種環(huán)境致癌和致突變物質(zhì)，促進DNA 突變并最終形成腫瘤[6]。CYP1A1 介導的前致癌物活化與癌癥的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切，抑制其催化功能是癌癥化學預防的潛在靶點[7-8]。黃酮屬于天然多酚類化合物，廣泛分布于蔬菜、水果、草藥中，至今已發(fā)現(xiàn)上千種不同類型的黃酮類化合物[9]。黃酮類化合物具有保護心血管、抗氧化、抗衰老、調(diào)血脂、調(diào)節(jié)免疫等作用[10]。黃酮類化合物可以抑制CYP1A1 酶的活性[11-14]，降低CYP1A1 介導的前致癌物活化，預防癌癥[15]。然而，黃酮類化合物與CYP1A1 抑制活性的構(gòu)效關(guān)系少見報道。

定量構(gòu)效關(guān)系（quantitative structure-activity relationship，QSAR）是基于配體的計算機輔助藥物設計的主要方法之一，通過對化合物結(jié)構(gòu)特征和生物活性進行定量分析，建立合理的數(shù)學模型，廣泛用于新化合物的活性預測、篩選及設計。3D-QSAR 不僅能夠考察藥物分子不同的構(gòu)型或構(gòu)象對其活性及性質(zhì)的影響，還能夠反映受體與配體的相互作用信息[16]。CoMFA 和CoMSIA 是目前應用最廣泛的三維定量構(gòu)效方法[17-18]。本研究采用第二代CoMFA（Topomer CoMFA）[19-20]構(gòu)建黃酮類化合物與CYP1A1 抑制活性的3D-QSAR 模型，為黃酮類化合物與CYP1A1 抑制活性的構(gòu)效關(guān)系提供參考，并為篩選CYP1A1 抑制劑提供更加快速有效的方法。

1 材料

1.1 藥品與試劑

7,4′-二羥基黃酮（7,4′-dihydroxyflavon，批號AB151809，質(zhì)量分數(shù)為97%）購自德國ABCR 公司；4′,5′-二羥基黃酮（4′,5′-dihydroxyflavone，批號L14161，質(zhì)量分數(shù)為 98%）、5,6-二羥基黃酮（5,6-dihydroxyflavone，批號H27039，質(zhì)量分數(shù)為97%）購自 Alfa Aesar 公司；7,8-二羥基黃酮（7,8-dihydroxyflavone，批號D1916，質(zhì)量分數(shù)＞98%）、6-甲氧基黃酮（6-methoxyflavone，批號M1346，質(zhì)量分數(shù)＞99%）購自TCI 公司；異黃腐酚（isoxanthohumol，批號JOT-11423，質(zhì)量分數(shù)≥98%）、芫花素（5,4′-dihydroxy-methoxyflavone，批號JOT-10632，質(zhì)量分數(shù)≥98%）購自成都普菲德生物技術(shù)有限公司；5,6,7-三甲氧基黃芩素（5,6,7-trimethoxyflavone，批號B29309，質(zhì)量分數(shù)≥97%）購自上海源葉生物科技有限公司；石吊蘭素（lysionotin，批號MB4495，質(zhì)量分數(shù)≥98%）購自美侖生物。

7-乙氧基試鹵靈為課題組自制；葡萄糖-6-磷酸（glucose 6-phosphate，G-6-P）購自美國 Sigma-Aldrich 公司；葡萄糖-6-磷酸脫氫酶（glucose-6-phosphate dehydrogenase，G-6-PDH）、β-煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（ β-nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，β-NADP）、MgCl2購自美侖生物；PBS 緩沖液購自中國醫(yī)藥集團有限公司；CYP1A1 酶（批號8191004）購自Gentest 公司。

1.2 儀器

SpectraMaX M4 酶標儀（上海美谷分子儀器有限公司）；MS-100 型恒溫混勻儀（杭州奧盛儀器有限公司）。

2 方法

2.1 數(shù)據(jù)集來源與能量優(yōu)化

通過查閱相關(guān)文獻，選取50 種已報道的對CYP1A1 有抑制作用的黃酮類化合物，其化學結(jié)構(gòu)與活性數(shù)據(jù)見圖1和表1。CYP1A1 抑制活性采用半數(shù)抑制濃度（ half maximal inhibitory concentration，IC50）表示，為更好地獲得黃酮類化合物的結(jié)構(gòu)與活性之間的線性擬合情況，將其負對數(shù)值pIC50作為模型的因變量。

