金 枝,馬建鋒,付躍進(jìn)*

1. 中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院木材工業(yè)研究所，北京 100091 2. 國(guó)際竹藤中心，竹藤科學(xué)與技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100102

引 言

受拉木是指闊葉木發(fā)生傾斜、彎曲和偏冠時(shí)，樹(shù)干和枝條上方受拉伸應(yīng)力部位的木質(zhì)部[1]，在天然闊葉林和楊樹(shù)(Populussp.)、桉樹(shù)(Eucalyptussp.)等人工速生林中均有存在。與正常木相比，受拉木在微觀結(jié)構(gòu)和力學(xué)性能方面存在一定差異。在微觀結(jié)構(gòu)方面，受拉木中形成的具有特殊形態(tài)和化學(xué)組成的膠質(zhì)層被認(rèn)為是造成受拉木與正常木之間力學(xué)性能差異的主要原因。受拉木的縱向硬度高達(dá)35 GPa，明顯高于正常木(平均為18 GPa)，而弦向和徑向硬度較低，分別為430和1 150 MPa，該數(shù)值在正常木中分別達(dá)到530和1 500 MPa[2]。此外，膠質(zhì)層產(chǎn)生的高拉伸應(yīng)力及縱向干縮率[3]會(huì)降低木材的加工性能，例如在干燥過(guò)程中出現(xiàn)的翹曲和開(kāi)裂，以及在切削過(guò)程中引起的夾鋸和板面起毛等缺陷嚴(yán)重降低了木材的利用效率。

鑒于受拉木膠質(zhì)層獨(dú)特的壁層構(gòu)造及其對(duì)木材相關(guān)性能的影響，研究者們針對(duì)膠質(zhì)層的化學(xué)組成、解剖結(jié)構(gòu)和孔隙結(jié)構(gòu)等開(kāi)展了一系列研究。膠質(zhì)層形成于纖維細(xì)胞次生壁內(nèi)側(cè)，其化學(xué)組分主要包含纖維素[4]，木聚糖[5]，阿拉伯半乳聚糖和RG-I型果膠[6]等。其中，膠質(zhì)層纖維素作為“骨架”物質(zhì)，形成高定向和高結(jié)晶形態(tài)的微纖絲近乎平行于細(xì)胞主軸排列[7]，微纖絲之間和微纖絲非結(jié)晶區(qū)存在的納米級(jí)孔隙賦予了膠質(zhì)層豐富的孔隙結(jié)構(gòu)[8-10]。然而，現(xiàn)有研究針對(duì)膠質(zhì)層與細(xì)胞壁其他各層級(jí)化學(xué)組分濃度梯度變化、分布相關(guān)性及孔隙分布差異鮮有報(bào)道，本研究擬采用高空間分辨率的共聚焦顯微拉曼光譜技術(shù)，通過(guò)原位成像及圖像疊加對(duì)黑楊受拉木與對(duì)應(yīng)木各層級(jí)區(qū)域化學(xué)及相關(guān)性進(jìn)行直觀的比較研究，特征峰積分原位成像揭示各層級(jí)孔隙分布差異，從而深化對(duì)受拉木特殊理化特性及形成機(jī)制的理解，為提升應(yīng)力木加工質(zhì)量、實(shí)現(xiàn)木材高值高效利用提供理論依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 原料

十年生傾斜生長(zhǎng)的黑楊(Populusnigra)采自西北農(nóng)林科技大學(xué)植物園，樹(shù)高16 m、胸徑14.5 cm，枝下高7.3 m。在距基部5 m處莖部?jī)A斜部分的上端及下端分別截取受拉木及對(duì)應(yīng)木木塊(15 mm×5 mm×10 mm)。蒸餾水反復(fù)沖洗后，利用滑走切片機(jī)(Leica RM2010R,Germany)切取厚度為20 μm的樣品橫切面?zhèn)溆?，切片時(shí)所使用的刀片為L(zhǎng)eica 810。

1.2 透射電子顯微鏡(transmission electron microscopy, TEM)

利用單面刀片將受拉木與對(duì)應(yīng)木樣品塊切成火柴棒大小，經(jīng)梯度丙酮逐級(jí)脫水，進(jìn)行低黏度Spur樹(shù)脂浸漬、包埋及固化。采用超薄切片機(jī)(Leica EM-UC6)連續(xù)切取90 nm的超薄切片，然后置于過(guò)濾后的1%(w/v)高錳酸鉀水溶液染色1 min，蒸餾水反復(fù)沖洗，自然晾干后在JEM-1230(JEOL)透射電子顯微鏡下進(jìn)行顯微成像，成像時(shí)加速電壓為80 kV。

