郭坤山， 王山梅， 馬 冰， 許俊紅， 張江峰， 荊 楠， 閆文娟， 馬 瓊， 李 軼

（1.許昌市感染性疾病病原體研究重點實驗室 河南科技大學附屬許昌市中心醫(yī)院檢驗科，河南 許昌461000；2.河南省人民醫(yī)院檢驗科，河南 鄭州 450000）

近年來，隨著抗菌藥物的廣泛應用，出現(xiàn)了越來越多的耐藥性細菌。耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（methicillin-resistantStaphylococcus aureus，MRSA）就是其中很重要的一種。由于其傳播途徑廣、傳播速度快、致病性強，并且表現(xiàn)出多重耐藥性，常引起感染的暴發(fā)及流行，已成為臨床治療的難點。傳統(tǒng)細菌鑒定及藥物敏感性試驗耗時長，在進行流行病學調查和院感防控時，很難滿足臨床需求。本研究運用基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜（matrix-assisted laser desorption ionization timeof-flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS）技術對病原菌進行快速鑒定，同時運用質譜軟件的聚類分析功能及算法統(tǒng)計方式對MRSA進行快速篩選，以滿足臨床診療的需求。

1 材料和方法

1.1 菌株來源

收集許昌市中心醫(yī)院金黃色葡萄球菌臨床分離株59株，其中MRSA 30株（編號為1～30號），甲氧西林敏感金黃色葡萄球菌（methicillin-sensitiveStaphylococcus aureus，MSSA ）29株（編號為31～59號）；另收集40株MRSA和40株MSSA，作為驗證菌株。

1.2 儀器和試劑

哥倫比亞血平板、三氟乙酸和乙腈（上海晶純生化科技股份有限公司），96孔加樣板、α-氰基-4-羥基肉桂酸（alpha cyano-4-hydroxycinnamic acid，HCCA）、多肽標準品、MALDI-TOF MS儀（德國Bruker公司）。

1.3 MALDI-TOF MS鑒定

將收集的菌株轉種于血平板，35 ℃ CO2培養(yǎng)箱孵育過夜，并用 MALDI-TOF MS儀進行鑒定。

鑒定步驟[1-2]：（1）滅活，挑取2～3個中等大小的菌落于1.5 mL離心管中，加入300 μL蒸餾水混勻，然后加入900 μL無水乙醇混勻，12 800×g離心2 min；（2）提取蛋白，離心后棄去上層乙醇，下層沉淀加入50 μL 70%甲酸混勻，然后加入50 μL乙腈混勻，12 800×g離心2 min；（3）加樣，取1 μL上清，加入96 孔加樣板，干燥后，加入1 μL基質液覆蓋樣本；（4）校準定標，每次試驗前均對儀器進行校準定標，以大腸埃希菌DH50t作為標準品；（5）鑒定比對，MALDI-TOF MS儀線性正性模式用最大頻率（20～200 Hz）采集相對分子質量為2 000～20 000的蛋白圖譜，將取得的特征性圖譜與MALDI Biotyper軟件（德國Bruker 公司）中的數據庫進行比對，并用匹配分值來給結果定級；分值為2.300～3.000可以準確鑒定到種，分值為2.000～2.299可以準確鑒定到屬。

1.4 鑒定復核

采用Vitek-2 Compact自動化鑒定藥敏儀（法國生物梅里埃公司）進行鑒定復核，質控菌株為金黃色葡萄球菌（ATCC 29213）和糞腸球菌（ATCC 29212），由我國國家衛(wèi)生健康委臨床檢驗中心提供；根據美國臨床實驗室標準化協(xié)會（the Clinical and Laboratory Standards Institute ，CLSl）2018年文件要求，使用頭孢西丁紙片復核實驗菌株：將濃度為0.5麥氏濁度的菌懸液均勻涂于MH瓊脂平皿，將平皿置于35 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16～18 h，用游標卡尺測量抑菌圈直徑，直徑≤21 mm的菌株為MRSA，質控菌株金黃色葡萄球菌（ATCC 25923）抑菌圈直徑為23～29 mm。經測量，1～30號菌株抑菌圈直徑均≤21 mm，鑒定為MRSA；31～59號菌株抑菌圈直徑均≥22 mm，鑒定為MSSA。

1.5 數據分析

采用MALDI Biotyper軟件分析59株實驗菌株的同源性，采用ClinProTools 3.0 軟件（德國Bruker公司）對質譜峰圖進行分析，具體步驟參照ClinProTools 3.0 Manual軟件要求進行。

2 結果

2.1 細菌鑒定結果

MALDI-TOF MS鑒定結果顯示，59株實驗菌株均為金黃色葡萄球菌，質譜分值均＞2.300，可以鑒定到種水平，MALDI-TOF MS對金黃色葡萄球菌的鑒定準確率＞99.9%。

