蘭菲菲， 丁紅珂， 陳延冰， 余麗華， 尹愛華

（廣東省婦幼保健院醫(yī)學(xué)遺傳中心，廣東 廣州 511442）

短串聯(lián)重復(fù)序列（short tandem repeat，STR）基因座作為重要的人類遺傳學(xué)標(biāo)志，已被廣泛應(yīng)用于人類遺傳學(xué)和法庭科學(xué)。近十幾年來，使用多個(gè)STR基因座的復(fù)合擴(kuò)增試劑盒獲得個(gè)體的等位基因分型進(jìn)行比對(duì)分析，是親子鑒定重要的檢測(cè)應(yīng)用和研究方法之一。在實(shí)踐應(yīng)用中，STR基因座等位基因的突變現(xiàn)象在國(guó)內(nèi)外均有報(bào)道[1-3]，由于等位基因的突變對(duì)親權(quán)指數(shù)的正確計(jì)算、鑒定結(jié)論及親子鑒定的科學(xué)性均有不同程度的影響，本研究對(duì)發(fā)現(xiàn)的2個(gè)突變來源不明家系的突變基因座進(jìn)行了分析，確定突變來源并探討突變基因座親權(quán)指數(shù)的計(jì)算方法。

1 材料和方法

1.1 研究對(duì)象

選取2016—2018年廣東省婦幼保健院日常受理的4 385例親子鑒定案件及司法部的親子鑒定能力驗(yàn)證考核案例，研究家系為生母、孩子和被檢父的三聯(lián)體親子鑒定或者父子/女、母子/女的二聯(lián)體親子鑒定。所有研究對(duì)象均簽署知情同意書。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 DNA提取 家系的血液和血卡樣本按照我國(guó)公安部發(fā)布的GA/T 383—2014《法庭科學(xué)DNA實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)規(guī)范》[4]附錄A中的Chelex-100法常規(guī)提取基因組DNA。

1.2.2 聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增 取DNA提取液1 μL，應(yīng)用Powerplex 21體系（美國(guó)Promega公司）進(jìn)行20個(gè)常染色體STR基因座的多重PCR擴(kuò)增。

1.2.3STR基因座的等位基因分型 Powerplex 21體系包括D3S1358、D8S1179、D6S1043、Penta E、TPOX、D12S391等20個(gè)常染色體基因座，擴(kuò)增片段范圍在500 bp內(nèi)。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物加入ILS500內(nèi)標(biāo)（包含在Powerplex 21體系試劑盒內(nèi)）后應(yīng)用3500XL基因分析儀（美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司）進(jìn)行毛細(xì)管電泳，標(biāo)記每個(gè)STR基因座擴(kuò)增片段的大小。按照Powerplex 21體系操作說明，將電泳數(shù)據(jù)與GeneMapper ID-X軟件（美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司）中預(yù)設(shè)的Powerplex 21體系提供的Ladder中每個(gè)STR基因座等位基因的片段大小進(jìn)行比對(duì)，獲得被檢測(cè)樣本STR基因座的等位基因分型。

1.3 突變來源的研究

1.3.1STR基因座突變的確定 2個(gè)家系應(yīng)用Powerplex 21體系檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，孩子的基因座出現(xiàn)不符合遺傳規(guī)律的現(xiàn)象，對(duì)不符合遺傳規(guī)律的家系分別采用Microreader 23sp ID體系（蘇州閱微基因技術(shù)有限公司）和Identifiler體系（美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司）確定D12S391、D8S1179和TPOX基因座發(fā)生的突變。

1.3.2 突變STR基因座的測(cè)序 針對(duì)發(fā)生突變的STR基因座，查詢UCSC數(shù)據(jù)庫（http：//genome.ucsc.edu） 中基因座的序列信息，設(shè)計(jì)引物進(jìn)行單基因座的PCR擴(kuò)增，引物序列見表1。擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃后延伸5 min。對(duì)PCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序分析。

表1 單基因座擴(kuò)增引物

1.3.3 突變STR基因座的親權(quán)指數(shù)計(jì)算 按照GB/T 37223—2018《親權(quán)鑒定技術(shù)規(guī)范》[5]中三聯(lián)體不符合遺傳規(guī)律的親權(quán)指數(shù)計(jì)算方法，計(jì)算突變STR基因座的親權(quán)指數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 STR基因座的突變情況

