徐燕玲，王振宇，楊淑達(dá)，陸露

昆明醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院云南省天然藥物藥理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南昆明650500

植物種質(zhì)資源是指一切具有遺傳物質(zhì)或基因的各類(lèi)植物的總稱(chēng)，包含所有可利用的遺傳載體[1]。植物種質(zhì)資源評(píng)價(jià)主要涉及對(duì)植物學(xué)性狀、外觀品質(zhì)、內(nèi)部經(jīng)濟(jì)性狀、農(nóng)藝性狀、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值、抗逆性和病蟲(chóng)害、活性成分、種質(zhì)資源鑒定、種類(lèi)與空間分布、遺傳多樣性分析、親緣關(guān)系、基因流模式、育種栽培與保護(hù)等多方面的評(píng)價(jià)[2-8]。藥用植物種質(zhì)資源是中藥生產(chǎn)的源泉，藥用植物種質(zhì)質(zhì)量是中藥材品質(zhì)的重要影響因素之一，評(píng)價(jià)核心指標(biāo)以臨床效果和中藥材道地性研究為主，同時(shí)兼顧藥用植物資源分布與蘊(yùn)藏量、藥用植物種質(zhì)鑒定、遺傳多樣性檢測(cè)、親緣關(guān)系分析、藥用植物有效成分含量測(cè)定、瀕危藥用植物保護(hù)以及藥用植物栽培和育種等方面[9-10]。

藥用植物種質(zhì)資源傳統(tǒng)評(píng)價(jià)方法主要有以下幾種：（1）藥用植物的資源調(diào)查，即藥用植物資源的分布、種類(lèi)、蘊(yùn)藏量與種質(zhì)資源多樣性[11-12]，采用樣方調(diào)查、訪(fǎng)問(wèn)調(diào)查、踏查及統(tǒng)計(jì)報(bào)表等方法[13]；（2）中藥材基原與品質(zhì)鑒定，傳統(tǒng)上常采用性狀鑒別、顯微鑒別、粉末鑒別、理化鑒別等方法[14]；（3）藥用植物化學(xué)成分定性定量分析，評(píng)價(jià)藥用植物種質(zhì)資源。隨著科技進(jìn)步與發(fā)展，高效液相色譜法（HPLC）、薄層色譜法（TLC）、紫外-可見(jiàn)分光光度法（UV-VIS）、近紅外分光光度法（NIR）、中藥指紋圖譜、X 射線(xiàn)衍射等現(xiàn)代分析技術(shù)相繼被應(yīng)用，該類(lèi)技術(shù)主要通過(guò)對(duì)目標(biāo)化學(xué)成分提取、分離，然后進(jìn)行定性和定量分析，開(kāi)展藥用植物的物種鑒定和質(zhì)量評(píng)價(jià)[15-16]。以上幾種方法在藥用植物種質(zhì)資源評(píng)價(jià)中得到廣泛應(yīng)用，但在一些方面具有局限性：（1）傳統(tǒng)調(diào)查藥用植物資源特別是野生資源蘊(yùn)藏量，主要根據(jù)中藥材產(chǎn)地收購(gòu)量進(jìn)行推算，容易受主觀因素影響，缺乏客觀科學(xué)性[17]；（2）性狀及顯微鑒定等方法對(duì)鑒定人員的經(jīng)驗(yàn)要求高且主觀性強(qiáng)[18]，而精準(zhǔn)性較低；（3）中藥是在中醫(yī)理論指導(dǎo)下發(fā)揮治療疾病的作用，而HPLC 等化學(xué)分析方法多以單一或單類(lèi)成分的含量為參考指標(biāo)，與中醫(yī)理論的多種成分整體作用理論思想不一致[19]；（4）傳統(tǒng)的資源普查方法難以反映植物多樣性和環(huán)境因子在多維空間上的內(nèi)在聯(lián)系[20]；（5）藥用植物化學(xué)成分（藥物活性）與其遺傳、生態(tài)環(huán)境關(guān)聯(lián)性不明晰，傳統(tǒng)評(píng)價(jià)方法不涉及解析藥用植物資源的遺傳背景及優(yōu)質(zhì)中藥材（道地藥材）的進(jìn)化機(jī)制，未能將藥用植物品質(zhì)特征與地理結(jié)構(gòu)、生態(tài)環(huán)境進(jìn)行關(guān)聯(lián)并揭示規(guī)律性，不利于藥用植物的產(chǎn)地評(píng)價(jià)。

