趙玉升，李立杰，李偉洋，劉楚妤，趙金莉，鐘 琪，李郁茹，孔 慧*，趙 琰*，屈會(huì)化

1.北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京 100029

2.北京中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，北京 100029

3.北京中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥研究院，北京 100029

石榴皮Granati Pericarpium為石榴科石榴屬植物石榴Punica granatumL.的干燥果皮，均系栽培，主產(chǎn)于江蘇、湖南、四川等地。果實(shí)將成熟時(shí)采摘，剝?nèi)」?，或于食用石榴時(shí)剝?nèi)」?，曬干即得。性溫、澀、酸，主入大腸經(jīng)，具有澀腸止瀉、止血、驅(qū)蟲之效[1]。石榴皮炭是石榴皮高溫炭化的產(chǎn)物，被《中國(guó)藥典》2020年版[2]所收入，具有澀腸止瀉的功效。石榴皮炭良好的止瀉作用與其高溫炮制過程密不可分，炭化的過程賦予了比原藥材更好的止瀉療效，現(xiàn)代研究[3-4]也證實(shí)了高溫炭化能賦予眾多中藥抗炎止血的功效。

多年來，現(xiàn)代學(xué)者試圖從小分子化合物的角度來闡明中藥炭藥高溫炭化后藥性增強(qiáng)或改變的機(jī)制，例如鈣、鎂等離子的變化起到了止血作用[5]；鞣質(zhì)、黃酮等小分子成分含量的改變與其生物活性的變化有密切聯(lián)系[6-7]；炭素的提出[8]；但這些結(jié)果并不令人滿意，這種困境和挑戰(zhàn)迫使本課題組將注意力轉(zhuǎn)向納米材料學(xué)，以此來研究炭藥炮制加工后的物質(zhì)基礎(chǔ)變化。諸如熒光半導(dǎo)體量子點(diǎn)之類的納米材料作為用于體內(nèi)分子和細(xì)胞成像的熒光探針，對(duì)大型醫(yī)學(xué)研究者具有吸引力[9]。近年來，對(duì)其自身生物活性的研究備受關(guān)注，但仍處于起步階段。據(jù)報(bào)道[10]，通過體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)，CdTe 量子點(diǎn)被確認(rèn)為核轉(zhuǎn)錄因子κB（nuclear transcription factor κB，NF-κB）通路途徑的有效抑制劑，這為量子點(diǎn)發(fā)展新型的抗癌、抗炎以及抗病毒方法提供了基本的證據(jù)。在另一項(xiàng)研究中，發(fā)現(xiàn)氧化石墨烯量子點(diǎn)對(duì)乙醇的不良影響具有拮抗作用[11]。作為納米材料的另一重要成員，碳點(diǎn)是一種以碳為骨架結(jié)構(gòu)且尺寸小于10 nm 的零維納米材料，碳點(diǎn)具有比其他納米材料更加優(yōu)越的性能，如超細(xì)尺寸、優(yōu)異的光致發(fā)光性能、良好的生物相容性和優(yōu)良的電子轉(zhuǎn)移能力[12-14]。然而，碳點(diǎn)的醫(yī)學(xué)研究[15]主要集中在合成和熒光探針上，碳點(diǎn)的潛在生物學(xué)性能和生物活性尚未引起足夠的重視。

本研究從納米材料學(xué)角度出發(fā)，從石榴皮炭的水溶液中發(fā)現(xiàn)并分離了新型納米類成分，并且將其命名為石榴皮炭納米類成分（GPC-NCs）。利用低分辨透射電子顯微鏡（TEM）與高分辨透射電子顯微鏡（HR-TEM）獲取GPC-NCs 的形態(tài)大小、粒徑分布及晶格間距等特征；利用HPLC 排除小分子發(fā)揮藥效作用的干擾；利用紫外光譜（UV-Vis）、熒光光譜（FL）、紅外光譜（FTIR）、X 射線光電子能譜（XPS）等方法來解析GPC-NCs 的化學(xué)基團(tuán)信息；利用小鼠腹瀉模型觀察小鼠腹瀉指數(shù)、腹瀉潛伏期和腸道傳輸功能，以此來評(píng)價(jià)和證實(shí)GPC-NCs 的止瀉作用。

