張 昭，王 鵬，姚志鳳，秦立峰，何東健*，徐 炎，張劍俠，胡靜波

1. 西北農(nóng)林科技大學(xué)機(jī)械與電子工程學(xué)院，陜西 楊凌 712100 2. 寶雞文理學(xué)院電子電氣工程學(xué)院，陜西 寶雞 721016 3. 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)業(yè)物聯(lián)網(wǎng)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西 楊凌 712100 4. 陜西省農(nóng)業(yè)信息感知與智能服務(wù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西 楊凌 712100 5. 西北農(nóng)林科技大學(xué)園藝學(xué)院，陜西 楊凌 712100 6. 旱區(qū)作物逆境生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西 楊凌 712100

引 言

霜霉病是全球第一大葡萄病害，具有分布廣、流行性強(qiáng)，危害大等特點(diǎn)。該病是葡萄霜霉菌(P. viticola)引起的真菌病害，在春夏多雨潮濕的地區(qū)發(fā)生，由葉背面的氣孔侵入寄主，早期癥狀為葉背面上出現(xiàn)白色霜狀霉層。防治實(shí)踐表明，在侵染初期需要及時(shí)防治，否則會(huì)造成病情難以控制，顆粒無收甚至毀園。為了實(shí)現(xiàn)在霜霉菌侵染初期進(jìn)行早期預(yù)防，要求對(duì)葡萄霜霉病侵染進(jìn)行早期檢測，在病菌剛剛侵染、病情容易控制的階段檢測出來，為霜霉病的防治情報(bào)提供及時(shí)、準(zhǔn)確的信息，對(duì)提高農(nóng)藥利用效果，減少農(nóng)藥使用量，控制和切斷霜霉病大面積蔓延，提高葡萄品質(zhì)和葡萄園精細(xì)化管理水平，增加生產(chǎn)效益等均具有重要意義。

目前，生產(chǎn)中早期診斷葡萄霜霉病，廣泛采用田間觀察和室內(nèi)檢驗(yàn)方法。田間觀察法只能由人對(duì)田間生長的葡萄葉片和果實(shí)進(jìn)行肉眼觀察后憑經(jīng)驗(yàn)判斷，評(píng)價(jià)因人的經(jīng)驗(yàn)而異、主觀性強(qiáng)，且在病癥不可見時(shí)無法做出判斷。室內(nèi)檢驗(yàn)法一般將疑似病葉離體培養(yǎng)，在顯微鏡下進(jìn)行形態(tài)觀察，確定病原菌。此外，也可利用PCR(polymerase chain reaction)技術(shù)進(jìn)行更精確檢測，但該方法必須在實(shí)驗(yàn)室提取DNA，并預(yù)先設(shè)計(jì)PCR引物，操作復(fù)雜耗時(shí)，需要專業(yè)的人員和設(shè)備。以上方法均無法實(shí)現(xiàn)方便快捷的霜霉病早期檢測。近年來，非侵入的光譜成像技術(shù)在農(nóng)作物病害檢測研究方面取得了許多成果，能夠在時(shí)間和空間維度上同時(shí)獲取精準(zhǔn)的病害信息[1]?？梢姽?、熱紅外、高光譜、熒光等光譜成像技術(shù)都有檢測葡萄霜霉病的潛力，可見光圖像簡便快速，但局限于肉眼可見病害的檢測； 高光譜成像技術(shù)能同時(shí)檢測到葉片表面和內(nèi)部信息，但設(shè)備復(fù)雜昂貴； 熱紅外圖像技術(shù)受環(huán)境影響較大，檢測植物病害時(shí)需要嚴(yán)格控制環(huán)境溫濕度。熒光成像技術(shù)能實(shí)現(xiàn)病癥出現(xiàn)前的潛育期檢測[2-4]，對(duì)霜霉病早期檢測更具優(yōu)勢。