進(jìn)化生態(tài)學(xué)是研究生態(tài)系統(tǒng)各級(jí)組成之間及其與生態(tài)環(huán)境背景之間生態(tài)規(guī)律的學(xué)科，主要研究生物多樣性和種群結(jié)構(gòu)問(wèn)題的生態(tài)與遺傳基礎(chǔ)，生物群落和生態(tài)系統(tǒng)的多樣性及系統(tǒng)演化；是20世紀(jì)60年代產(chǎn)生的一門(mén)綜合性學(xué)科；是生態(tài)學(xué)與遺傳學(xué)、進(jìn)化生物學(xué)等多學(xué)科的融合產(chǎn)物，用于探索物種為適應(yīng)所處環(huán)境的進(jìn)化機(jī)制[21-23]；它的出現(xiàn)為解決上述問(wèn)題提供了有效的交叉學(xué)科方法與技術(shù)。進(jìn)化生態(tài)學(xué)學(xué)術(shù)理念啟示了藥用植物資源研究者將藥用植物表型特征與生態(tài)因子、基因位點(diǎn)相關(guān)聯(lián)，分析藥用植物表型-基因型-化學(xué)型-環(huán)境因子之間的動(dòng)態(tài)關(guān)系[6]，植物的次生代謝產(chǎn)物是植物在長(zhǎng)期進(jìn)化過(guò)程中與環(huán)境相互作用的結(jié)果[24]，藥用植物化學(xué)成分的種類(lèi)與含量受到了遺傳和環(huán)境的共同影響。因此環(huán)境多樣性與遺傳多樣性影響了藥用植物化學(xué)成分的多樣性，進(jìn)而導(dǎo)致中藥臨床療效的多樣性、影響藥用植物的開(kāi)發(fā)利用與中藥材的生產(chǎn)加工等。采用進(jìn)化生態(tài)學(xué)手段研究環(huán)境或遺傳因素在藥用植物生長(zhǎng)過(guò)程中對(duì)其性狀、品質(zhì)、蘊(yùn)藏量、分布等方面的影響，可從動(dòng)態(tài)發(fā)展的角度對(duì)藥用植物資源進(jìn)行更綜合、更科學(xué)的評(píng)價(jià)，進(jìn)一步完善藥用植物種質(zhì)資源的評(píng)價(jià)體系。進(jìn)化生態(tài)學(xué)的研究方法可以將植物的生存環(huán)境參數(shù)與其分布地點(diǎn)相關(guān)聯(lián)，用于預(yù)測(cè)在全球環(huán)境變化下資源的動(dòng)態(tài)分布狀況；將藥用植物的進(jìn)化史、植物學(xué)性狀、中藥材品質(zhì)與地理變異、生態(tài)環(huán)境進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，評(píng)價(jià)其遺傳多樣性，為藥用植物的分類(lèi)、鑒定、開(kāi)發(fā)利用、引種栽培提供理論基礎(chǔ)；將藥用植物的質(zhì)量和數(shù)量性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，定位目標(biāo)基因，為藥用植物分子育種和性狀改良提供理論基礎(chǔ)。

1 進(jìn)化生態(tài)學(xué)分析方法與應(yīng)用

進(jìn)化生態(tài)學(xué)的研究手段涉及了大量的基于進(jìn)化生物學(xué)和生態(tài)學(xué)模型的統(tǒng)計(jì)分析方法，用以將物種內(nèi)在特質(zhì)（多樣性）與生態(tài)環(huán)境相關(guān)聯(lián)，探索二者間的相互影響與動(dòng)態(tài)變化。進(jìn)化生態(tài)學(xué)的基本分析方法包括基于普通生態(tài)學(xué)數(shù)據(jù)的數(shù)量分析（如相關(guān)性分析、方差分析、聚類(lèi)分析）、基于分子生物學(xué)數(shù)據(jù)的遺傳分析（如多變量模型、數(shù)量性狀位點(diǎn)分析、遺傳多樣性檢測(cè)）和計(jì)算機(jī)遺傳建模等[25]，這些分析方法可進(jìn)一步組合為綜合分析方法，其中，分子標(biāo)記、分子譜系地理分析、景觀遺傳分析、生態(tài)位模型分析、性狀關(guān)聯(lián)分析等綜合分析方法在藥用植物種質(zhì)資資源研究與評(píng)價(jià)中應(yīng)用較多，本文主要介紹這幾種方方法的概念與應(yīng)用，闡釋藥用植物種質(zhì)資源的綜合評(píng)評(píng)價(jià)體系（圖1）。

圖1 基于進(jìn)化生態(tài)學(xué)的藥用植物種質(zhì)資源綜合評(píng)評(píng)價(jià)體系Fig.1 A comprehensive evaluationsystem for germplasm resourcesof medicinal plants based on e volutionary ecology

1.1 分子標(biāo)記

分子標(biāo)記是反映生物個(gè)體或種群間基因組中某種差異特征的核苷酸序列[26]，這些序列相互之間由于堿基的變異、缺失、插入、易位、倒位、重排導(dǎo)致堿基組成和長(zhǎng)度不一，從而產(chǎn)生多態(tài)性，分子標(biāo)記技術(shù)用來(lái)檢測(cè)這些多態(tài)性[27]。分子標(biāo)記技術(shù)具有速度快、靈敏度好、特異性強(qiáng)、準(zhǔn)確度高等優(yōu)點(diǎn)，獲取的基因數(shù)據(jù)用來(lái)進(jìn)行建立系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)、獲取遺傳標(biāo)記、構(gòu)建連鎖不平衡圖譜，是進(jìn)行分子譜系地理分析、景觀遺傳分析、性狀關(guān)聯(lián)分析的數(shù)據(jù)基礎(chǔ)，被廣泛應(yīng)用于藥用植物遺傳多樣性檢測(cè)、親緣關(guān)系分析、瀕危藥用植物的保護(hù)、藥用植物的栽培與性狀改良的研究[9,28-29]。同時(shí)，由于不受生物體生長(zhǎng)發(fā)育階段、供試部位、背景信息與形態(tài)等方面的限制，分子標(biāo)記技術(shù)（廣義上包括DNA 條形碼技術(shù)）被廣泛應(yīng)用于藥用植物種質(zhì)資源（特別是基原）的物種鑒定[30]。

常用的DNA分子標(biāo)記技術(shù)主要有限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（restriction fragmentlength polymorphism，RFLP）、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA（randomly amplified polymorphicDNA，RAPD）、擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性（amplified fragmentlength polymorphism，AFLP）、簡(jiǎn)單重復(fù)序列（simple sequencerepeat，SSR）、單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）、內(nèi)部簡(jiǎn)單重復(fù)序列（inter-simple sequence repeat，ISSR）、基因芯片、單片段DNA條形碼、多片段DNA 條形碼、迷你條形碼、超級(jí)條形碼和宏條形碼技術(shù)等[31-32]。RFLP是較早開(kāi)發(fā)的分分子標(biāo)記技術(shù)，被應(yīng)用于藥用植物鑒定、遺傳多樣性性檢測(cè)、親緣關(guān)系分析以及構(gòu)建基因連鎖圖譜等研究[9]。RAPD多用于藥用植物的基因多態(tài)性與遺傳多樣性分析[9,33]。AFLP多用于遺傳結(jié)構(gòu)和地理分布關(guān)關(guān)系、物種起源和藥用植物種屬間系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系分析析[34-36]。SSR 和SNP分子標(biāo)記具有穩(wěn)定性好、多態(tài)性性高、共顯性且易于高通量檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)，成為目前遺傳多樣性分析的重要手段[37]。SNP基因位點(diǎn)檢測(cè)可將植物的表型性狀相關(guān)基因與環(huán)境變化相互聯(lián)系系，用于藥用植物的道地性評(píng)價(jià)與形成機(jī)制研究[38--39]。ISSR 也通常用于藥用植物遺傳多樣性的研究，因開(kāi)發(fā)成本低、實(shí)驗(yàn)程序簡(jiǎn)單而廣為使用[40]，但因其不能區(qū)分顯性純合和雜合基因型具有研究局限性性。近年來(lái)，DNA 條形碼技術(shù)飛速發(fā)展，因其鑒定能能力強(qiáng)，快捷高效，在鑒定沒(méi)有背景信息的中藥材樣品以及在方法通用性和可數(shù)字化方面具有一定的優(yōu)勢(shì)[41]，已經(jīng)在中藥材鑒定方面得到廣泛的認(rèn)同和和應(yīng)用[42]。