1 儀器與材料

1.1 儀器

PXR-9 馬弗爐，北京中科澳博科技股份有限公司；TecnaiG220 透射電子顯微鏡（TEM），美國(guó)FEI公司；JEN-1230 高分辨透射電子顯微鏡（HRTEM），日本電子株式會(huì)社；CECIL 紫外分光光度計(jì)，英國(guó)Cambridge 公司；F-4500 熒光分光光度計(jì)，日本Hitachi 公司；Agilent 1260 系列高效液相色譜儀，美國(guó)Agilent Technologies 公司；Escalab 250Xi X射線光電子能譜分析（XPS）儀，美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司；D8-Advanced X 射線衍射儀，德國(guó)Bruker AXS 公司。

1.2 藥品和試劑

石榴皮（產(chǎn)地江蘇，批號(hào)200814002，經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)趙琰教授鑒定，為石榴科石榴屬植物石榴Punica granatumL.的干燥果皮）和番瀉葉（產(chǎn)地廣東，批號(hào)200801005，經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)趙琰教授鑒定，為豆科山扁豆屬植物狹葉番瀉Cassia angustifoliaVahi 的干燥小葉）藥材采購(gòu)于北京仟草中藥飲片有限公司；鹽酸洛哌丁胺膠囊，規(guī)格2 mg/片，批號(hào)H10910085，購(gòu)于天津博福益普生公司；相對(duì)分子質(zhì)量（Mw）1000 透析膜購(gòu)于北京瑞達(dá)恒輝科技發(fā)展有限公司；乙醇和其他分析級(jí)化學(xué)試劑均購(gòu)于北京化學(xué)試劑公司。所有實(shí)驗(yàn)用水均為去離子水。

1.3 動(dòng)物

SPF 級(jí)雌性昆明種小鼠54 只，體質(zhì)量（30.0±2.0）g，質(zhì)量合格證編號(hào)110324201102533442。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均購(gòu)于斯貝福（北京）生物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)為SCXK（京）2016-0038；實(shí)驗(yàn)環(huán)境為北京中醫(yī)藥大學(xué)西校區(qū)動(dòng)物房屏障系統(tǒng)，保持室溫（24.0±1.0）℃，相對(duì)濕度55%～65%，12 h 明暗交替，通風(fēng)良好，飼養(yǎng)期間內(nèi)自由進(jìn)水、進(jìn)食，實(shí)驗(yàn)前12 h 小鼠禁食不禁水。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)遵循北京中醫(yī)藥大學(xué)有關(guān)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理和使用的規(guī)定，均符合3R 原則。

2 方法

2.1 GPC-CDs 的制備

稱取石榴皮干燥藥材100 g，放于坩堝中，鋁箔紙密封并加蓋于馬弗爐中燒制。馬弗爐程序升溫：第1 階段5 min 升溫至70 ℃，保溫25 min；第2階段25 min 升溫至350 ℃，保溫1 h。將燒制好的石榴皮炭置于粉碎機(jī)中粉碎。稱取炭粉末50 g，于10 倍去離子水中煎煮3 次，溫度為100 ℃，時(shí)間為1 h。用0.22 μm 的微孔濾膜濾過殘?jiān)?，合? 次濾液，濃縮并選用Mw1000 的透析膜透析7 d。烘干后獲取GPC-NCs 粉末27 mg，于4 ℃保存，留置待用。