pIC50＝?lgIC50

圖1 50 種黃酮類化合物的結(jié)構(gòu)Fig.1 Structures of 50 flavonoids

采用Chemoffice 16.0 構(gòu)建化合物的三維結(jié)構(gòu)，導入SYBYL-X2.0 軟件中，在Compute Minimize模塊對化合物進行能量優(yōu)化[21-22]，采用Powell 能量梯度法，選擇Tripos 分子力場，進行優(yōu)化，Gradient設置為 21 J/mol，分子電荷設置為 Gasteiger-Hunckel，最大迭代次數(shù)設置為1000。優(yōu)化完成后將其導入分子表單。

2.2 Topomer CoMFA 模型構(gòu)建

Topomer CoMFA 方法是對傳統(tǒng)CoMFA 方法的一種改進，是CoMFA 與Topomer 技術(shù)的聯(lián)合，能夠在短時間內(nèi)快速、準確預測化合物的活性并構(gòu)建3D-QSAR 模型。將50 個黃酮類化合物按4∶1 分成訓練集和測試集。根據(jù)化合物取代基不同，分為不同類型的結(jié)構(gòu)層，從不同結(jié)構(gòu)層中隨機挑選化合物組成測試集，剩下的化合物為訓練集。以黃酮作為公共骨架，隨機選擇一個分子作為模板，切割分子的方式為“Split into two”，如圖2所示，切出2 個取代基（R1、R2）片段。軟件自動識別剩余的化合物并以相同的方式進行切割，遇到程序不能自動識別的分子，選擇與模板分子盡可能相同的方式手動切割，直至所有的訓練集分子被切割完為止。

Topomer CoMFA 采用偏最小二乘法（partial least squares method，PLS）[23]建模分析，當所有訓練集分子切割完成后，程序會自動計算每個分子片段的立體場和靜電場性質(zhì)，再以立體場和靜電場性質(zhì)描述符為自變量，以訓練集化合物分子的pIC50為因變量構(gòu)建模型。測試集不參與QSAR 模型的建立，僅用于模型的外部驗證，以檢測模型的實際預測能力。

2.3 實驗驗證

采用構(gòu)建的Topomer CoMFA 模型預測9 種黃酮類化合物的CYP1A1 抑制活性。96 孔板中加入100 mmol/L PBS 緩沖液（pH 7.4）及還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（ nicotinamideadenine dinucleotide phosphate，NADPH）產(chǎn)生體系（1 mmol/L NADP＋、10 mmol/L G-6-P、1 U/mL G-6-PDH、4 mmol/L MgCl2）和CYP1A1 酶，總體積為200 μL，輕輕震蕩混合。分別加入樣品或純乙腈，于恒溫混勻儀37 ℃預孵育3 min；加入反應輔因子（β-NADP）起始反應；采用酶標儀連續(xù)監(jiān)測反應10 min。產(chǎn)物試鹵靈激發(fā)波長560 nm，發(fā)射波長590 nm。

2.4 分子對接

采用SYBYL-X2.0 中的Surflex-Dock[24]進行分子對接，對接所使用的蛋白酶晶體結(jié)構(gòu)來源于RCSB PDB 數(shù)據(jù)庫（http://www.rcsb.org/structure/4I8V），晶體結(jié)構(gòu)的PDB ID 為4I8V[1]，對接模式為Surflex-Dock（SFXC）。在對接前對蛋白進行處理，從復合物中提取配體A/BHF602，刪除不需要的配體及所有水分子，給蛋白加氫加Gasteiger-Hückel電荷，設定距離配體分子0.5 nm 范圍內(nèi)的所有氨基酸殘基為活性口袋進行疊合，然后將模板分子1 號化合物與蛋白晶體進行對接。用總打分函數(shù)、配體與受體對接的不適當程度和極性打分函數(shù)評價對接結(jié)果?？偞蚍趾瘮?shù)表示受體與配體的親和能力，打分越高越好；不適當程度的絕對值越接近零，表示配體與受體對接時的不適當程度越??；當結(jié)合位點位于分子表面時，極性打分函數(shù)越高越好，當結(jié)合位點位于分子內(nèi)部時，極性打分函數(shù)越低越好。

表1 50 種黃酮類化合物的結(jié)構(gòu)及活性數(shù)據(jù)Table 1 Structures and pIC50 values of inhibitors used for modeling

