王昭蓉， 張占虎， 王秋紅， 李海波， 叢 輝

（1.南通大學(xué)附屬婦幼保健院檢驗(yàn)科，江蘇 南通 226001；2.南通大學(xué)附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)科，江蘇 南通 226001）

有研究結(jié)果顯示，不育男性占育齡男性的8%左右，在不孕不育夫婦中男性因素占50%[1]，其中10%～40%的男性不育與生殖道感染相關(guān)[2]。解脲脲原體（Ureaplasma urealyticum，UU）可能是引起男性不育的重要原因之一[3]。UU感染后在泌尿生殖道黏膜及上皮細(xì)胞上定居，可導(dǎo)致精子總數(shù)、精子活力及精子正常形態(tài)率降低[4]，但其致不育的具體機(jī)制目前尚不清楚。近年來，氧化應(yīng)激對男性生殖系統(tǒng)的影響備受關(guān)注，活性氧（reactive oxygen species，ROS）在精子發(fā)生、精子活力、精子獲能、頂體反應(yīng)等活動(dòng)中起重要調(diào)節(jié)作用[5]。過量ROS及其代謝物可造成精子膜脂質(zhì)氧化損傷，破壞精子核內(nèi)DNA完整性，改變線粒體結(jié)構(gòu)，進(jìn)而影響功能。線粒體結(jié)構(gòu)完整性、功能狀態(tài)直接關(guān)系到精子活力，而線粒體膜電位（mitochondrial membrane potential，MMP）是反映線粒體功能的客觀指標(biāo)，可用于評估線粒體功能。本研究擬分析UU對不育男性精子常規(guī)參數(shù)、MMP、ROS的影響，探討UU感染與精液質(zhì)量的關(guān)系。

1 材料和方法

1.1 研究對象

選取2018年1—11月南通大學(xué)附屬婦幼保健院男性不育患者112例（不育組）。入選標(biāo)準(zhǔn)：年齡25～40歲，采集標(biāo)本前1個(gè)月未使用抗菌藥物治療，無免疫性疾病，通過細(xì)菌培養(yǎng)、聚合酶鏈反應(yīng)等檢驗(yàn)方法排除淋病奈瑟球菌、沙眼衣原體、人型支原體、生殖支原體等常見病原體感染，無外傷、遺傳病及家族史，無明顯睪丸、附睪、輸精管等生殖系統(tǒng)器官（包含隱睪、精索靜脈曲張、睪丸扭轉(zhuǎn)等）異常。不育患者近1年夫妻生活正常，未采取避孕措施而女方未孕，女方體檢均正常，排除婦科疾病、先天遺傳因素、生殖器官畸形或病變、內(nèi)分泌因素、免疫因素等引起的不孕。對照組為臨床明確診斷是女方因素引起不孕并在南通大學(xué)附屬婦幼保健院實(shí)施體外受精聯(lián)合胚胎移植術(shù)（in vitrofertilization，IVF）的26名男性。本研究經(jīng)南通大學(xué)附屬婦幼保健院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批號：Y2017081），患者本人簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本采集 患者禁欲2～7 d，洗手消毒后通過手淫方式取精，每例患者提取2份標(biāo)本，1份用于精液常規(guī)檢驗(yàn)，取出標(biāo)本后先觀察外觀，記錄接收時(shí)間，并靜置于37 ℃水浴箱30 min，待完全液化后開始檢測；另1份用于UU檢測。

1.2.2 儀器和試劑 WLJY-9000型偉力彩色精子質(zhì)量檢測系統(tǒng)（computer assisted semen analysis，CASA，北京偉力新世紀(jì)科技發(fā)展有限公司）、BriCyte E6流式細(xì)胞儀（深圳邁瑞公司）、MagX自動(dòng)核酸提取儀（上海仁度生物科技有限公司）、Bio-Rad CFX96實(shí)時(shí)熒光核酸擴(kuò)增檢測儀（美國伯樂公司）、解脲脲原體核酸檢測試劑盒（上海仁度生物科技有限公司）、Diff-Quik精子形態(tài)學(xué)快速染液（珠海貝索生物技術(shù)有限公司）、JC-1熒光染料和DCFH-DA熒光探針（上海碧云天生物有限公司）。