2.2 GPC-CDs 的表征

利用TEM 觀察GPC-NCs 的形貌、粒徑分布和微觀結(jié)構(gòu)特征；利用HR-TEM 和X 射線衍射儀（XRD）觀察其晶格間距等內(nèi)部結(jié)構(gòu)詳細(xì)特征。利用紫外分光光度計(jì)和紅外分光光度計(jì)分析GPCNCs 的結(jié)構(gòu)特征和表面的官能團(tuán)信息；利用熒光分光光度計(jì)分析GPC-NCs 的光學(xué)特征。利用X 射線光電子能譜分析儀分析GPC-NCs 中所含有元素及其可能連接方式。

2.3 HPLC 指紋圖譜分析

利用HPLC 比較所獲得的GPC-NCs 和石榴皮生藥在成分上的區(qū)別。稱取石榴皮生藥2 g，加入40 mL 甲醇超聲處理30 min，獲得生藥材溶液；將上述制備的GPC-NCs 用水稀釋至1 g/mL（按炭藥量計(jì)算），獲得GPC-NCs 稀釋液。所有樣品在進(jìn)樣前使用0.22 μm 微孔濾膜濾過。

本實(shí)驗(yàn)中高效液相色譜儀采用四元泵-二極管陣列檢測(cè)器，自動(dòng)進(jìn)樣器；色譜柱為Reliasil-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相為0.2%磷酸-乙腈，等度洗脫程序：0～50 min，21%乙腈；進(jìn)樣量10.0 μL；體積流量為1 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)設(shè)定為254 nm；柱溫25 ℃[16]。

2.4 熒光量子產(chǎn)率（fluorescence quantum yield，F(xiàn)QY）測(cè)定

熒光物質(zhì)經(jīng)過吸光后發(fā)射熒光的光子數(shù)與其所吸收的激發(fā)光光子數(shù)的比值即為FQY。本實(shí)驗(yàn)中測(cè)定的結(jié)果為GPC-NCs 的相對(duì)FQY，參比物質(zhì)選擇硫酸奎寧[17]。熒光光譜掃描時(shí)激發(fā)波長(zhǎng)（λx）與發(fā)射波長(zhǎng)（λm）的狹縫寬度皆為10 nm。根據(jù)公式FQYNCs＝FQYRINCsARηNCs2/(IRANCsηR2)對(duì) GPC-NCs的FQY 進(jìn)行計(jì)算，公式中I為發(fā)射光譜下的峰面積，A為365 nm 時(shí)的吸光度值，η為溶劑的折射率，下標(biāo)NCs 和R 代表GPC-NCs 和參照物。為了使重吸收效應(yīng)最小化，AR和ANCs應(yīng)該保證在0.05 以下[18]。

2.5 GPC-NCs 對(duì)小鼠腹瀉模型腹瀉指數(shù)及腹瀉潛伏期的作用研究

2.5.1 造模、分組及給藥 小鼠實(shí)驗(yàn)前3 d 適應(yīng)性飼養(yǎng)。將小鼠隨機(jī)分為模型組、鹽酸洛哌丁胺組（2 mg/kg）及GPC-NCs 高、中、低劑量（7.2、3.6、1.8 mg/kg）組，每組9 只。造模藥使用番瀉葉水煎劑（45 g 生藥加150 mL 去離子水煎煮制備）實(shí)驗(yàn)時(shí)小鼠單只單籠，鼠籠籠底墊有濾紙，造模前12 h小鼠禁食不禁水。各組小鼠ig 給予番瀉葉水煎劑（4 g/kg），隨后放入鼠籠記錄各行為指標(biāo)。

隨著信息化教學(xué)及物聯(lián)網(wǎng)水平提高，多媒體等現(xiàn)代化教學(xué)設(shè)備逐漸普及，良好教學(xué)設(shè)備的引入，使得廣大教師借助于現(xiàn)代高效的教學(xué)手段，在提升教學(xué)效率的同時(shí)，也增強(qiáng)了教師教學(xué)的積極性與主動(dòng)性，這是新時(shí)代下教學(xué)手段現(xiàn)代化發(fā)展需要。