隨著測(cè)序技術(shù)的革新和生物信息學(xué)的發(fā)展，單片段DNA 條形碼、多片段DNA 條形碼（如植物國(guó)際通用條形碼matK、rbcL、psbA-trnH、ITS 及其組合）、迷你條形碼等已經(jīng)遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿(mǎn)足鑒定需求[43]，超級(jí)條形碼和宏條形碼技術(shù)相繼推出，分別在藥用植物困難類(lèi)群（引物通用性不高、擴(kuò)增效率低、近緣種間差異小、進(jìn)化機(jī)制復(fù)雜）或非標(biāo)準(zhǔn)材料（DNA 降解嚴(yán)重的材料），與多物種混合材料（復(fù)方中成藥）的基原/物種鑒定展現(xiàn)了強(qiáng)大的生命力?；谌~綠體全基因組的超級(jí)條形碼能夠準(zhǔn)確鑒定砂仁（豆蔻屬物種）[44]、石斛（不同產(chǎn)地的鐵皮石斛）[45]等藥用植物，且在鑒定近緣物種方面有良好的應(yīng)用前景[41]。通過(guò)宏條形碼技術(shù)，學(xué)者們開(kāi)展了對(duì)九味羌活丸[46]、龍膽瀉肝丸[47]等中成藥藥用植物物種組成的相關(guān)研究，提出了利用宏條形碼技術(shù)鑒定市售混合中藥材種子的方法[48]。目前，轉(zhuǎn)錄組測(cè)序（RNA-seq）是研究生物體在特定時(shí)期和特定組織基因表達(dá)的重要方法，也逐漸用于道地藥材的品質(zhì)鑒定[49]、挖掘參與活性成分生物合成途徑的功能基因以及開(kāi)發(fā)分子標(biāo)記[50]等研究中，在丹參[51]、花椒[49]等藥用植物中得到應(yīng)用。

1.2 分子譜系地理分析

譜系地理學(xué)的概念是由Avise[52]提出，即通過(guò)遺傳信息來(lái)研究地質(zhì)結(jié)構(gòu)與變化對(duì)物種地理分布的影響，用于探討物種的基因譜系在當(dāng)前地理分布格局的歷史成因以及解釋物種進(jìn)化和生態(tài)進(jìn)程。溯祖理論是譜系地理學(xué)的重要理論基礎(chǔ)，根據(jù)種群中現(xiàn)有的中性遺傳變異回溯變異的歷史過(guò)程，以探討物種的進(jìn)化機(jī)制[53]。借助DNA 分子標(biāo)記技術(shù)和嵌套分析，描述單倍型的地理分布、估計(jì)基因分化時(shí)間、對(duì)涉及種群的歷史事件進(jìn)行數(shù)學(xué)模擬，全面地反映種群的進(jìn)化歷史[54]。分子譜系地理在揭示遺傳多樣性的地理結(jié)構(gòu)（藥用植物地理分布成因）等方面有重要作用，可用于瀕危藥用植物資源保護(hù)、栽培起源、道地藥材形成機(jī)制以及植物有效成分的地理分布等評(píng)價(jià)。

由地形起伏造成的地理障礙是生物多樣性的主要成因之一，我國(guó)西南地區(qū)植物顯著的遺傳多樣性及差異，與該地區(qū)因板塊運(yùn)動(dòng)造成的青藏高原、云貴高原、喜馬拉雅山及橫斷山脈抬升等密切相關(guān)，地理障礙形成了基因流屏障，影響了種群遺傳結(jié)構(gòu)和分布，促使了遺傳分化與物種多樣性的形成[55-56]。該類(lèi)研究對(duì)深入了解藥用植物的種質(zhì)遺傳背景與地理分布的相關(guān)性具有重要的指導(dǎo)意義。劉玉萍等[57]揭示了廣藿香葉綠體基因遺傳分化與產(chǎn)地（道地性）有良好的相關(guān)性；Wang 等[58]闡明了銀杉瀕危機(jī)制是由于生境破碎化導(dǎo)致的基因流阻斷，并提出了遷地保護(hù)的建議；Xu 等[59]揭示了野生菰和栽培菰的譜系關(guān)系并推測(cè)了太湖以北是菰的栽培起源地；袁慶軍等[60]綜合論述了分子譜系地理分析在道地藥材研究中的理論、方法和案例等應(yīng)用。另外，通過(guò)物種現(xiàn)存遺傳分布格局和譜系關(guān)系可推測(cè)藥用植物冰期進(jìn)化歷史，揭示氣候和環(huán)境變化對(duì)其地理分布格局的影響[61]。藥用植物遺傳多樣性的地理分布也深受第四紀(jì)冰期波動(dòng)影響，如露蕊烏頭[62]、麻櫟[63]、唐古特虎耳草[64]。亞洲季風(fēng)的增強(qiáng)亦可為植物遺傳多樣性的增加提供重要保障[65]。四川季風(fēng)氣候明顯為該地藥用植物多樣性提供了良好生境[66]。季風(fēng)氣候適合浮萍科植物生長(zhǎng)，積累了紫萍等藥用植物的遺傳多樣性[67]。