1.3 共聚焦顯微拉曼光譜

將獲取的20 μm厚橫切面切片置于載玻片上自然晾干后，采用重水(D2O)(原子百分比99.9%，Sigma-Aldrich)預(yù)浸漬1 h后，蓋薄片封片，采用共聚焦顯微拉曼光譜儀(LabRamXplora,Horiba Jobin Yvon)進(jìn)行光譜采集。激發(fā)波長(zhǎng)532 nm，到達(dá)樣品的激光功率為8 mW。測(cè)試時(shí)光柵為300 mm-1，狹縫寬度為100 μm，掃描步距為0.5 μm，單點(diǎn)光譜采集時(shí)間為1.5 s，光譜測(cè)定范圍為3 100～300 cm-1，光譜分辨率為2 cm-1。光譜采集時(shí)采用100倍油鏡(Plan N 100×，Oil，NA=1.0)，獲得的數(shù)據(jù)利用LabSpec6軟件采用線性偏最小二乘法進(jìn)行批量矩陣成像數(shù)據(jù)基線校正后歸一化處理，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)特征峰峰面積成像疊加。

2 結(jié)果與討論

2.1 受拉木與對(duì)應(yīng)木細(xì)胞壁分層結(jié)構(gòu)

對(duì)比對(duì)應(yīng)木[圖1(a)]與受拉木[圖1(b,c)]TEM圖像發(fā)現(xiàn)兩者的纖維細(xì)胞壁分層結(jié)構(gòu)存在明顯差異，主要體現(xiàn)在次生壁的亞層組成及厚度差異。與對(duì)應(yīng)木次生壁三亞層結(jié)構(gòu)(外層S1(0.5～1.0 μm)，中層S2(3.0～5.0 μm)，內(nèi)層S3(0.05 ～0.12 μm))不同，受拉木的纖維次生壁僅分為S1(0.2～0.5 μm)及S2(2.0～3.5 μm)且厚度較小，在其次生壁S2內(nèi)側(cè)還含有電子密度較低的膠質(zhì)層(gelatinous layer,GL)，該層厚度約為1.2～2.5 μm。以上差異反映出受拉木纖維細(xì)胞因抵抗拉伸應(yīng)力而產(chǎn)生的形變。

圖1 對(duì)應(yīng)木(a)與受拉木(b，c)纖維細(xì)胞分層結(jié)構(gòu)TEM圖像Fig.1 TEM images showing the layering structure of opposite wood (a), tension wood (b)and higher magnification of tension wood (c)

2.2 受拉木細(xì)胞壁化學(xué)組分拉曼光譜歸屬

本研究中所使用的顯微拉曼光譜儀的空間分辨率約為0.5 μm，在受拉木細(xì)胞角隅胞間層，次生壁以及膠質(zhì)層能夠準(zhǔn)確地抽取相應(yīng)區(qū)域的平均拉曼光譜(圖2)，涉及特征峰主要出現(xiàn)在2 942 cm-1(纖維素、半纖維素及木質(zhì)素—CH非對(duì)稱(chēng)伸縮振動(dòng))，2 897 cm-1(碳水化合物—CH，—CH2伸縮振動(dòng))，2 476 cm-1(O—D伸縮振動(dòng))，1 598 cm-1(木質(zhì)素芳香環(huán)對(duì)稱(chēng)伸縮振動(dòng))，1 094 cm-1(纖維素C-O-C非對(duì)稱(chēng)伸縮振動(dòng))，904 cm-1(木聚糖)等波數(shù)區(qū)[11-13]。

2.3 受拉木與對(duì)應(yīng)木細(xì)胞壁拉曼光譜成像

2.3.1 細(xì)胞壁形態(tài)及主要組分分布相關(guān)性

通過(guò)對(duì)2 942 cm-1纖維素、半纖維素及木質(zhì)素—CH非對(duì)稱(chēng)伸縮振動(dòng)特征峰進(jìn)行積分，獲得的拉曼光譜成像圖中受拉木[圖3(a)]與對(duì)應(yīng)木[圖3(b)]纖維細(xì)胞角隅胞間層(CCML)、復(fù)合胞間層(CML)、次生壁(S)及受拉木中特有的膠質(zhì)層(GL)區(qū)域清晰可見(jiàn)，且受拉木部分纖維細(xì)胞的細(xì)胞腔區(qū)域發(fā)生了明顯的形變[圖3(a)中三角形所示細(xì)胞]。

圖2 受拉木纖維細(xì)胞不同形態(tài)區(qū)域拉曼光譜比較Fig.2 Average Raman spectra extracted from variousmorphological regions of tension wood