2.5.2 觀察指標(biāo) 稀便率是指每只小鼠所排的稀便數(shù)與總便數(shù)之比；稀便級(jí)表示小鼠所排稀便的程度，以稀便污染濾紙形成污跡面積的大小定級(jí)，級(jí)數(shù)分為4 級(jí)，標(biāo)準(zhǔn)如下：糞便污跡直徑＜1.0 cm 為等級(jí)1，1.0～1.9 cm 為等級(jí)2，2.0～3.0 cm 為等級(jí)3，＞3.0 cm 為等級(jí)4，統(tǒng)計(jì)時(shí)先逐個(gè)統(tǒng)計(jì)每處稀便的級(jí)數(shù)，然后將該小鼠所有稀便級(jí)數(shù)相加，除以稀便次數(shù)得到稀便的平均級(jí)數(shù)，簡(jiǎn)稱稀便級(jí)；腹瀉指數(shù)是指稀便率與稀便級(jí)的乘積。腹瀉潛伏期是指在給藥后，觀察小鼠第1 次出現(xiàn)稀便或第1 次出現(xiàn)成型糞便但外部帶有肉眼可見黏液為出現(xiàn)腹瀉的時(shí)間，從給完番瀉葉水煎劑后開始計(jì)時(shí)，至出現(xiàn)稀便或黏液便時(shí)之間的時(shí)間為腹瀉潛伏期時(shí)間，連續(xù)觀察3 h。參考文獻(xiàn)方法[19]觀察稀便率、稀便級(jí)、腹瀉指數(shù)及腹瀉潛伏期。

2.6 GPC-NCs 對(duì)小鼠腹瀉模型腸道傳輸功能的作用研究

2.6.1 造模、分組及給藥 小鼠實(shí)驗(yàn)前3 d 適應(yīng)性飼養(yǎng)。將小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、鹽酸洛哌丁胺組（2 mg/kg）及GPC-NCs 高、中、低劑量（7.2、3.6、1.8 mg/kg）組，每組9 只。動(dòng)物造模方法同“2.5.1”項(xiàng)。在給自制混合灌胃液（50%墨汁與蒸餾水、鹽酸洛哌丁胺及高、中、低質(zhì)量濃度GPC-NCs溶液制成對(duì)應(yīng)質(zhì)量濃度混合溶液）后將各組小鼠在30 min 后脫臼處死。立即剖腹取出全部小腸腸管（上自幽門，下至回盲部）。

2.6.2 觀察指標(biāo) 腸道傳輸功能表現(xiàn)為腸道內(nèi)容物在腸道中推進(jìn)的情況，其實(shí)質(zhì)是腸平滑肌的蠕動(dòng)情況，對(duì)腸道傳輸功能的影響與否能夠反映藥物的止瀉機(jī)制。當(dāng)腸蠕動(dòng)尤進(jìn)，腸道傳輸加快，腸內(nèi)容物不易保留，從而發(fā)生腹瀉，反之則可視為止瀉作用。腸道傳輸功能通常用炭末推進(jìn)距離或墨汁推進(jìn)距離來表示。參考文獻(xiàn)方法[20]用直尺測(cè)量小腸腸道全長(zhǎng)及墨汁在腸道內(nèi)推進(jìn)長(zhǎng)度，腸道傳輸功能為墨汁推進(jìn)率（墨汁推進(jìn)率＝墨汁在腸道內(nèi)推進(jìn)長(zhǎng)度/小腸腸管總長(zhǎng)度）。

2.7 統(tǒng)計(jì)方法

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0 專用統(tǒng)計(jì)軟件分析，結(jié)果以±s表示，統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用方差分析。單因素ANOVA 分析方法用于實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)服從正態(tài)分布，同時(shí)方差齊。組間差異則運(yùn)用LSD 方法統(tǒng)計(jì)。