受到病害侵染時(shí)，植物的防御反應(yīng)會(huì)產(chǎn)生抑制病菌的次生代謝產(chǎn)物，多光譜熒光成像技術(shù)(multicolor fluorescence imaging,MFI)用固定波長的紫外光照射植物激發(fā)出熒光，在熒光發(fā)射光譜有多個(gè)特征性波峰，可以靈敏地反映植物次生代謝水平、防御機(jī)制響應(yīng)和葉綠素含量的變化，從而便捷的檢測植物脅迫狀態(tài)。Pineda M和Pérez Bueno[5-7]等用MFI對(duì)受軟腐病侵染的西葫蘆和甜瓜葉片、感染根腐病的向日葵幼苗成功進(jìn)行了早期檢測。Yao[8]等用MFI和葉綠素?zé)晒獬上窠Y(jié)合機(jī)器學(xué)習(xí)技術(shù)對(duì)受干旱脅迫3天和7天的擬南芥植株與對(duì)照植株的分類準(zhǔn)確率分別為93.3%和99.1%。Lei[9]等研發(fā)了葉片農(nóng)藥殘留快速檢測MFI系統(tǒng)，在190～300 nm的紫外光激勵(lì)下，有機(jī)磷農(nóng)藥氧樂果污染葉片在440 nm的熒光發(fā)射光譜峰值與農(nóng)藥濃度具有良好的線性關(guān)系。雖然MFI進(jìn)行植物脅迫早期檢測研究取得了一些成果，但目前基于MFI進(jìn)行葡萄霜霉病早期檢測研究的報(bào)道很少。

為及時(shí)準(zhǔn)確的對(duì)葡萄霜霉病侵染進(jìn)行早期檢測，以“赤霞珠”品種葡萄全葉片為研究對(duì)象，研究基于MFI的葡萄霜霉病早期檢測方法。通過分析接種和健康葉片連續(xù)6天背面多光譜熒光圖像，試圖揭示從接種到顯癥連續(xù)多天熒光波段的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律，探明多光譜熒光參數(shù)對(duì)霜霉病早期檢測的敏感程度和可靠性； 通過選出的多光譜熒光特征參數(shù)構(gòu)建基于SVM(support vector machine,SVM)的多光譜熒光葡萄霜霉病早期檢測模型，為實(shí)現(xiàn)霜霉病癥前早期檢測提供依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 樣品制備

2019年1月將20株一年生“赤霞珠”葡萄幼苗移植在花盆中，在溫度為25 ℃溫室中培養(yǎng)。如圖1(a,b,c)所示，接種實(shí)驗(yàn)分為如下3個(gè)步驟：

(1)制備健康葉片。摘取每個(gè)枝條上4～6節(jié)葉齡、大小相近的健康葉片，在實(shí)驗(yàn)室消毒后置于用濾紙保濕的培養(yǎng)皿中備用。

(2)接種霜霉菌。按照霜霉病離體接種的方法[10]，將制好的孢子懸浮液(孢子濃度為5×105個(gè)·mL-1)均勻噴施于選取的健康葉片背面，同樣數(shù)量的健康葉片噴等量無菌水作為對(duì)照。

(3)隔離培養(yǎng)。裝有健康和接種葉片的培養(yǎng)皿放置于同一個(gè)氣候箱的不同層。氣候箱溫度為18 ℃，相對(duì)濕度為80%，光照為18 000 Lx，8 h黑暗，16 h光照，模擬自然光照節(jié)律[10]。

以上試驗(yàn)一共成功接種了145片葡萄葉片，同時(shí)有145片健康葉片對(duì)照。

圖1 育苗(a)、接種(b)和培養(yǎng)(c)過程Fig.1 Process of seedling (a), inoculation (b) and culture (c)