圖2 黃酮的分子片段切割示意圖Fig.2 Cutting of flavonoids

3 結(jié)果

3.1 Topomer CoMFA 模型統(tǒng)計結(jié)果分析

對于所建Topomer CoMFA 模型，交互驗證復相關(guān)系數(shù)（q2）、擬合復相關(guān)系數(shù)（r2）和外部驗證相關(guān)系數(shù)（rpred2）越大表示模型的相關(guān)性越好，預測能力越強；q2的標準誤差（q2stderr）、r2的標準誤差（r2stderr）和標準估計偏差（SEE）越小證明模型質(zhì)量越高。當q2＞0.500、r2＞0.600 時，表明建立的模型具有顯著的統(tǒng)計學意義[25-26]，當rpred2＞0.5 表明模型具有較強的外部預測能力[27]。本研究所建模型各參數(shù)如表2所示，模型q2＞0.500，r2＞0.600，表明模型具有較好的擬合與內(nèi)部預測能力，模型rpred2＝0.956 7，表明模型具有較好的外部預測能力。

表2 Topomer CoMFA 的分析結(jié)果Table 2 Statistical results of Topomer CoMFA

采用該模型對訓練集和測試集化合物的活性進行預測，結(jié)果見表1?；衔镉柧毤蜏y試集pIC50實驗值與預測值的線性回歸圖如圖3所示，所有樣本均勻分布在45°直線附近，表明所建模型具有良好的可靠性和預測能力。

3.2 3D-QSAR 分析

Topomer CoMFA 方法構(gòu)建的3D-QSAR 模型構(gòu)建不僅可以獲得模型評價參數(shù)，還可以獲得各取代基的靜電場和立體場三維等勢圖。其中，靜電場等勢圖用紅色和藍色表示，立體場等勢圖用綠色和黃色表示。靜電場中，紅色代表在此區(qū)域引入吸電性基團有利于增大化合物分子的預測活性值，藍色代表在此區(qū)域引入供電性基團有利于增大化合物分子的預測活性值；立體場中，綠色代表在此區(qū)域引入大體積取代基有利于增大化合物分子的預測活性值，相反，黃色代表在此區(qū)域引入小體積取代基有利于增大化合物分子的預測活性值。

圖3 實驗數(shù)據(jù)與預測的pIC50 值之間的線性回歸分析Fig.3 Linear regression between experimental and predicted pIC50 values

以化合物 1（pIC50＝6.01）為模板生成的Topomer CoMFA 模型的各基團靜電場和和立體場三維等勢圖如圖4所示。圖4-A 中，R1分子片段的C-3 附近有一小塊黃色色塊圖，表明在此處引入小體積取代基有利于活性值升高。通過比較化合物48（pIC50＝6.16）、化合物47（pIC50＝7.12）的結(jié)構(gòu)及活性值關(guān)系可以看出，當其他基團不變時，將化合物48 R1分子片段C-3 位上的羥基換成氫原子，此位置上取代基體積逐漸減小，化合物活性值隨之升高。同時，R1分子片段的C-5、C-6、C-7、C-8 位在立體場中被大片綠色區(qū)域圍繞，當其上的氫原子被更大體積的基團取代時，有利于CYP1A1 抑制活性值的升高。如化合物24（pIC50＝6.32）、化合物25（pIC50＝6.29）與化合物1（pIC50＝6.01）相比，分別在C-6、C-7 位用體積更大的氧丙炔基取代了氫原子，其CYP1A1 抑制活性升高。圖4-C 中，R2分子片段的C-3′、C-4′、C-5′位在立體場中被綠色區(qū)域圍繞，如化合物21（pIC50＝7.70）、化合物22（pIC50＝6.19）分別在化合物1（pIC50＝6.01）的基礎(chǔ)上，在C-4′、C-5′位用體積更大的氧丙炔基取代氫原子，活性顯著提高。

圖4 化合物1 的Topomer CoMFA 模型的等勢圖Fig.4 Contour map of Topomer CoMFA model of compound 1

由圖4-B 可以看出，R1分子的C-3、C-6 位在靜電場被藍色區(qū)域所覆蓋，當引入供電性基團時其CYP1A1 抑制活性提高。對比化合物6（pIC50＝5.89）和化合物11（pIC50＝6.02），保持其他基團不變，化合物6 C-3 位上的氫原子被甲氧基替換，成為化合物11，供電性增強，化合物活性增高。同理，由圖4-D 可以看出，R2分子的C-4′位在靜電場中被藍色區(qū)域所覆蓋，對比化合物6（pIC50＝5.89）和化合物15（pIC50＝7.00），保持其他基團不變，化合物6 C-4′上的氫原子被甲氧基替換，成為化合物15，供電性增強，化合物活性增強。