Powerplex 21體系檢測(cè)結(jié)果顯示有2個(gè)家系發(fā)生了STR基因座等位基因的突變。見表2。

經(jīng)過Microreader 23sp ID體系和Identifiler體系的檢測(cè)驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)2個(gè)家系發(fā)生了STR基因座等位基因突變，其中一個(gè)家系的突變發(fā)生在D12S391基因座，另一個(gè)家系的突變發(fā)生在TPOX基因座和D8S1179基因座。見表2、圖1。3個(gè)基因座的突變來源均不能明確。

圖1 D12S391、D8S1179和TPOX基因座等位基因分型圖譜

表2 突變基因座在不同檢測(cè)體系的等位基因分型結(jié)果

2.2 突變STR基因座的測(cè)序分析

對(duì)D12S391、TPOX單基因座擴(kuò)增后的測(cè)序分析發(fā)現(xiàn)，2個(gè)家系中孩子在D12S391基因座和TPOX基因座的突變來源于母親。D12S391基因座中，孩子的等位基因18由母親的等位基因19突變而來，孩子的等位基因21來源于父親。TPOX基因座中，孩子的等位基因10由母親的等位基因11突變而來，孩子的等位基因8來源于父親。見圖2、圖3。

圖2 D12S391基因座突變等位基因的序列分析

圖3 TPOX基因座中孩子等位基因10突變的序列分析

2.3 親權(quán)指數(shù)計(jì)算

根據(jù)GB/T 37223—2018《親權(quán)鑒定技術(shù)規(guī)范》[5]中三聯(lián)體不符合遺傳規(guī)律的親權(quán)指數(shù)計(jì)算方法和測(cè)序結(jié)果分析確定的等位基因突變來源，計(jì)算3個(gè)突變STR基因座的親權(quán)指數(shù)如下：D12S391親權(quán)指數(shù)=X/Y=μm/（4p18）；TPOX親權(quán)指數(shù)=X/Y=μm/（2p10）；D8S1179親權(quán)指數(shù)=X/Y=μf/（4p17）；式中X為假設(shè)被檢測(cè)個(gè)體遺傳表型是孩子生物學(xué)父親的概率，Y為假設(shè)隨機(jī)個(gè)體遺傳表型是孩子生物學(xué)父親的概率，μm為女性突變率，μf為男性突變率。

3 討論

親子鑒定中STR基因座發(fā)生突變的現(xiàn)象比較常見，平均突變率為2‰[6]，主要發(fā)生機(jī)制是核心重復(fù)序列出現(xiàn)復(fù)制滑動(dòng)或錯(cuò)配[7]。在親子鑒定實(shí)踐中遇到突變現(xiàn)象時(shí)，首先要確定突變的真實(shí)性，特別是遇到只有單峰的看似為“純合子”，但峰高卻與雜合子相近的等位基因分型時(shí)，考慮突變STR基因座是否存在等位基因丟失或其他異?，F(xiàn)象。面對(duì)這種情況，可以選擇應(yīng)用不同檢測(cè)試劑盒檢測(cè)比對(duì)突變基因座的等位基因分型情況進(jìn)行確定。在生母、孩子和被檢父的三聯(lián)體親子鑒定中，是在母親為生物學(xué)母親的前提下，檢測(cè)被檢父是否為孩子的生物學(xué)父親。如果被檢父是孩子的生物學(xué)父親，根據(jù)孟德爾遺傳規(guī)律，孩子STR基因座的2個(gè)等位基因一個(gè)來自于母親，另一個(gè)來自于被檢父，可以在被檢父的STR基因座中找到來源。如果在檢測(cè)的多個(gè)STR基因座中遇到1個(gè)或2個(gè)不符合孟德爾遺傳規(guī)律的情況，即孩子STR基因座中的1個(gè)等位基因無法在被檢父的STR基因座中找到來源，那么考慮該STR基因座發(fā)生了父源性突變。根據(jù)突變情況計(jì)算該基因座的親權(quán)指數(shù)，在親子鑒定中父源性突變較為常見。但如果出現(xiàn)孩子個(gè)別STR基因座中的1個(gè)等位基因無法在生物學(xué)母親的STR基因座中找到來源時(shí)，則考慮該STR基因座發(fā)生了母源性突變。有時(shí)還會(huì)出現(xiàn)孩子STR基因座難以確定突變來源即突變來源不明的情況。由于父源性突變與母源性突變?cè)谟?jì)算STR基因座的親權(quán)指數(shù)時(shí)應(yīng)用的突變系數(shù)和計(jì)算公式不同，所以可能會(huì)影響親子鑒定的結(jié)論。本研究分析了在鑒定實(shí)踐中遇到的2個(gè)家系的3個(gè)STR基因座不明突變的來源，涉及其父源性突變或母源性突變的確定及親權(quán)指數(shù)計(jì)算。本研究對(duì)發(fā)現(xiàn)的突變基因座分別應(yīng)用Microreader 23sp ID體系或Identifiler體系進(jìn)行驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)與Powerplex 21體系檢測(cè)到的等位基因分型一致。