1.2 多光譜熒光圖像的采集

本研究采用的FluorCam FC800-O(Photon Systems Instruments公司)MFI系統(tǒng)由四個(gè)LED光源板、支架、控制單元及FluorCam成像分析軟件組成(圖2)。成像面積為20 cm×20 cm，鏡頭到樣本的距離為25 cm。通過預(yù)試驗(yàn)對(duì)系統(tǒng)運(yùn)行參數(shù)進(jìn)行了設(shè)置，多光譜熒光圖像分辨率選擇696×520，紫外光強(qiáng)100，敏感度6%，曝光時(shí)間為100 ms。為消除外部光線干擾，成像區(qū)域用黑布遮蓋。

每天18:00—22:00對(duì)所有試驗(yàn)葉片進(jìn)行一次多光譜熒光成像，采集290個(gè)葉片每個(gè)葉片16個(gè)熒光參數(shù)圖像，直到6DPI葉片出現(xiàn)肉眼可見霜霉層。采集時(shí)首先對(duì)待測葉片暗適應(yīng)20 min，用吸水紙吸去葉片表面水分，分別將健康和接種葉片逐一放入成像區(qū)域中央，用338 nm的紫外光對(duì)葡萄葉片激發(fā)，產(chǎn)生具有4個(gè)特征性波峰的熒光發(fā)射光譜，通過轉(zhuǎn)換四個(gè)濾波片獲取這四個(gè)波段的熒光圖像： 藍(lán)光440 nm(F440)、綠光520 nm(F520)、紅光690 nm(F690)和遠(yuǎn)紅光740 nm(F740)。同時(shí)系統(tǒng)自動(dòng)獲取了四個(gè)波段兩兩比值的12個(gè)熒光參數(shù)圖像[圖2(b)]。用顯微鏡觀察并拍攝葉片局部顯微圖像，記錄葉片發(fā)病狀況。最后將葉片放回培養(yǎng)皿，噴無菌水保濕，封口膠纏繞后繼續(xù)培養(yǎng)。

圖2 FluorCam FC800-O開放式熒光成像系統(tǒng)(a)： 設(shè)備外觀； (b)： 軟件界面Fig.2 Open fluorescence imaging system of FluorCam FC800-O(a)： Equipment appearance； (b)： Software interface

1.3 多光譜熒光數(shù)據(jù)分析和建模方法

用系統(tǒng)自帶的Fluorcam軟件進(jìn)行圖像和數(shù)據(jù)預(yù)處理： 設(shè)定假彩色圖像的顏色模式和標(biāo)尺，選擇全葉片為感興趣區(qū)域(region of interest，ROI)，進(jìn)行背景分割，計(jì)算ROI平均光譜強(qiáng)度。獲取了試驗(yàn)葉片連續(xù)6天16個(gè)熒光參數(shù)的圖像和熒光強(qiáng)度。16個(gè)熒光參數(shù)包括4個(gè)單獨(dú)波段的基礎(chǔ)熒光參數(shù)F440，F(xiàn)520，F(xiàn)690和F740，其余12個(gè)是基礎(chǔ)熒光參數(shù)的兩兩之間的比值F440/F520，F(xiàn)440/F690，F(xiàn)440/F740，F(xiàn)520/F440，F(xiàn)520/F690，F(xiàn)520/F740，F(xiàn)690/F440，F(xiàn)690/F520，F(xiàn)690/F740，F(xiàn)740/F440，F(xiàn)740/F520和F740/F690。