1.3 景觀遺傳分析

景觀遺傳學(xué)由Manel 等[68]提出，是生態(tài)學(xué)、遺傳學(xué)與地理學(xué)交叉產(chǎn)生的新領(lǐng)域，主要分析量化景觀格局變化與物種微觀進(jìn)化（如基因流、遺傳漂變、選擇）的相互影響，評(píng)估生態(tài)環(huán)境因子（如氣候、溫度、光照等）對(duì)遷移、傳播和基因流的影響效果，用以分析種群遺傳結(jié)構(gòu)與遺傳多樣性成因[69]。景觀遺傳分析是通過(guò)遺傳標(biāo)記（如分子標(biāo)記、生化標(biāo)記、細(xì)胞遺傳標(biāo)記、形態(tài)標(biāo)記等）確定種群的遺傳結(jié)構(gòu)，然后將遺傳結(jié)構(gòu)與環(huán)境特征進(jìn)行耦合分析[70]。譜系地理學(xué)主要以群體遺傳學(xué)和系統(tǒng)發(fā)育學(xué)的分析方法探討物種的歷史動(dòng)態(tài)，與景觀遺傳學(xué)的融合特別是應(yīng)用地理信息系統(tǒng)，可將地理空間數(shù)據(jù)和遺傳數(shù)據(jù)結(jié)合，更加有助于推斷和檢驗(yàn)物種的進(jìn)化過(guò)程[71]?；诜肿訕?biāo)記方法（微衛(wèi)星、擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性）構(gòu)建的遺傳學(xué)框架，直接將環(huán)境數(shù)據(jù)與基因組區(qū)域內(nèi)選擇下的基因位點(diǎn)相關(guān)聯(lián)，景觀遺傳學(xué)可用于分析藥用植物遺傳多樣性與環(huán)境因子的相關(guān)性，在研究環(huán)境與道地藥材的形成機(jī)制、瀕危藥用植物保護(hù)、栽培育種最適環(huán)境因素檢測(cè)等方面有著重要作用[68]。

Gao 等[72]研究表明，相比于地理距離，土壤鹽度是黃河三角洲蘆葦種群間的遺傳距離形成的主要原因。主要分布于北方和中原地區(qū)的連翹是我國(guó)暖溫帶地區(qū)具有代表性的藥用植物，研究發(fā)現(xiàn)，由于人類(lèi)對(duì)連翹果實(shí)的過(guò)度采摘，連翹的遺傳多樣性比中國(guó)其他種子植物的遺傳多樣性低，地理距離和溫度對(duì)連翹種群的遺傳分化起到顯著的促進(jìn)作用?；诰坝^遺傳學(xué)分析，可以將具有較高水平遺傳多樣性和大量稀有等位基因的種群優(yōu)先進(jìn)行保育[73]。Zhang 等[74]解析了導(dǎo)致香果樹(shù)群體局域適應(yīng)的環(huán)境因素，發(fā)現(xiàn)其擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性的部分離群位點(diǎn)受到了環(huán)境因子選擇，與每日平均溫差、季節(jié)溫度、最熱月的最高溫、年降水和季節(jié)降水5 個(gè)環(huán)境因子具有最強(qiáng)的相關(guān)性。

1.4 生態(tài)位模型分析

生態(tài)位模型是指基于生態(tài)位理論所建立的數(shù)學(xué)統(tǒng)計(jì)或預(yù)測(cè)模型，在實(shí)際工作中以已知樣本點(diǎn)的野外調(diào)查和標(biāo)本記錄為基礎(chǔ)，分析物種在生態(tài)位空間和環(huán)境空間中的特征來(lái)研究物種對(duì)環(huán)境的耐受能力，用于推測(cè)物種的分布[75-76]。生態(tài)位模型包括最大熵模型[77]、基于規(guī)則集的遺傳算法（genetic algorithm for rule-set production，GARP）生態(tài)位模型[78]、生物氣候分析系統(tǒng)[79]、生態(tài)位因子分析模型[80]、Grinnell生態(tài)位模型[81]。生態(tài)位模型的構(gòu)建原理主要基于已有物種的分布資料和環(huán)境數(shù)據(jù)，探索物種已知分布區(qū)的環(huán)境特征以及預(yù)測(cè)潛在分布區(qū)域[82]，建模過(guò)程可以解釋物種在此環(huán)境下的生存原因，預(yù)測(cè)物種可能的生存環(huán)境條件。生態(tài)位模型根據(jù)物種實(shí)際分布范圍和環(huán)境變量，通過(guò)一定的算法來(lái)預(yù)測(cè)物種能否在該區(qū)域生存，并推測(cè)或預(yù)測(cè)植物在全球過(guò)去和未來(lái)氣候變化下的潛在分布[77]。在藥用植物資源調(diào)查（資源蘊(yùn)藏量）與物種多樣性保護(hù)中有著良好的應(yīng)用與前景。