3 結(jié)果

3.1 GPC-NCs 制備和表征結(jié)果

通過高溫炭化、粉碎、提取、分離、濾過、濃縮、透析等一系列步驟制備過程獲得GPC-NCs 溶液。利用HPLC 指紋圖譜分析了石榴皮甲醇提取液和GPC-NCs 溶液的成分差異，從圖1-a 中可以觀察到石榴皮甲醇提取液包含一系列小分子化合物，如鞣花酸等鞣質(zhì)類化合物，但如圖1-b 所示，在GPCNCs 溶液中并沒有檢測(cè)到小分子的存在，這在一定程度上排除了小分子作為GPC-NCs 溶液活性物質(zhì)的可能性。

圖1 石榴皮 (a) 和GPC-NCs (b) 的HPLC 圖Fig.1 HPLC profile of Granati Pericarpium (a) and GPC-NCs (b)

GPC-NCs 的形貌、粒徑分布、晶格間距等微觀結(jié)構(gòu)特征利用TEM、HRTEM、XRD 來觀察。TEM觀察結(jié)果（圖2-a）GPC-NCs 呈類球形且分散性良好，該納米類成分的粒徑分布（圖2-b）大小主要集中在1.2～2.3 nm，具有一定的均一穩(wěn)定性。為了更深一步的研究GPC-NCs 的具體結(jié)構(gòu)信息，利用HRTEM 來研究單一納米顆粒的晶格間距大小，圖1-a 表明GPC-NCs 的晶格結(jié)構(gòu)清晰可見，晶格間距為0.321 nm。另外，利用X 射線衍射儀進(jìn)一步分析GPC-NCs 內(nèi)部原子在空間分布的狀態(tài)，從圖2-d 上可以觀察到一個(gè)典型的非晶體衍射峰，衍射角度2θ＝26.603°，經(jīng)專業(yè)軟件分析，該衍射角度其對(duì)應(yīng)的晶格間距約為0.335 nm，據(jù)此可推測(cè)出GPC-NCs是由高度無定形的碳結(jié)構(gòu)所構(gòu)成的[21-22]。GPC-NCs的XRD 數(shù)據(jù)分析與其HR-TEM 的測(cè)試結(jié)果基本吻合，側(cè)面印證了該納米顆粒的均一穩(wěn)定性。

圖2 GPC-NCs 的微觀結(jié)構(gòu)組圖Fig.2 Microstructure diagrams of GPC-NCs

圖3 GPC-NCs 的光譜特征組圖Fig.3 Spectral characteristics diagrams of GPC-NCs

進(jìn)一步研究GPC-NCs 的光學(xué)性質(zhì)。如圖3-a所示，紫外圖譜顯示GPC-NCs 在260 nm 處有1 個(gè)強(qiáng)烈的吸收峰，這可能是由于含有雜原子的不飽和基團(tuán)（如C＝O 雙鍵等）引起的n-π*躍遷所導(dǎo)致，380 nm 處也有1 個(gè)小的吸收峰，這可能是由于含有大量C＝C 雙鍵從而產(chǎn)生共軛作用，從而向低能量方向移動(dòng)，產(chǎn)生紅移[23]。GPC-NCs 的發(fā)射光譜顯示，在激發(fā)波長(zhǎng)348 nm 的情況下，最大發(fā)射波長(zhǎng)為450 nm（圖3-b）。用硫酸奎寧作為NCs 在水溶液中的參考物，并計(jì)算出在最大激發(fā)波長(zhǎng)348 nm 下GPCNCs 的FQY 為0.45%。用紅外光譜法（圖3-c）測(cè)定了GPC-NCs 表面化學(xué)基團(tuán)信息，GPC-NCs 的紅外光譜（圖3-c）顯示吸收峰為3434、2921、2852、1631、1580、1444、1403、1055 cm?1，其中3434 cm?1提示-O-H 鍵的存在，2921、2852 cm?1可能為-CH2-的伸縮振動(dòng)峰，1631 cm?1的吸收峰提示可能含有-C＝O 鍵，1580 cm?1的吸收峰提示-NH-鍵的存在，1444 cm?1和1403 cm?1附近出現(xiàn)2個(gè)不明顯的雙峰，這提示可能是-CH-鍵的彎曲振動(dòng)峰，1055 cm?1處的吸收峰提示可能含有-C-O-C-鍵[24-25]?？梢缘贸鯣PC-NCs 表面含有羥基、羧基和氨基等官能團(tuán)。