分析對(duì)比健康和接種葉片不同DPI下四個(gè)熒光波段的圖像，用單因素方差分析評(píng)估不同熒光參數(shù)的檢測霜霉病侵染的能力，并對(duì)16個(gè)參數(shù)進(jìn)行Pearson相關(guān)性分析，從中篩選出檢測霜霉病侵染的4個(gè)特征輸入單波段特征閾值分類器和支持向量機(jī)模型進(jìn)行健康和接種葉片的判別。閾值分類采用最大類間方差法(大津法)分別計(jì)算4個(gè)優(yōu)選特征的閾值。SVM構(gòu)建最優(yōu)決策超平面，使訓(xùn)練數(shù)據(jù)集中兩類樣本與該超平面的距離最大化，具有良好的泛化能力，特別適合于二分類小樣本問題。數(shù)據(jù)集為獲取的290個(gè)葉片連續(xù)6天多光譜熒光16個(gè)參數(shù)值。所有接種樣本設(shè)置標(biāo)簽為“1”，健康樣本標(biāo)簽為“0”，交叉驗(yàn)證取平均以增強(qiáng)分類器的準(zhǔn)確率和魯棒性[11]。單因素方差分析、閾值分類和相關(guān)性分析在matlab R2016a環(huán)境下完成，SVM模型用matlab R2016a神將網(wǎng)絡(luò)工具箱和libsvm3.23matlab工具箱編程實(shí)現(xiàn)。

2 結(jié)果與討論

2.1 接種霜霉病葉片癥狀

接種霜霉菌后每天用顯微鏡(OLYMPUS CX31)觀察并拍攝霜霉病發(fā)展過程(圖3)，發(fā)現(xiàn)1DPI—3DPI葉片上沒有病癥，從4DPI開始在最早顯癥的葉片區(qū)域出現(xiàn)菌絲和孢子囊[圖3(b)]，直到6DPI葉片上布滿霜霉層[圖3(d)]。健康葉片在整個(gè)試驗(yàn)周期內(nèi)均保持鮮綠。

圖3 顯微鏡下接種葡萄葉片霜霉病發(fā)展過程(a)： 3DPI； (b)： 4DPI； (c)： 5DPI； (d)： 6DPIFig.3 Microscope observation of the development of downy mildew on grape infected leaves(a)： 3DPI； (b)： 4DPI； (c)： 5DPI； (d)： 6DPI

2.2 多光譜熒光各波段圖像隨病害侵染變化分析

根據(jù)葉片發(fā)病癥狀和位置，圖4對(duì)比了病斑RGB圖像和多光譜熒光圖像，發(fā)現(xiàn)在6DPI才顯癥的病斑妮在葉片2DPI的熒光圖像中凸顯： 在2DPI的F440和F520圖像中，紅色高亮區(qū)域與6DPI顯癥病斑位置高度吻合，F(xiàn)690和F740圖像中，病斑區(qū)域與周圍區(qū)域差異不明顯。

考察病斑區(qū)域的基礎(chǔ)上，分析連續(xù)多天健康和接病葉片在多光譜熒光各波段下的圖像變化(如圖5所示)隨著DPI增加，對(duì)于接種葉片，F(xiàn)440和F520圖像逐漸從深藍(lán)變向黃綠(熒光強(qiáng)度變大)。而F690和F740則與之相反，從黃綠變向淺藍(lán)(熒光強(qiáng)度變小)。F440和F520比F690和F740的變化更快速、更顯著。健康葉片各波段圖像隨DPI增加變化則很小。

圖4 病斑RGB圖像和2DPI多光譜熒光圖像Fig.4 RGB Images and MFI multicolor fluorscenceimages at 2dpi in lesion area

從病斑區(qū)域和全葉片連續(xù)6天的多光譜熒光圖像變化可以看出： 霜霉病的侵染會(huì)導(dǎo)致F440和F520升高，F(xiàn)690和F740降低，F(xiàn)440和F520波段2DPI圖像能準(zhǔn)確確定6DPI肉眼可見的病斑位置，健康和接種葉片熒光圖像隨DPI增加差異顯著。

2.3 多光譜熒光各波段方差分析

通過單因素方差分析能評(píng)估熒光參數(shù)對(duì)霜霉病侵染的敏感性。4個(gè)多光譜熒光波段均值隨DPI的變化和單因素方差分析表明(圖6)，隨著DPI增加，接種葉片藍(lán)綠熒光(F440與F520)均快速升高，在2DPI接種葉片F(xiàn)520和F440顯著高于健康葉片(p<0.01),并隨著接種天數(shù)的增加顯著性不斷增強(qiáng)(p<0.001)。接種葉片紅色熒光(F690)和遠(yuǎn)紅熒光(F740)均隨著DPI增加緩慢降低，1DPI—3DPI在F690和F740波段接種和健康葉片無顯著差異，從4DPI開始差異顯著(p<0.05)，5DPI—6DPI差異迅速增加(p<0.01)。表明F740和F690能檢測到霜霉病侵染，但沒有F440和F520波段敏感。