3.3 實驗驗證結(jié)果分析

用于實驗驗證的化合物結(jié)構(gòu)與活性數(shù)據(jù)見表3，化合物pIC50實驗值與預測值的線性回歸關(guān)系如圖3所示，其相關(guān)系數(shù)為0.832 8，從圖中可以看出化合物取值點基本分布在45°直線附近，表明所建模型具有良好的可靠性和預測能力。

3.4 對接結(jié)果分析

分子對接結(jié)果見表4和圖5，棒狀表示配體，線狀表示氨基酸殘基，虛線表示氫鍵給體，圖5-A為配體分子與CYP1A1 酶蛋白受體的對接位點。由圖5-B 可知，模板分子配體與晶體結(jié)構(gòu)中的主要氨基酸殘基共形成了1 個氫鍵，與THR497 形成氫鍵相互作用，總打分函數(shù)、配體與受體對接的不適當程度和極性打分函數(shù)分別為4.837 5、?1.730 6、0.046 2。圖5-C 為實驗活性最高的化合物E 與蛋白質(zhì)氨基酸殘基氫鍵相互作用的示意圖，與ASN222 和ASN225 殘基各形成1 個氫鍵，總打分函數(shù)、配體與受體對接的不適當程度和極性打分函數(shù)分別為7.930 5、?0.991 8、1.920 4。相較于模板分子而言，化合物5 的2 個氫鍵作用力對其抑制活性十分重要，化合物5 與CYP1A1 的親和性明顯高于模板分子，這可能是其活性更強的原因。圖5-D 為實驗活性最低的化合物B 與蛋白質(zhì)氨基酸殘基氫鍵相互作用的示意圖，化合物B 與配體分子分別在SER116、ASP313 殘基各形成1 個氫鍵，總打分函數(shù)、配體與受體對接的不適當程度和極性打分函數(shù)分別為6.065 8、?0.324 2、1.213 9。相較于模板分子而言，這兩個氫鍵的作用力可能是其活性更強的原因；而與活性最高的化合物E 對比可以發(fā)現(xiàn)，形成氫鍵的殘基位點不同，化合物的抑制活性也有差異。

化合物I 不與配體形成氫鍵，其總打分函數(shù)、配體與受體對接的不適當程度和極性打分函數(shù)分別為6.671 7、?0.466 7、0.013 3。相較于模板分子而言，其抑制活性稍強，表明氫鍵的形成并不是增加化合物抑制活性的唯一因素。

表3 實驗驗證所用黃酮類化合物的結(jié)構(gòu)與活性數(shù)據(jù)Table 3 Experimental values,predicted values and residual of flavonoids used for experimental verification

表4 實驗驗證所用的黃酮類化合物的分子對接結(jié)果Table 4 Results of molecular docking of flavonoids used for experimental verification

圖5 配體與CYP1A1 的對接模型 (A) 及化合物1 (B)、化合物E (C)、化合物B (D) 與CYP1A1 分子的氨基酸殘基之間形成的氫鍵示意圖Fig.5 Docking mode between reference ligand and CYP1A1 (A),hydrogen bond interaction diagram of compound 1 (B),compound E (C),and compound B (D) with amino acid residues

4 結(jié)論

本研究利用Topomer CoMFA 方法對50 個黃酮類化合物進行了建模分析。該模型通過提供立體場和靜電場的可視化圖像，直觀地揭示了化合物中不同的取代基結(jié)構(gòu)對其活性的影響。統(tǒng)計結(jié)果q2＝0.800、r2＝0.965 0，表明所建立的模型具有較高的預測能力和良好的穩(wěn)定性。利用模板分子和實驗測出的活性分子進行分子對接，探究配體和受體蛋白之間的關(guān)系，對接結(jié)果表明小分子與大分子蛋白的氨基酸殘基THR497、ASN222、ASN255、SER116和ASP313 可以形成氫鍵，表明所建模型具有良好的可靠性，可為設計高活性分子提供理論參考。本研究為分析黃酮類化合物的CYP1A1 抑制活性提供了高效的方法，為新型CYP1A1 酶抑制劑的開發(fā)提供新的思路。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突