最大熵生態(tài)位模型目前運(yùn)用較廣，呂汝丹等[83]對(duì)羽葉鐵線(xiàn)蓮的潛在分布區(qū)和適宜等級(jí)進(jìn)行了預(yù)測(cè)。張海龍等[84]發(fā)現(xiàn)連翹的核心分布區(qū)主要位于我國(guó)中部和東部地區(qū)，推測(cè)了影響連翹分布的主導(dǎo)環(huán)境因子以及最適宜生長(zhǎng)的生態(tài)位參數(shù)，為連翹分布的研究、大范圍推廣種植等經(jīng)濟(jì)價(jià)值挖掘提供了理論指導(dǎo)。陳博等[85]綜合55 個(gè)生態(tài)因子分析了肉蓯蓉在甘肅省的生態(tài)適宜性分布區(qū)域。此外，遙感與地理信息系統(tǒng)技術(shù)也被應(yīng)用到生態(tài)位模型分析中對(duì)物種適生區(qū)進(jìn)行預(yù)測(cè)，如方清茂等[86]在對(duì)四川省地理環(huán)境、生態(tài)因子（海拔、氣候、土壤）等研究的基礎(chǔ)上，將四川省道地藥材劃分為4 個(gè)區(qū)，并確定了86 種川產(chǎn)道地藥材的適宜區(qū)與最適宜區(qū)，服務(wù)于四川省中藥材生產(chǎn)的合理布局與中藥材品質(zhì)提升。結(jié)合高分辨率的遺傳分化格局、地理分布、環(huán)境氣候變量推測(cè)物種的生態(tài)需求，揭示最適生長(zhǎng)環(huán)境，并預(yù)測(cè)資源蘊(yùn)藏量，是藥用植物種質(zhì)資源評(píng)價(jià)的一種重要方式。

1.5 性狀關(guān)聯(lián)分析

關(guān)聯(lián)分析也稱(chēng)關(guān)聯(lián)作圖、連鎖不平衡作圖，是以連鎖不平衡為基礎(chǔ)，鑒定某一群體內(nèi)目標(biāo)性狀與遺傳標(biāo)記或候選基因關(guān)系的分析方法[87]。關(guān)聯(lián)分析通常從具有廣泛遺傳多樣性的自然群體中選擇個(gè)體，對(duì)目標(biāo)性狀進(jìn)行完整和準(zhǔn)確的表型分析，基于分子標(biāo)記技術(shù)確定植物的群體結(jié)構(gòu)與親緣關(guān)系，利用統(tǒng)計(jì)軟件程序?qū)⒈硇团c基因型數(shù)據(jù)聯(lián)系起來(lái)[26]，可用來(lái)挖掘藥用植物關(guān)鍵性狀的功能基因、開(kāi)發(fā)功能標(biāo)記，在品系育種、改良性狀和品質(zhì)安全保障等方面具有良好的應(yīng)用潛力，該分析一般分為基于候選基因與基于全基因組的2 種類(lèi)型。

藥用植物種質(zhì)資源有豐富的基因資源，如抗病性、抗逆性以及一些特殊用途的基因等，利用關(guān)聯(lián)作圖可定位這些優(yōu)良性狀的基因位點(diǎn)，為藥用植物品種改良以及尋找藥用植物的新資源提供理論基礎(chǔ)[88]。研究發(fā)現(xiàn)，黃芩中與總皂苷和總黃酮含量發(fā)生關(guān)聯(lián)的基因位點(diǎn)共61 個(gè)，其中16 個(gè)是2 個(gè)性狀共同的關(guān)聯(lián)位點(diǎn)，有5 個(gè)是與總黃酮和甲苷含量性狀同時(shí)關(guān)聯(lián)的位點(diǎn)[89]；劉穎等[90]發(fā)現(xiàn)甘草的3 個(gè)功能基因拷貝數(shù)的組合多態(tài)性與其產(chǎn)地、形態(tài)及甘草酸量具有關(guān)聯(lián)性，可能成為解釋藥材道地性形成機(jī)制的關(guān)鍵因素之一。Cu/Zn-SOD基因與Mn/Fe-SOD基因分別為吳茱萸的親水性酸性氨基酸與親水性堿性蛋白的編碼基因，該成果為提高吳茱萸抗旱能力以及抗旱新品種選育奠定了重要的理論基礎(chǔ)[91]。

2 進(jìn)化生態(tài)學(xué)在藥用植物種質(zhì)資源評(píng)價(jià)中的應(yīng)用及前景分析

2.1 藥用植物種質(zhì)鑒定

藥用植物種質(zhì)鑒定是種質(zhì)資源評(píng)價(jià)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，對(duì)于確定原植物、確保藥效、合理保存利用現(xiàn)有種質(zhì)、尋找開(kāi)發(fā)新的藥用植物等研究工作具有重要意義[92]。鑒定是在資源類(lèi)群中鑒別目標(biāo)優(yōu)質(zhì)種質(zhì)材料，在藥用植物資源的保存中去偽存真，提高保存效率。傳統(tǒng)上藥用植物種質(zhì)鑒定主要存在2 個(gè)問(wèn)題：首先，對(duì)于形態(tài)相似的易混淆種或近緣種（遺傳上）難以準(zhǔn)確確定；其次，鑒定方法單一，沒(méi)有將植物性狀或化學(xué)成分的鑒定結(jié)果與產(chǎn)地生境相關(guān)聯(lián)。進(jìn)化生態(tài)學(xué)研究方法的融入很好地解決了這2 個(gè)問(wèn)題。

一方面，分子標(biāo)記技術(shù)在易混淆種與近緣種鑒定方面具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，通過(guò)基因片段分析，從本質(zhì)上反映不同個(gè)體或群體間的差異，對(duì)易混淆種與近緣種進(jìn)行準(zhǔn)確快速地鑒定。如“骨碎補(bǔ)”是用于治療骨折和相關(guān)骨病的傳統(tǒng)中藥材，藥材市場(chǎng)上存在大量形態(tài)相似的其他干燥根狀莖混偽品，通過(guò)葉綠體基因組測(cè)序篩選的trnS-psb30、rbcL-accD、ndhB-trnR3 個(gè)SCAR 標(biāo)記，只需通過(guò)PCR 擴(kuò)增和瓊脂糖凝膠電泳即可實(shí)現(xiàn)對(duì)“骨碎補(bǔ)”準(zhǔn)確高效的鑒定[93]。熊瑤等[94]選取了幾種不同的DNA 條形碼序列對(duì)雞血藤及其偽品做了鑒定，確定了以ITS2為主、psbA-trnH 序列為輔的快速、準(zhǔn)確的鑒定方法。另一方面，受進(jìn)化生態(tài)學(xué)的啟示，不少學(xué)者將藥用植物的植物學(xué)性狀與產(chǎn)地相關(guān)聯(lián)，實(shí)現(xiàn)了藥用植物的產(chǎn)地鑒定，為道地藥材的研究提供了理論基礎(chǔ)。陳瑞芳等[95]將烏藥的顯微特征與環(huán)境相關(guān)聯(lián)，發(fā)現(xiàn)6 種不同產(chǎn)地的烏藥粉末特征存在明顯區(qū)別，可用于不同產(chǎn)地烏藥及其偽品的鑒別。顧志榮等[96]采用主成分分析方法，實(shí)現(xiàn)了基于傅里葉變換紅外光譜儀及化學(xué)計(jì)量學(xué)方法的不同產(chǎn)地鎖陽(yáng)藥材的分類(lèi)鑒別。