圖5 健康和接種葡萄葉片四個(gè)熒光波段連續(xù)6天圖像

圖6 霜霉病接種和對(duì)照葡萄葉片在4個(gè)波段連續(xù)6天的熒光強(qiáng)度均值和方差 顯著性標(biāo)注為： *p<0.05; **p<0.01; ***p< 0.001； ****p<0.000 1Fig.6 Means and variances of fluorescence intensity for P. viticola infected andCK grape leaves at six consecutive days evaluated with four wavelengthsStatistically!significant differences are indicated (*p<0.05; **p<0.01; ***p<0.001； ****p<0.0001)

Oerke[12]等用高光譜成像方法能在葡萄葉背面出現(xiàn)霜霉菌孢子前1～2 d發(fā)現(xiàn)反射光譜的變化，本研究在2DPI(葉背面出現(xiàn)孢子前4天)檢測出健康和接種葉片多光譜熒光圖像和熒光光譜強(qiáng)度的顯著差異(p<0.001)，比文獻(xiàn)研究結(jié)果提前了2天，而且本研究所用“赤霞珠”品種相比文獻(xiàn)使用的品種“米勒”對(duì)霜霉病更具抗性，更不易感染。說明MFI比高光譜成像技術(shù)對(duì)霜霉病早期侵染更敏感，能更早發(fā)現(xiàn)病害。同時(shí)MFI技術(shù)采用固定波長的LED作為激發(fā)光源，用濾波片提取病害敏感熒光波段就可以實(shí)現(xiàn)霜霉病早期檢測，比高光譜成像技術(shù)方法簡便，成本低廉。

變異系數(shù)等于標(biāo)準(zhǔn)差與平均值之比，用來比較數(shù)據(jù)的離散程度，能夠消除不同測量尺度的影響，反映各個(gè)波段數(shù)據(jù)的測量穩(wěn)定性。隨DPI變化，接種組F520波段的變異系數(shù)在2%～5%之間，F(xiàn)440的變異系數(shù)在11%～14%之間，F(xiàn)690的變異系數(shù)在7%～10%之間，F(xiàn)740的變異系數(shù)在8%～11%之間。F520的變異系數(shù)最小，F(xiàn)440的變異系數(shù)最大。試驗(yàn)過程發(fā)現(xiàn)F440極易受外界光線、葉片表面不一致的影響，而F520波段更穩(wěn)定，與變異系數(shù)的結(jié)果一致。

分析四個(gè)單獨(dú)熒光波段變化的原因： F440和F520由表皮及葉肉細(xì)胞壁和葉脈發(fā)出，與次生代謝產(chǎn)物密切相關(guān)，許多是與植物防御有關(guān)的酚類物質(zhì)。霜霉病侵染葡萄葉片產(chǎn)生的羥基苯丙烯酸、二苯乙烯類抗毒素等次生代謝產(chǎn)物不斷累積造成葉片接種霜霉病后F440和F520快速升高[13]； F690和F740由葉綠素a發(fā)出的，稱為葉綠素?zé)晒?，F(xiàn)690和F740波段熒光強(qiáng)度與葉綠素含量正相關(guān)，霜霉病侵染使葉綠素逐漸被降解，F(xiàn)690和F740減小，但在霜霉病剛侵染時(shí)葉片的葉綠素含量變化較小，接種葉片F(xiàn)690和F740在1DPI—3DPI變化不大，與健康葉片差異不顯著，隨著侵染的深入，F(xiàn)690和F740快速降低，從4DPI開始與健康葉片差異顯著。由方差分析發(fā)現(xiàn)4個(gè)獨(dú)立波段之間的比值也有不同的檢測霜霉病侵染的能力。