1.2.3 精液常規(guī)分析 待精液完全液化后，測定精液體積；取10 μL樣本滴加至37 ℃預(yù)溫的Makler板中，使用CASA對精液進(jìn)行常規(guī)分析；0.9%氯化鈉溶液洗滌后，離心取沉淀精子滴至載玻片上，自然干燥后進(jìn)行Diff-Quik染色，顯微鏡下每張玻片至少計(jì)數(shù)200個(gè)精子，計(jì)算精子正常形態(tài)率。所有操作均按《世界衛(wèi)生組織人類精液檢查與處理實(shí)驗(yàn)室手冊》第5版[6]進(jìn)行。每日室內(nèi)質(zhì)控均在控，儀器狀態(tài)均正常。

1.2.4 精液UU檢測 使用MagX自動(dòng)核酸提取儀提取UU RNA并擴(kuò)增，擴(kuò)增條件：42 ℃、1 min，40個(gè)循環(huán)。結(jié)果判定：dt≤35為陽性；dt無數(shù)值或≥40為陰性；dt結(jié)果為36～39需重復(fù)測定，如仍在36～39之間，且擴(kuò)增曲線呈典型的S型，則判斷為陽性，若非典型S型曲線，則判為陰性；dt表示樣本S型曲線與閾值線交點(diǎn)橫坐標(biāo)讀數(shù)（循環(huán)數(shù)）。

1.2.5 MMP檢測 參照試劑盒說明書，用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）調(diào)整精子濃度至1×105/mL，加入JC-1染色緩沖液充分混勻，37 ℃避光孵育20 min，600×g、4 ℃離心2次，再用適量JC-1染色緩沖液重懸沉淀。檢測JC-1聚合物時(shí)，激發(fā)波長為525 nm，發(fā)射波長為590 nm；檢測JC-1單體時(shí)，激發(fā)波長為490 nm，發(fā)射波長為530 nm。流式細(xì)胞儀選用前向散射光和側(cè)向散射光設(shè)門后，通過熒光通道FL1-H和FL2-H收集熒光信號。用P2/P3百分比表示膜電位高低。

1.2.6 ROS檢測 參照試劑盒說明書，用PBS調(diào)整精子濃度至1×105/mL，加入DCFH-DA熒光探針，充分混勻后37 ℃避光孵育20 min，每3～5 min顛倒混勻1次，600×g、4℃離心3次，洗去游離DCFH-DA，再用適量PBS重懸沉淀。流式細(xì)胞儀選用488 nm激發(fā)波長，525 nm發(fā)射波長，實(shí)時(shí)或逐時(shí)間點(diǎn)檢測刺激前后熒光強(qiáng)弱，以相對熒光強(qiáng)度反映細(xì)胞內(nèi)ROS含量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)數(shù)資料以例或率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。呈非正態(tài)分布數(shù)據(jù)以中位數(shù)（M）[四分位數(shù)（P25～P75）]表示，組間比較采用秩和檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 男性UU感染率分析

不育組中，UU感染（UU陽性組）52例，UU未感染（UU陰性組）60例，不育組UU感染率為46.4%；對照組中UU感染5例，UU未感染21例，感染率為19.2%。不育組UU感染率顯著高于對照組（P＜0.05）。

2.2 UU感染對不育男性精液常規(guī)參數(shù)的影響

在不育患者中，UU陽性組精子活力、前向運(yùn)動(dòng)精子百分比、精子濃度、精子總數(shù)和精子正常形態(tài)率均顯著低于UU陰性組（P＜0.01），而精液量2個(gè)組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