圖3 受拉木(a)與對(duì)應(yīng)木(b)纖維細(xì)胞形態(tài)拉曼光譜成像Fig.3 Raman images showing the cell wall morphology of tension wood (a) and opposite wood (b)

作為闊葉木細(xì)胞壁中的主要組成成分，纖維素構(gòu)建了細(xì)胞壁的“骨架”，半纖維素及木質(zhì)素分別構(gòu)成了細(xì)胞壁的基體物質(zhì)和結(jié)殼物質(zhì)，并填充于纖維素“骨架”之中。本研究分別對(duì)三大主要組分進(jìn)行特征峰1 094 cm-1(纖維素)、1 598 cm-1(木質(zhì)素)、904 cm-1(半纖維素木聚糖)峰面積積分成像，并進(jìn)行兩兩相互疊加探索其空間分布相關(guān)性。疊加的木質(zhì)素與纖維素，木質(zhì)素與木聚糖的顯微拉曼光譜成像圖表明三大組分在受拉木和對(duì)應(yīng)木細(xì)胞壁不同形態(tài)區(qū)域中均有分布，但各組分之間的分布相關(guān)性存在一定差異。受拉木膠質(zhì)層沉積了高濃度的纖維素(紅)并存在一定濃度分布較均一的木聚糖(綠)。在次生壁區(qū)域，纖維素在受拉木每對(duì)應(yīng)木中呈現(xiàn)均一分布但濃度明顯低于膠質(zhì)層； 木聚糖在受拉木次生壁中分布濃度普遍高于對(duì)應(yīng)木，且在次生壁臨近胞間層一側(cè)及胞間層中更為集中； 木質(zhì)素僅在受拉木緊鄰胞間層的次生壁區(qū)域呈現(xiàn)一定濃度分布，這可能是細(xì)胞壁通過(guò)木質(zhì)素的沉積從而增加剛度以抵抗外界拉伸應(yīng)力而導(dǎo)致的。在胞間層區(qū)域，受拉木和對(duì)應(yīng)木的主要成分均為木聚糖和木質(zhì)素，其中，木聚糖在受拉木中的分布濃度普遍高于對(duì)應(yīng)木，而木質(zhì)素在兩者細(xì)胞角隅胞間層濃度最高。受拉木和對(duì)應(yīng)木不同形態(tài)區(qū)域三大組分濃度差異詳見(jiàn)表1。可以看出，受拉木在形成過(guò)程中對(duì)纖維素與木聚糖的分布濃度產(chǎn)生了較大的影響，在整個(gè)細(xì)胞壁形態(tài)區(qū)域中，兩者較對(duì)應(yīng)木均呈現(xiàn)增強(qiáng)的趨勢(shì)，這可能與拉伸應(yīng)力作用下纖維細(xì)胞壁中纖維素和半纖維素等鏈狀分子的形變與分子間距的縮小而導(dǎo)致的單位面積內(nèi)分子濃度增加有關(guān)。

表1 受拉木和對(duì)應(yīng)木不同形態(tài)區(qū)域三大組分濃度差異

圖4 受拉木(a,b)和對(duì)應(yīng)木(c,d)纖維細(xì)胞壁中木聚糖(綠)、木質(zhì)素(藍(lán))及纖維素(紅)空間分布相關(guān)性拉曼光譜疊加圖

2.3.2 相鄰細(xì)胞壁線掃描分析

為了揭示受拉木與對(duì)應(yīng)木纖維細(xì)胞壁主要組分沿各自相鄰細(xì)胞壁的濃度梯度變化規(guī)律，本研究針對(duì)木質(zhì)素芳香環(huán)伸縮振動(dòng)(1 598 cm-1)、纖維素C—O—C非對(duì)稱(chēng)振動(dòng)(1 094 cm-1)和木聚糖C—O—C(904 cm-1)進(jìn)行相鄰細(xì)胞壁線掃描(圖5)，所提取的線掃描區(qū)域如圖4(a)和(c)中所示虛線區(qū)域。從圖中可以看出沿著細(xì)胞腔向復(fù)合胞間層區(qū)域過(guò)渡時(shí)，受拉木與對(duì)應(yīng)木木質(zhì)素、纖維素和木聚糖濃度均呈現(xiàn)明顯的區(qū)域選擇性及梯度變化規(guī)律，與表1結(jié)果一致。在細(xì)胞壁沿膠質(zhì)層向復(fù)合胞間層方向，受拉木纖維素濃度呈下降趨勢(shì)，木質(zhì)素和木聚糖濃度呈上升趨勢(shì)； 在細(xì)胞壁沿次生壁向復(fù)合胞間層方向，對(duì)應(yīng)木纖維素濃度呈下降趨勢(shì)，木質(zhì)素濃度呈上升趨勢(shì)，木聚糖濃度變化趨勢(shì)不明顯。