2.4 基于相關(guān)性分析的多光譜熒光特征參數(shù)選擇

從多光譜熒光四個(gè)波段圖像隨DPI的變化和方差分析曲線可以看出F440和F520，F(xiàn)690和F740變化趨勢一致。說明不同熒光參數(shù)之間存在較強(qiáng)的相關(guān)性。因此對(duì)葉片的16個(gè)多光譜熒光參數(shù)進(jìn)行相關(guān)性分析，其Spearman相關(guān)系數(shù)如圖7所示?？梢钥闯龈鳠晒鈪?shù)間存在不同程度的相關(guān)性，表明這些熒光參數(shù)包含了不同類型的信息，但同時(shí)也存在重復(fù)性,因此需要對(duì)這些參數(shù)進(jìn)行篩選。分析發(fā)現(xiàn)F690和F740，F(xiàn)440和F440/520,F440/740，F(xiàn)440/F690，F(xiàn)520/740和F520/F690兩兩之間相關(guān)系數(shù)均大于0.85，屬于極強(qiáng)相關(guān)； F440與F520，F(xiàn)690與F440/740相關(guān)系數(shù)均大于0.75為強(qiáng)相關(guān)。根據(jù)方差分析獲得的不同參數(shù)對(duì)霜霉病侵染的敏感性強(qiáng)弱和相關(guān)分析結(jié)果，并通過模型準(zhǔn)確率驗(yàn)證，篩選出F520，F(xiàn)690，F(xiàn)440/740，F(xiàn)690/F740四個(gè)特征作為SVM的輸入。

圖7 熒光參數(shù)相關(guān)系數(shù)色塊圖Fig.7 Correlation coefficient of multicolorfluorescence parameters

2.5 葡萄霜霉病檢測模型的建立和驗(yàn)證

雖然根據(jù)多光譜熒光圖像能夠直觀地對(duì)健康和感染霜霉病葉片做出評(píng)估，但很難用量化分析方法準(zhǔn)確判別健康和染病葉片。本研究將優(yōu)選的4個(gè)熒光參數(shù)輸入SVM模型對(duì)健康和染病葉片進(jìn)行檢測，并與單波段特征閾值檢測方法進(jìn)行對(duì)比。數(shù)據(jù)集為290個(gè)葡萄葉片(145片接種，145片健康對(duì)照)連續(xù)6 d的多光譜熒光光譜強(qiáng)度數(shù)據(jù)，從中取出200個(gè)(健康和接種各100個(gè))葉片連續(xù)6 d的數(shù)據(jù)作為訓(xùn)練集，每天剩余90個(gè)作為測試集(健康和接種各45片)。用大津法分別計(jì)算4個(gè)優(yōu)選波段特征F520，F(xiàn)690，F(xiàn)440/740和F690/F740的閾值分別為315，685，0.22和0.187。經(jīng)過多次試驗(yàn)，SVM模型選擇高斯核函數(shù)(t=2)，10折交叉驗(yàn)證，核函數(shù)的系數(shù)g和為懲罰因子系數(shù)c分別為2和1。表1給出了單一特征閾值檢測和4個(gè)特征融合的SVM模型檢測的結(jié)果。在霜霉病侵染初期檢測準(zhǔn)確率不高，隨著DPI增加，葉片被侵染程度加深，檢測準(zhǔn)確率逐漸提高，四個(gè)優(yōu)選參數(shù)閾值檢測1DPI的準(zhǔn)確率分別為61.1%，48.9%，54.4%和54.4%，3DPI的準(zhǔn)確率分別為78.9%，63.3%，76.7%和70.0%，6DPI的準(zhǔn)確率分別為100.0%，82.3%，93.3%和87.8%，整個(gè)試驗(yàn)周期(1DPI—6DPI)平均分別為80.0%，66.3%，75.9%和70.6%。F520對(duì)霜霉病侵染敏感，且變異系數(shù)最小，單獨(dú)波段特征中F520的閾值檢測效果最好。SVM模型4個(gè)特征融合的SVM模型連續(xù)6天檢測的準(zhǔn)確率分別為65.6%(1DPI)，76.7%(2DPI)，82.2%(3DPI)，88.9%(4DPI)，94.4%(5DPI)和100.0%(6DPI)，整個(gè)試驗(yàn)周期(1DPI—6DPI)平均為84.6%，均高于單波段閾值檢測方法，這是由于葉片差異、侵染程度不一致、葉片表面曲率變化和環(huán)境光干擾等因素影響，多光譜熒光參數(shù)方差大，導(dǎo)致單波段閾值檢測準(zhǔn)確率不高； 四個(gè)優(yōu)選參數(shù)同時(shí)輸入到SVM模型中，能綜合多個(gè)參數(shù)的檢測能力，并通過用大量典型樣本數(shù)據(jù)訓(xùn)練，消除各類噪聲的影響，從而獲得了更優(yōu)的檢測效果。