利用X 射線光電子能譜來進(jìn)一步研究GPCNCs 的表面組成和元素分析。如圖4-a 所示，284.8、399.61、532.69 eV 處有明顯的峰，表明該量子點(diǎn)主要由C（68.4%）、O（28.08%）以及少量的N（3.52%）元素組成。C1s 譜帶（圖4-b）顯示284.73、285.80 eV 2 個(gè)峰，與之對(duì)應(yīng)為C-N、C＝O。O1s 譜帶（圖4-c）顯示531.44、533.08 eV 2 個(gè)峰，與之對(duì)應(yīng)為C-O、O-C＝O。N1s 譜帶（圖4-d）顯示399.59、401.70 eV 2 個(gè)峰，與之對(duì)應(yīng)為C-N-C、(C)3-N[26-27]。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果與FT-IR 表征一致，F(xiàn)T-IR 和XPS 分析表明GPC-NCs 含有羥基、羧基、氨基的存在可歸因于各種含氧官能團(tuán)的多光子活性過程[28]。

3.2 藥理實(shí)驗(yàn)結(jié)果

利用小鼠腹瀉模型觀察小鼠腹瀉指數(shù)、腹瀉潛伏期和腸道傳輸功能來評(píng)價(jià)GPC-NCs 的止瀉作用，從表1中可以看出，與模型組相比，陽(yáng)性藥組、GPCNCs 高劑量組對(duì)腹瀉具有顯著抑制作用，GPC-NCs中、低劑量組也具有一定的療效，并且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05、0.01）。從腹瀉潛伏期上（表1）分析，與模型組相比，陽(yáng)性藥組及GPC-NCs 高、中劑量組具有顯著抑制療效，低劑量組也具有一定的療效，并且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

利用墨汁推進(jìn)率來觀察小鼠腸道運(yùn)輸功能也能間接反映藥物的止瀉效果，由表1中可以看出，與對(duì)照組相比較，模型組小鼠腸道墨汁推進(jìn)率明顯提高，證明本實(shí)驗(yàn)造模成功，結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與模型組相比較，陽(yáng)性藥組及GPC-NCs 低劑量組對(duì)腹瀉具有顯著抑制作用，GPC-NCs 高、中劑量組也具有一定的療效，并且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05、0.01）。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，GPC-NCs 對(duì)于番瀉葉水煎劑所引起的小鼠腹瀉模型具有很好地治療效果，GPC-NCs 發(fā)揮止瀉作用的機(jī)制也是下一步的實(shí)驗(yàn)方向。

4 討論

長(zhǎng)期以來，中醫(yī)炭藥的研究重點(diǎn)一直是止血，這與中醫(yī)經(jīng)驗(yàn)論密切相關(guān)。然而，對(duì)藥物炭化處理后的研究有限。通過前期工作，本課題組證明了納米類成分是炭藥發(fā)揮藥效作用的物質(zhì)基礎(chǔ)[29]。本團(tuán)隊(duì)已成功利用卷柏炭[30]和綿馬貫眾炭[31]等炭藥制備出納米類成分，并證明了這些納米類成分具有良好的止血效果。

此外，本團(tuán)隊(duì)也已經(jīng)證明了炭藥納米類成分的其他藥理活性，比如桑蠶蠶繭提取的納米類成分具有抗炎作用[32]、焦三仙制備的納米類成分具有降血糖作用[33]、枳實(shí)炭納米類成分具有抗高尿酸血癥和痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎活性[21]等。因此，后續(xù)研究更側(cè)重于炭藥止血作用以外的其他藥理活性研究。

圖4 基于X 射線光電子能譜分析技術(shù) (XPS) 的GPC-NCs 表面基團(tuán)和元素組成分析Fig.4 Surface composition and elemental analysis of GPC-NCs by XPS