2.2 MALDI Biotyper軟件聚類分析結果

通過聚類分析把59株實驗菌株分成A和B兩大簇，A簇中MSSA占68.2%、MRSA占31.8%，B簇中MSSA占37.9%、MRSA占62.1%，表明聚類分析不能完全區(qū)分MRSA和MSSA。見圖1。

圖1 59株菌株聚類分析圖

2.3 分類模型的建立

ClinProTools 3.0軟件統(tǒng)計分析結果顯示質荷比為6 812、17 668、7 594和11 990 m/z的蛋白峰是區(qū)分MRSA和MSSA最主要的特征性峰。受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線顯示，以上4個峰對應的曲線下面積（area under curve，AUC）均為1；凝膠瀏覽圖顯示MSSA在4個峰的蛋白強度均高于MRSA。根據數據分析結果，選取6 812和17 668 m/z蛋白峰，運用ClinProTools 3.0軟件建立分類模型。運用遺傳算法進行峰統(tǒng)計之后，將MRSA和MSSA菌株較清晰地劃分成2個區(qū)域，所有菌株均準確落在相應的MRSA或 MSSA的分組中。見圖2。

圖2 MSRA、MSSA分類模型圖

2.4 模型驗證

隨機選取80株驗證菌株中1株的質譜峰圖放入模型中MRSA區(qū)域，ClinProTools 3.0軟件峰統(tǒng)計結果顯示其準確落在MRSA聚類中，見圖3（a）。將此株驗證菌株的質譜峰圖放入模型中MSSA區(qū)域，ClinProTools 3.0軟件峰統(tǒng)計結果顯示MRSA在未被放入正確位置的情況下，會打破已建模型，從而無法準確區(qū)分MSSA和MRSA，見圖3（b）。

圖3 1株驗證菌株的質譜峰圖放入模型中的驗證圖

采用同樣的方法對80株驗證菌株一一進行驗證，有2株MRSA被錯誤地分類到MSSA區(qū)域，7株MSSA被錯誤地分類到MRSA區(qū)域。統(tǒng)計結果顯示其敏感性為95.0%、特異性為82.5%、陽性預測值為84.4%、陰性預測值為94.3%。

3 討論

MALDI-TOF MS在金黃色葡萄球菌的鑒定中具有快速、準確、成本低等優(yōu)勢，但目前利用質譜圖的差異來快速區(qū)分MRSA和MSSA的報道較少。本研究運用MALDI Biotyper軟件的聚類分析功能來分析金黃色葡萄球菌的同源性，運用ClinProTools 3.0軟件分析MRSA與MSSA質譜峰圖的差異，選取具有統(tǒng)計學差異的蛋白峰來建立分類模型，從臨床分離菌株中快速篩選出MRSA，與菌種鑒定相比具有同等優(yōu)勢，彌補了紙片擴散法和儀器法耗時長的不足。

有研究人員比較了76株金黃色葡萄球菌的質譜圖，發(fā)現(xiàn)MRSA與MSSA的峰圖之間有很大差異，將數據庫中MRSA和MSSA的質譜圖進行聚類分析，可分為MRSA和MSSA兩大簇[3]，提示MALDI-TOF MS可作為一種簡單且快速的方法用于細菌的藥物敏感性分析。本研究結果顯示，聚類分析對MRSA的鑒定準確性只有62.1%，不能鑒別同源性近的MRSA和MSSA。同源性菌株質譜峰圖具有高度相似性，在進行同源性分析時，其MRSA特異峰的強度不足，造成部分同源性近的MRSA與MSSA不能被區(qū)分。本研究菌株來源同一實驗室，可能存在同源性，結果與文獻報道[4-6]一致。

本研究發(fā)現(xiàn)，ClinProTools 3.0軟件同時分析大量菌株時，無法區(qū)分MRSA和MSSA，推測可能是每株菌特異峰的累積掩蓋了MRSA和MSSA的差異峰導致的；選取部分MRSA和MSSA的峰圖進行分析，發(fā)現(xiàn)可以區(qū)分2種菌。質荷比為6 812、17 668、7 594和11 990 m/z的4個蛋白峰有統(tǒng)計學差異，峰值均為MSSA高于MRSA，選取其中2個差異蛋白峰建立模型可以區(qū)分MRSA與MSSA，本研究選取6 812和17 668 m/z的蛋白峰建立模型，其敏感性為95.0%、特異性為82.5%、陽性預測值為84.4%、陰性預測值為94.3%。本研究發(fā)現(xiàn)的蛋白峰與胡燕燕等[7]發(fā)現(xiàn)的蛋白峰不同，可能與實驗菌株來源不同有關，本研究菌株均來源于同一實驗室，后續(xù)將收集多中心樣本進行綜合分析，進一步驗證這一模型的使用范圍。

總之，質譜峰圖能快速、準確地區(qū)分MRSA與MSSA，可在臨床實驗室推廣使用。