表1 單特征閾值和多特征融合SVM模型的健康和染病葉片檢測結(jié)果Table 1 Evaluation results of healthy (CK) and diseased leaves based onsingle feature threshold and multi-feature fusion SVM model

考察分類錯(cuò)誤的樣本，發(fā)現(xiàn)有兩種檢測錯(cuò)誤類型： 第一，接種葉片發(fā)病輕微，導(dǎo)致接種和健康對(duì)照葉片熒光圖像在霜霉層出現(xiàn)前沒有顯著差異，易將接種葉片誤分類為健康葉片。如圖8所示，接種葉片只有零星部位出現(xiàn)霜霉層(A1，A2)，而發(fā)病嚴(yán)重葉片布滿霜霉層(B1，B2)； 第二，檢測過程中遮擋不嚴(yán)，外部光線從縫隙進(jìn)入成像區(qū)域，使各波段熒光圖像發(fā)生改變，出現(xiàn)檢測錯(cuò)誤。如圖9所示，外部干擾光線從右下方射入，使葉片各波段熒光圖像右下部均出現(xiàn)高亮，其中F440受外部光線影響最大，F(xiàn)520受影響最小。

圖8 發(fā)病輕微與發(fā)病嚴(yán)重葉片對(duì)照

3 結(jié) 論

霜霉病對(duì)葡萄危害嚴(yán)重，對(duì)其進(jìn)行早期檢測與防治，可提高葡萄品質(zhì)和產(chǎn)量。利用MFI技術(shù)結(jié)合SVM方法進(jìn)行了葡萄霜霉病早期檢測方法研究。結(jié)果表明利用MFI能在接種后2天(肉眼可見癥狀前4天)檢測出霜霉病侵染，四個(gè)單獨(dú)熒光波段中F520最穩(wěn)定，檢測效果最好，融合四個(gè)優(yōu)選特征的SVM模型顯癥前3天(3DPI)檢測的準(zhǔn)確率達(dá)82.2%，全試驗(yàn)周期(6 d)的平均準(zhǔn)確率為84.6%，為便攜式葡萄霜霉病的早期診斷設(shè)備的開發(fā)提供了理論依據(jù)。后續(xù)研究可將多個(gè)葡萄品種作為研究對(duì)象，建立適用范圍更廣的多光譜熒光葡萄霜霉病早期檢測模型，同時(shí)需要檢測葡萄葉片內(nèi)部的次生代謝產(chǎn)物，研究多光譜熒光早期檢測葡萄霜霉病的機(jī)理。

圖9 外部光線干擾的葉片多光譜熒光圖像(右下方漏光)Fig.9 MFI of leaves disturbed by externallight exposed from right bottom