2.2 藥用植物種質(zhì)多樣性評(píng)估

種質(zhì)資源主要是指遺傳資源。遺傳多樣性又稱(chēng)為基因多樣性，經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期自然選擇而產(chǎn)生，是演化的指標(biāo)之一。藥用植物的遺傳多樣性越高，環(huán)境適應(yīng)能力可能就越強(qiáng)[97]。種質(zhì)資源多樣性是藥用植物種質(zhì)鑒定、利用基因資源、引種栽培和資源保護(hù)的基礎(chǔ)[98]。研究藥用植物遺傳多樣性，了解種間及種內(nèi)的遺傳變異，有利于探索瀕危藥用植物的機(jī)制、制定科學(xué)保護(hù)措施與選育方針[99]。

DNA 分子標(biāo)記可用來(lái)檢測(cè)遺傳多樣性，相比于形態(tài)學(xué)和細(xì)胞學(xué)等傳統(tǒng)多樣性手段，分子標(biāo)記直接檢測(cè)DNA 變異模式，不受植物表型與環(huán)境因素影響，更具準(zhǔn)確性；同時(shí)，分子標(biāo)記不僅可以檢測(cè)種內(nèi)遺傳多樣性，還可比較種間遺傳多樣性，確定優(yōu)先保護(hù)順序[100]。分子標(biāo)記各類(lèi)方法已被應(yīng)用于梔子[101]、天麻[102]、金蕎麥[103]等多種藥用植物的遺傳多樣性與親緣關(guān)系分析。再者，物種遺傳多樣性不僅與個(gè)體差異有關(guān)，而且受地理分布與環(huán)境影響[104]。分子譜系地理與景觀遺傳分析手段可探索地理格局與環(huán)境因素對(duì)種群遺傳結(jié)構(gòu)、基因流的影響，揭示藥用植物進(jìn)化歷史與種群間關(guān)系，為瀕危藥用植物的保護(hù)提供參考措施[100]。AFLP 分子標(biāo)記揭示了忍冬種內(nèi)存在高度遺傳多樣性，且遺傳差異存在明顯的地域性[105]；谷聰?shù)萚106]利用AFLP 分子標(biāo)記和HPLC技術(shù)，研究了環(huán)境對(duì)黨參屬不同植物遺傳結(jié)構(gòu)和化學(xué)成分的影響，發(fā)現(xiàn)黨參種間遺傳背景的相似性與地理空間有關(guān)，其化學(xué)成分易受栽培環(huán)境的影響；孫曉等[107]基于遺傳-化學(xué)-生態(tài)策略，對(duì)西洋參轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)、人參皂苷含量及環(huán)境氣候生態(tài)因子3 者進(jìn)行了相關(guān)性分析，為闡釋西洋參兩大生態(tài)型品質(zhì)變異的形成機(jī)制提供了新思路。

2.3 藥用植物資源調(diào)查與預(yù)測(cè)

我國(guó)藥用植物種類(lèi)繁多，涉及83 科2309 屬11146 種，占中藥資源種類(lèi)的87%[108]。然而，由于植物本身生長(zhǎng)的生態(tài)地理環(huán)境具有差異性，致使藥用植物野生資源的分布呈現(xiàn)一定的地域性，資源中的有效成分質(zhì)量和數(shù)量也因此呈現(xiàn)了地域性差異[109]。進(jìn)化生態(tài)學(xué)對(duì)了解藥用植物的分布范圍與潛在蘊(yùn)藏量具有重要意義。生態(tài)位模型分析、景觀遺傳分析等方法可用來(lái)推測(cè)藥用植物對(duì)環(huán)境因子的適應(yīng)性，為預(yù)測(cè)藥用植物在野外分布情況及評(píng)估中藥材野生資源蘊(yùn)藏量提供了有效的理論指導(dǎo)。地理和氣候等因素所致的土壤環(huán)境異質(zhì)性，以及距離及宿主選擇等隔離因素所致的離散限制性，是藥用植物微生態(tài)地理分異的主要成因[110]。氣候因子對(duì)道地藥材品質(zhì)和產(chǎn)地產(chǎn)生了重要影響，通過(guò)生態(tài)位模型分析可以預(yù)測(cè)道地藥材的遷移分布[111]。張海龍[112]基于GARP 生態(tài)位模型和氣候環(huán)境圖層建模，定性、定量地推測(cè)了桃兒七在我國(guó)的潛在適生分布區(qū)的面積與位置，為該中藥材適生區(qū)研究提供了參考。袁峰[113]通過(guò)譜系地理和生態(tài)位模型分析揭示了印度北阿肯德邦及中國(guó)西藏那曲地區(qū)南部、西藏林芝地區(qū)北部、青海環(huán)青海湖地區(qū)、川西地區(qū)、滇西北地區(qū)為冬蟲(chóng)夏草的適宜生長(zhǎng)區(qū)域。