圖5 受拉木(a—c)與對(duì)應(yīng)木(d—f)中相鄰纖維細(xì)胞壁中木質(zhì)素(a和d)， 纖維素(b和e)和木聚糖(c和f)濃度變化拉曼線掃描圖

2.3.3 受拉木與對(duì)應(yīng)木細(xì)胞壁孔隙分布

木材細(xì)胞壁孔隙測(cè)定的傳統(tǒng)方法主要借助氣體的吸附脫附法，其獲得的研究結(jié)果通常為樣品孔隙的平均信息[3,9,14]，未能在更為微觀的細(xì)胞壁乃至細(xì)胞壁亞層角度揭示受拉木與對(duì)應(yīng)木的孔隙分布差異性。針對(duì)傳統(tǒng)研究的不足，本研究采用D2O預(yù)浸漬的組織切片結(jié)合原位高空間分辨顯微拉曼成像對(duì)受拉木細(xì)胞壁各層中的D2O濃度分布規(guī)律進(jìn)行研究，分別對(duì)受拉木與對(duì)應(yīng)木中D2O特征峰2 476 cm-1峰面積積分成像(圖6)。圖中黃色區(qū)域?yàn)榧?xì)胞腔空腔區(qū)域，其高濃度的D2O分布在一定程度上證實(shí)了該方法用于表征纖維細(xì)胞孔隙結(jié)構(gòu)的適用性。同時(shí)可以看出，沿細(xì)胞腔經(jīng)過(guò)膠質(zhì)層向復(fù)合胞間層區(qū)域過(guò)渡時(shí)，受拉木和對(duì)應(yīng)木中D2O的濃度均呈現(xiàn)逐漸降低的梯度變化規(guī)律，且前者更為明顯。在受拉木中，膠質(zhì)層D2O濃度明顯高于次生壁及胞間層，表明了膠質(zhì)層的孔隙結(jié)構(gòu)分布密集，而對(duì)應(yīng)木中的D2O在次生壁及胞間層均有較高濃度的分布且明顯高于受拉木相應(yīng)區(qū)域。以上發(fā)現(xiàn)證實(shí)了受拉木孔隙主要來(lái)源于膠質(zhì)層[9]。同時(shí)可以推斷，由于拉伸應(yīng)力的作用受拉木次生壁及胞間層孔隙結(jié)構(gòu)發(fā)生一定程度的壓縮，而膠質(zhì)層由于一側(cè)緊鄰細(xì)胞腔而大大減弱所受的外力作用從而利于多孔結(jié)構(gòu)的生成。

圖6 受拉木(a)與對(duì)應(yīng)木(b)中相鄰纖維細(xì)胞壁中D2O分布拉曼成像圖Fig.6 Raman image showing the concentration distribution of D2O along the adjacent fiber wallin tension wood (a) and opposite wood (b)

3 結(jié) 論

采用高空間分辨顯微拉曼光譜成像與疊加技術(shù)對(duì)比研究了黑楊受拉木與對(duì)應(yīng)木中纖維細(xì)胞壁主要組分微區(qū)分布差異性及相關(guān)性，通過(guò)引入D2O成功探索了受拉木與對(duì)應(yīng)木纖維細(xì)胞壁不同形態(tài)區(qū)域中的孔隙分布差異。纖維素、木質(zhì)素和木聚糖在受拉木與對(duì)應(yīng)木的細(xì)胞壁形態(tài)區(qū)域中均存在不同程度的分布，且沿著細(xì)胞腔向復(fù)合胞間層區(qū)域過(guò)渡時(shí)三者濃度均呈現(xiàn)明顯的區(qū)域選擇性及梯度變化規(guī)律。與對(duì)應(yīng)木相比，膠質(zhì)層主要成分纖維素呈現(xiàn)高濃度分布，受拉木纖維素和木聚糖分布濃度在整個(gè)細(xì)胞壁形態(tài)區(qū)域呈增強(qiáng)趨勢(shì)，木質(zhì)素分布濃度在次生壁區(qū)域有所增強(qiáng)； 受拉木膠質(zhì)層孔隙分布密集但其次生壁及胞間層孔隙分布程度較低。盡管D2O拉曼光譜成像圖中的濃度梯度變化能夠間接地反映出細(xì)胞壁各層孔隙分布的差異，但該方法在細(xì)胞壁水平可視化、定量研究孔隙分布及結(jié)構(gòu)特點(diǎn)方面仍需進(jìn)行更深入更完善的研究。