表1 小鼠腹瀉指數(shù)、腹瀉潛伏期和腸道傳輸功能實(shí)驗(yàn) (±s,n=9)Table 1 Mouse diarrhea index,diarrhea incubation period and intestinal transit function experiment (±s,n=9)

表1 小鼠腹瀉指數(shù)、腹瀉潛伏期和腸道傳輸功能實(shí)驗(yàn) (±s,n=9)Table 1 Mouse diarrhea index,diarrhea incubation period and intestinal transit function experiment (±s,n=9)

與模型組比較：*P＜0.05 **P＜0.01；與對(duì)照組比較：#P＜0.05*P ＜ 0.05 **P ＜ 0.01 vs model group; #P ＜ 0.05 vs control group

組別 劑量/(mg·kg?1) 腹瀉指數(shù) 腹瀉潛伏期/min 墨汁推進(jìn)率/%對(duì)照 ? ? ? 90.82±0.11模型 4000 1.16±0.25 158.75±12.93 98.15±0.04#陽(yáng)性藥 2 0.60±0.23** 108.20±11.63** 83.97±0.06**GPC-NCs 7.2 0.74±0.25* 115.00±8.93** 90.56±0.06**3.6 0.83±0.21* 120.25±8.93** 90.90±0.05*1.8 0.87±0.18** 127.40±13.62** 83.23±0.07**

石榴皮炭作為一味傳統(tǒng)的炭藥，在臨床治療腹瀉疾病方面有著悠久的歷史，但其活性成分尚不清楚。以往的研究試圖從原始植物中的類黃酮、揮發(fā)油等小分子來解釋石榴皮炭的生物活性，但得到的信息很少。有研究表明，高溫燃燒后的粗晶是主要的活性成分[34]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究從納米角度揭示了炭藥的生物活性和藥理作用，啟發(fā)了本團(tuán)隊(duì)開展本研究。在實(shí)驗(yàn)初期，發(fā)現(xiàn)與石榴皮水煎劑相比，石榴皮炭水提液有熒光現(xiàn)象，這說明在炭化過程中產(chǎn)生了新的物質(zhì)。

在本研究中，從石榴皮炭水溶液中發(fā)現(xiàn)并分離出了新型納米類成分。用TEM、HRTEM、FTIR、UV Vis 和熒光光譜對(duì)GPC-NCs 進(jìn)行了表征。此外，為了評(píng)價(jià)成分變化，排除小分子有機(jī)化合物的干擾，采用HPLC 法對(duì)石榴皮提取物和GPC-NCs 的化學(xué)成分進(jìn)行了比較研究。GPC-NCs 的前體藥材石榴皮主要由鞣質(zhì)類、黃酮類、生物堿等成分組成，然而，HPLC 結(jié)果顯示，這些小分子成分和其他有機(jī)物在煅燒后消失。因此，表征結(jié)果證實(shí)了GPCNCs 是一種熒光量子產(chǎn)率為0.45%且直徑在1.2～2.3 nm 的類球形顆粒，表面上具有羥基、羧基、氨基等活性基團(tuán)，從而使其具有良好的溶解性和生物活性。

藥理實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明GPC-NCs 具有顯著止瀉效果，本研究是對(duì)GPC-NCs 的止瀉活性的初步評(píng)價(jià)，需要進(jìn)一步的研究來闡明這些作用的更深層次的潛在機(jī)制。但是本實(shí)驗(yàn)中石榴皮炭中新型納米類成分的發(fā)現(xiàn)及其止瀉活性的證明，為石榴皮炭和其他炭藥的材料研究提供了新的理論基礎(chǔ)。這不僅為石榴皮炭的物質(zhì)基礎(chǔ)研究提供了一個(gè)新思路，也為GPC-NCs 在止瀉領(lǐng)域的潛在生物醫(yī)學(xué)和醫(yī)療保健應(yīng)用提供了新的見解，并為未來的藥物發(fā)現(xiàn)奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突