2.4 藥用植物道地性研究

道地性可看作道地藥材的特有屬性，主要通過(guò)道地藥材的質(zhì)量性狀（如外觀、所含次生代謝產(chǎn)物）、遺傳性狀、生境等特性來(lái)體現(xiàn)，是道地藥材的遺傳背景、表型與環(huán)境在長(zhǎng)期協(xié)同進(jìn)化過(guò)程中產(chǎn)生的[114]。由于道地藥材較同種其他產(chǎn)區(qū)中藥材的品質(zhì)好、療效佳，具有重要的研究意義以及開(kāi)發(fā)利用價(jià)值[60]。道地性的評(píng)價(jià)主要包括道地藥材的遺傳多樣性與形成機(jī)制、道地藥材基原鑒定、道地藥材地理變異與環(huán)境適應(yīng)性研究、道地藥材的栽培選育等方面。

進(jìn)化生態(tài)學(xué)涉及的分析方法已在道地藥材的研究中得到了廣泛運(yùn)用。首先，藥用植物種質(zhì)鑒定、遺傳多樣性評(píng)估對(duì)于道地藥材形成機(jī)制具有重要意義。通過(guò)分子標(biāo)記（如RAPD、AFLP、ISSR、SSR），連翹[115]、對(duì)葉百部[116]、烏頭[117]等道地藥材的遺傳多樣性式樣已得到相關(guān)解析。對(duì)名優(yōu)道地藥材的遺傳信息進(jìn)行比較分析，可進(jìn)一步找到劃分藥用植物種質(zhì)檔次的分子標(biāo)記，以促進(jìn)藥用植物的道地性研究[118]。其次，由于道地藥材來(lái)自固定產(chǎn)區(qū)，所以道地藥材的形成與地理、氣候環(huán)境存在極大關(guān)系[119-120]。道地藥材具有逆境性，是環(huán)境脅迫的結(jié)果[121]，道地藥材在長(zhǎng)期適應(yīng)特定脅迫的過(guò)程中，不斷積累相關(guān)遺傳及表觀遺傳變異，成為其品質(zhì)形成的重要條件[122]。表型特征尤其是次生代謝產(chǎn)物的種類(lèi)與數(shù)量是道地藥材優(yōu)于其他同種藥材的標(biāo)志，也是其藥用效果優(yōu)良的主要原因[123]，采用關(guān)聯(lián)分析法定位控制次生代謝產(chǎn)物的基因位點(diǎn)[88]，可從基因水平研究道地性形成機(jī)制。

2.5 藥用植物的保護(hù)與栽培育種

我國(guó)藥用植物野生資源豐富，但由于一些資源的市場(chǎng)需求量大、不合理采挖、生境破環(huán)等原因，許多藥用植物野生資源量逐年下降，甚至處于瀕危狀態(tài)[109]。因此，對(duì)藥用植物尤其是瀕危藥用植物資源的保護(hù)迫在眉睫。藥用植物遺傳多樣性研究可提供科學(xué)的保護(hù)措施，親緣關(guān)系分析為尋找替代資源或藥物以緩解中藥材市場(chǎng)壓力提供了有效途徑。另外，藥用植物的人工栽培也是緩解我國(guó)中藥材資源市場(chǎng)壓力、保護(hù)瀕危中藥材野生資源的有效措施，是選育高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)品種、保證中藥材質(zhì)量、提高有效成分含量的可靠且有效的手段[124]。

選取優(yōu)良栽培種是人工栽培的第1 步，首先，通過(guò)藥用植物資源調(diào)查與遺傳多樣性分析可判斷藥用植物的人工栽培需求，并選取優(yōu)良性狀品種。如袁慶軍等[60]提出，黃芩來(lái)源多樣，不同種源黃芩間具有豐富的遺傳多樣性，但與地理分布沒(méi)有相關(guān)性，所以應(yīng)注重種子的選育和管理。其次，藥用植物的分子育種目標(biāo)是提高藥用部位的生物產(chǎn)量和藥用成分含量[125]，而藥用植物有效成分多為次生代謝產(chǎn)物，受地理環(huán)境影響大，通過(guò)對(duì)分子譜系地理學(xué)、景觀模型與生態(tài)位建模等，可揭示野生藥用植物種群進(jìn)化歷史、推測(cè)藥用植物最適環(huán)境因子，為選取適合栽培品種以及栽培環(huán)境提供理論指導(dǎo)。如氣候與土壤因子會(huì)影響杜仲次生代謝產(chǎn)物的積累，土壤中含有堿解氮、速效鉀和有機(jī)質(zhì)較高的地區(qū)，杜仲品質(zhì)較優(yōu)，為杜仲的規(guī)范化種植提供了參考[126]。此外，藥用植物的次生代謝產(chǎn)物主要為多基因調(diào)控，其含量多屬于數(shù)量性狀。Doebley[127]指出，數(shù)量性狀基因都是復(fù)雜代謝過(guò)程的一個(gè)環(huán)節(jié)，很難利用轉(zhuǎn)化的方法予以驗(yàn)證，在對(duì)候選基因的網(wǎng)絡(luò)代謝調(diào)控系統(tǒng)不是很清楚的情況下，可以利用關(guān)聯(lián)分析驗(yàn)證其功能。通過(guò)關(guān)聯(lián)分析標(biāo)記功能基因，選出優(yōu)良基因型并使之固定，培育優(yōu)良中藥材。Graham等[128]通過(guò)對(duì)黃花蒿的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行深度測(cè)序，識(shí)別了控制青蒿素產(chǎn)量的基因和遺傳標(biāo)記SNP，利于快速育種。在牛蒡[129]、遠(yuǎn)志[130]、青風(fēng)藤[131]、白花丹[132]等藥用植物的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中分別發(fā)現(xiàn)與木脂素、三萜皂苷、青藤堿和白花丹素等化合物合成相關(guān)的基因，為此類(lèi)藥用植物優(yōu)良種質(zhì)資源的篩選提供了重要的理論依據(jù)。

基于進(jìn)化生態(tài)學(xué)方法的藥用植物種質(zhì)資源評(píng)價(jià)指標(biāo)和常用方法見(jiàn)表1。

3 進(jìn)化生態(tài)學(xué)應(yīng)用于藥用植物種質(zhì)資源評(píng)價(jià)的中文學(xué)術(shù)文獻(xiàn)分析