表1 UU感染對不育男性精液常規(guī)參數(shù)的影響 M（P25～P75）

2.3 UU感染對不育男性精液MMP的影響

UU陽性組MMP P2/P3[（0.45±0.39）%]顯著低于陰性組[（0.97±0.73）%]（P＜0.05）。見圖1。

圖1 UU陽性組與UU陰性組精子MMP檢測結(jié)果比較

2.4 UU感染對不育男性精液ROS影響

UU陽性組ROS[（48.26±8.38）%]顯著高于UU陰性組[（25.95±7.82）%]（P＜0.01）。見圖2。

圖2 UU陽性組與UU陰性組精子ROS檢測結(jié)果比較

3 討論

近年來，男性不育呈增長趨勢，男性不育患者中生殖道感染發(fā)病率較高[7]。生殖道感染可能是導(dǎo)致患者精液量減少、精子總數(shù)下降、精子活力降低的重要原因之一。UU是原核生物中最小、最簡單的一類無細(xì)胞壁微生物，是寄生于男、女生殖道的常見病原體，同時(shí)也是非淋性尿道炎的病原體之一。有研究結(jié)果表明，UU在男性不育生殖道中的感染率最高[8]。本研究結(jié)果顯示，不育組UU感染率為46.4%，顯著高于對照組（19.2%），其中UU陽性組精子濃度、精子總數(shù)、精子活力、前向運(yùn)動(dòng)精子百分比、精子正常形態(tài)率與UU陰性組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），與王勇等[9]和WANG等[10]的研究結(jié)果一致。UU感染可逆行侵入生精小管，干擾精原細(xì)胞分裂，從而減少精子生成，造成精子濃度、精子總數(shù)下降。UU能吸附在精子表面，吸附部位出現(xiàn)精子膜缺損乃至嚴(yán)重?fù)p壞，使精子由流線型變得“臃腫”，尾部出現(xiàn)卷曲形態(tài)改變，有些精子因免疫反應(yīng)發(fā)生凝集，使運(yùn)動(dòng)阻力增大，致前向運(yùn)動(dòng)精子百分比降低[11]。精子正常形態(tài)率是精液常規(guī)分析中的重要指標(biāo)，UU感染后精子畸形率升高，易引起男性不育[12]。有研究結(jié)果表明，精液中感染UU并不能真正影響精子質(zhì)量，只有當(dāng)某種類型UU感染達(dá)到一定濃度或機(jī)體免疫力低下時(shí)，才會(huì)產(chǎn)生不良影響和相應(yīng)的臨床癥狀[13]，這也解釋了對照組也有UU感染的原因。

精子活力作為衡量精液質(zhì)量的重要指標(biāo)，被視為完成精-卵結(jié)合的主要因素之一。三磷酸腺苷為精子運(yùn)動(dòng)提供能量，正常精子由三羧酸循環(huán)產(chǎn)生能量傳遞電子，電子經(jīng)呼吸鏈傳遞的同時(shí)，將質(zhì)子從線粒體內(nèi)膜基質(zhì)側(cè)泵到內(nèi)膜側(cè)，形成MMP。JC-1是一種陽離子型親脂性熒光探針，能自由穿過細(xì)胞膜，隨細(xì)胞膜電位變化而在膜兩側(cè)保持動(dòng)態(tài)平衡，其聚集程度隨MMP升高而增加。JC-1可與線粒體內(nèi)膜特異性結(jié)合，但在線粒體膜裂解時(shí)會(huì)被釋放出來，因此，用JC-1檢測MMP來判斷線粒體膜損傷程度，具有結(jié)果可靠、敏感性高等優(yōu)點(diǎn)[14]。本研究結(jié)果顯示，UU陽性組MMP顯著低于UU陰性組（P＜0.05），表明UU感染使精子MMP降低。董浙清等[15]的研究結(jié)果表明，MMP下降可引起精子尾部線粒體形態(tài)及位置異常、結(jié)構(gòu)紊亂、線粒體鞘缺失等。精子MMP水平還反映了精子的能量代謝水平，MMP下降表明精子運(yùn)動(dòng)所需能量減少，可導(dǎo)致精子活力下降或精子細(xì)胞凋亡、壞死。有研究結(jié)果表明，MMP與精子活率、精子活力及精子受精率呈正相關(guān)[16]。

ROS在生理狀態(tài)下一般由精子自身及精液中的白細(xì)胞產(chǎn)生，適當(dāng)?shù)腞OS水平有利于維持精子細(xì)胞的正常功能。本研究結(jié)果顯示，UU感染對不育男性精子ROS有顯著影響，ROS超過一定水平后，線粒體內(nèi)膜將出現(xiàn)非特異性轉(zhuǎn)運(yùn)孔道，MMP下降，因此ROS產(chǎn)生過度是MMP下降的重要原因之一。過量的ROS會(huì)導(dǎo)致氧化應(yīng)激，引起精子膜脂質(zhì)氧化損傷、精子DNA損傷、精子線粒體損傷及細(xì)胞凋亡，從而破壞精子功能，導(dǎo)致精子死亡[17]。有研究結(jié)果證實(shí)，ROS升高導(dǎo)致精子功能障礙是男性不育癥的一個(gè)重要原因[18]。

綜上所述，UU感染對精子質(zhì)量存在一定影響，可能機(jī)制是干擾線粒體活性等引起男性不育。積極預(yù)防和治療UU感染，對預(yù)防不育癥發(fā)生有重要意義。