本研究中D12S391基因座如果考慮父源性突變有2種情況：一步突變（孩子的等位基因18，21：21來自母親，18由父親的17突變而來）或三步突變（21來自母親，18由父親的21突變而來）；如果考慮母源性突變同樣有2種情況：一步突變（孩子的等位基因18，21：21來自父親，18由母親的19突變而來）或三步突變（21來自父親，18由母親的21突變而來）。TPOX基因座如果考慮為母源性突變?yōu)橐徊酵蛔儯ê⒆拥牡任换?，10：8來自父親，10由母親的11突變而來），考慮父源性突變則為兩步突變（孩子的等位基因8，10：8來自母親，10由父親的8突變而來）。D8S1179基因座如果考慮為母源性突變?yōu)樗牟酵蛔儯ê⒆拥牡任换?5，17：15來自父親，17由母親的13突變而來），考慮父源性突變則為一步突變（孩子的等位基因15，17：15來自母親，17由父親的18突變而來）。逐步突變模式理論認(rèn)為，90%的STR基因座突變?yōu)橐徊酵蛔?，且父系來源的突變率較母系來源的突變率高，約為3.5∶1[8-9]。如果按逐步突變理論進(jìn)行推理，首先考慮突變步數(shù)絕大多數(shù)為一步突變，本研究中的TPOX基因座應(yīng)考慮為母源性突變，D8S1179基因座應(yīng)考慮為父源性突變，D12S391基因座父源性突變和母源性突變均有可能。單基因座擴(kuò)增測(cè)序結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)，D12S391基因座孩子等位基因18的突變來源于母親，由母親的等位基因19突變而來，為母源性一步突變，等位基因21來源于父親。TPOX基因座孩子等位基因10的突變來源于母親，由母親的等位基因11突變而來，為母源性一步突變。D12S391和TPOX基因座均符合逐步突變模式理論。根據(jù)GB/T 37223—2018《親權(quán)鑒定技術(shù)規(guī)范》[5]中三聯(lián)體不符合遺傳規(guī)律的親權(quán)指數(shù)計(jì)算方法和測(cè)序結(jié)果分析確定的等位基因突變來源，計(jì)算3個(gè)突變STR基因座的親權(quán)指數(shù)如下：D12S391親權(quán)指數(shù)=X/Y=μm/（4p18）；TPOX親權(quán)指數(shù)=X/Y=μm/（2p10）；D8S1179親權(quán)指數(shù)=X/Y=μf/（4p17）。如果沒有進(jìn)行測(cè)序確定等位基因突變的來源，則可以考慮按照的逐步突變理論，首先考慮一步突變，D12S391基因座親權(quán)指數(shù)=X/Y=（μf+μm）/4p18，TPOX和D8S1179基因座親權(quán)指數(shù)的計(jì)算方式與上述相同。

STR基因座的等位基因突變現(xiàn)象較為常見，由于突變基因座的親權(quán)指數(shù)計(jì)算對(duì)親子鑒定的累積親權(quán)指數(shù)（cumulative parental index，CPI）計(jì)算有較大影響，從而影響鑒定結(jié)論的科學(xué)性。尤其當(dāng)0.000 1＜CPI＜10 000時(shí)，對(duì)于得出“肯定”或者“排除”的結(jié)論具有重要影響。因此，遇到突變時(shí)應(yīng)首先驗(yàn)證突變的真實(shí)性，進(jìn)而確定突變的來源，從而正確計(jì)算突變基因座的親權(quán)指數(shù)，得出科學(xué)、正確的鑒定結(jié)論。