本文統(tǒng)計(jì)了自1990年以來(lái)，基于進(jìn)化生態(tài)學(xué)相關(guān)研究與分析方法開(kāi)展藥用植物種質(zhì)資源評(píng)價(jià)的中文學(xué)術(shù)文獻(xiàn)情況。以中藥資源生態(tài)適宜性、藥用植物遺傳多樣性、道地性研究、瀕危藥用植物保護(hù)、藥用植物栽培育種等作為統(tǒng)計(jì)指標(biāo)，將以上指標(biāo)及其相關(guān)詞匯作為關(guān)鍵詞在中國(guó)知網(wǎng)、萬(wàn)方數(shù)據(jù)資源系統(tǒng)、維普中文科技期刊數(shù)據(jù)庫(kù)內(nèi)進(jìn)行檢索，檢索范圍限制在1990—2020年。同時(shí)，以每5年1個(gè)時(shí)間段對(duì)上述5 個(gè)指標(biāo)的學(xué)術(shù)文獻(xiàn)數(shù)量趨勢(shì)變化進(jìn)行統(tǒng)計(jì)（圖2）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，這5 個(gè)指標(biāo)在同一文獻(xiàn)中有時(shí)會(huì)相互交叉滲透，但各有側(cè)重。按照論文主要闡釋的問(wèn)題進(jìn)行篩選、歸類(lèi)，以藥用植物遺傳多樣性、道地性研究、中藥資源生態(tài)適宜性、藥用植物栽培育種、瀕危藥用植物保護(hù)為主題的學(xué)術(shù)文獻(xiàn)分別有257、213、186、59、34 篇。進(jìn)化生態(tài)學(xué)研究方法在藥用植物栽培育種和瀕危藥用植物保護(hù)的研究成果略少且增長(zhǎng)趨勢(shì)較為平緩；得益于分子標(biāo)記技術(shù)的廣泛使用，藥用植物遺傳多樣性的相關(guān)研究較多，但在2006年以后增長(zhǎng)一直較緩；道地性研究在2006年以后有所回落，但2011年之后又逐步上升。值得注意的是，中藥資源生態(tài)適宜性自2011年之后持續(xù)上升，一定程度上反映了越來(lái)越多的國(guó)內(nèi)學(xué)者關(guān)注藥用植物資源與生態(tài)環(huán)境之間的相關(guān)性。

表1 基于進(jìn)化生態(tài)學(xué)的藥用植物種質(zhì)資源評(píng)價(jià)指標(biāo)Table 1 Evaluation indices of germplasm resources of medicinal plants based on evolutionary ecology

圖2 進(jìn)化生態(tài)學(xué)應(yīng)用于藥用植物種質(zhì)資源評(píng)價(jià)的中文學(xué)術(shù)文獻(xiàn)分析Fig.2 Chinese academic literature analysis on evaluation of germplasm resources of medicinal plants with methodology of evolutionary ecology

4 結(jié)語(yǔ)與展望

基于進(jìn)化生態(tài)學(xué)的藥用植物種質(zhì)資源評(píng)價(jià)對(duì)于中藥資源的可持續(xù)利用、中藥療效發(fā)揮、中藥材的生產(chǎn)開(kāi)發(fā)等均具有重要的理論指導(dǎo)意義。以往的評(píng)價(jià)方式大多側(cè)重藥用植物化學(xué)成分與藥效作用等方面的研究，從進(jìn)化生態(tài)學(xué)的角度，將藥用植物的遺傳背景、化學(xué)成分與地理環(huán)境進(jìn)行關(guān)聯(lián)的整合性研究相對(duì)較少。進(jìn)化生態(tài)學(xué)的相關(guān)研究手段為藥用植物種質(zhì)資源評(píng)價(jià)提供了新思路，并不斷完善其評(píng)價(jià)體系。目前，分子標(biāo)記、分子譜系地理分析、景觀遺傳分析、生態(tài)位模型等方法在基原鑒定、藥材道地性、替代資源開(kāi)發(fā)、瀕危藥用植物保護(hù)等方面的應(yīng)用呈現(xiàn)快速增長(zhǎng)趨勢(shì)。但是，結(jié)合基因組和大數(shù)據(jù)時(shí)代的分子生物學(xué)、統(tǒng)計(jì)學(xué)、生物信息學(xué)等學(xué)科領(lǐng)域的前沿技術(shù)，利用基于多變量模型的表型和基因型的相關(guān)性分析，如包含全基因組關(guān)聯(lián)分析的數(shù)量性狀位點(diǎn)定位[148]、集團(tuán)分離分析（BSA-seq）定位[149-150]和群體遺傳的選擇壓力分析[151]，并進(jìn)一步耦合生態(tài)環(huán)境因子進(jìn)行性狀-多環(huán)境定位分析及數(shù)量性狀位點(diǎn)與環(huán)境互作，開(kāi)展中藥材道地性形成的特定功能基因精準(zhǔn)和深度挖掘，揭示優(yōu)良的種質(zhì)資源和道地藥材形成的遺傳因素，高效利用分子技術(shù)輔助選擇育種，建立更完善的藥用植物種質(zhì)資源基因數(shù)據(jù)庫(kù)，開(kāi)展基因編輯以此提升有效成分的積累等方面，還具有巨大的研究潛力和技術(shù)改良空間。另外，隨著空間技術(shù)的發(fā)展，利用地理信息和遙感系統(tǒng)可以更加快捷地獲取藥用植物野生資源的海量高分辨率生態(tài)學(xué)信息（非生物、生物、人為等因子數(shù)據(jù)），能更客觀的推測(cè)藥用植物的生態(tài)適宜性，可進(jìn)行更精準(zhǔn)的資源蘊(yùn)藏量評(píng)估和中草藥種植指導(dǎo)。有望通過(guò)科學(xué)調(diào)控與改良生長(zhǎng)環(huán)境因子，改善中藥材品質(zhì)，從而提高療效與產(chǎn)量。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突