尹 娟， 王瑩超， 眭 陽， 江 春， 時蘊琦， 朱超望

（1.南京醫(yī)科大學(xué)附屬蘇州醫(yī)院 蘇州市立醫(yī)院消化系疾病與營養(yǎng)研究中心，江蘇 蘇州 215008；2. 南京醫(yī)科大學(xué)附屬蘇州醫(yī)院 蘇州市立醫(yī)院檢驗科，江蘇 蘇州 215008）

近年來，隨著碳青霉烯類藥物在臨床的廣泛應(yīng)用，碳青霉烯類耐藥腸桿菌科細(xì)菌（carbapenem-resistantEnterobacteriaceae，CRE）給臨床抗感染治療帶來很大困擾。攜帶碳青霉烯酶基因是CRE的主要耐藥機制，這些耐藥基因存在于可轉(zhuǎn)移質(zhì)粒上，可以在不同菌株間水平傳播 。為了及時、有效地治療CRE感染，臨床實驗室必須具備快速、準(zhǔn)確的鑒定能力。2009年，美國臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）推薦改良Hodge試驗（modified Hodge test，MHT）作為腸桿菌科細(xì)菌碳青霉烯酶表型篩查的常規(guī)方法；2017年，CLSI推薦改良碳青霉烯滅活試驗（modified carbapenem inactivation method，mCIM）作為腸桿菌科細(xì)菌碳青霉烯酶表型篩查方法；2018年，CLSI推薦采用mCIM和乙二胺四乙酸碳青霉烯滅活試驗（ethylene diamine tetraacetic acid-carbapenem inactivation method，eCIM）[1]進(jìn)行腸桿菌科細(xì)菌碳青霉烯酶表型篩查。mCIM用于檢測腸桿菌科細(xì)菌和銅綠假單胞菌中的碳青霉烯酶；eCIM與mCIM聯(lián)合使用，用于區(qū)分產(chǎn)金屬酶和絲氨酸碳青霉烯酶的腸桿菌科細(xì)菌。本研究擬比較MHT和mCIM、eCIM在篩查腸桿菌科細(xì)菌碳青霉烯酶表型中的應(yīng)用價值。

1 材料和方法

1.1 菌株來源

收集2017—2018年南京醫(yī)科大學(xué)附屬蘇州醫(yī)院分離自臨床樣本的亞胺培南和美羅培南耐藥腸桿菌科細(xì)菌117株（實驗組），包括肺炎克雷伯菌83株、大腸埃希菌13 株、產(chǎn)氣腸桿菌9株、陰溝腸桿菌5株、產(chǎn)酸克雷伯菌4株、科澤枸櫞酸桿菌2株和弗勞地枸櫞酸桿菌1株。另收集同期南京醫(yī)科大學(xué)附屬蘇州醫(yī)院碳青霉烯類敏感腸桿菌科細(xì)菌臨床分離株50株為對照組。所有菌株均采用Phoenix 100全自動細(xì)菌鑒定儀及配套革蘭陰性檢測板進(jìn)行細(xì)菌鑒定和體外藥物敏感性試驗，采用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜（matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS）進(jìn)行確認(rèn)。質(zhì)控菌株大腸埃希菌（ATCC 25922）購自我國國家衛(wèi)生健康委臨床檢驗中心。

1.2 儀器與試劑

Phoenix 100全自動細(xì)菌鑒定儀（美國BD公司），Arktik PCR擴增儀（美國Thermo公司），ProXima凝膠成像儀（荷蘭ISOGEN公司），Bruker Microflex LT/SH質(zhì)譜儀（德國Bruker公司），聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）反應(yīng)試劑盒（日本Takara公司），美羅培南和亞胺培南藥物敏感性試驗紙片（英國Oxoid公司），血瓊脂平板和MH平板（鄭州安圖生物有限公司）。

1.3 碳青霉烯酶基因檢測

采用煮沸法制備DNA模板，PCR擴增引物及反應(yīng)條件參照文獻(xiàn)[2-3]，引物信息見表1。PCR擴增產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳及測序確認(rèn)。

表1 碳青霉烯酶基因引物信息

1.4 產(chǎn)碳青霉烯酶腸桿菌科細(xì)菌表型篩查

1.4.1 MHT 用0.9%氯化鈉溶液配制0.5麥?zhǔn)蠞岫却竽c埃希菌（ATCC 25922）菌液，1∶10稀釋，用棉簽涂布于MH平板，在MH平板中心貼亞胺培南紙片，挑取孵育過夜的測試菌株，從紙片邊緣向外劃直線，35 ℃孵育16～20 h后判讀結(jié)果。觀察靠近待測菌株處的大腸埃希菌生長有無增強，如有增強則判為陽性。

1.4.2 mCIM和eCIM 取2管2 mL TSB肉湯，1管為mCIM試驗管，1管加入20 μL 0.5 mol/L乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）溶液用于eCIM試驗（EDTA終濃度為5 mmol/L）。用1 μL接種環(huán)刮取滿環(huán)血瓊脂平板上過夜培養(yǎng)的受試菌菌株，分別加入上述2管TSB肉湯中，將美羅培南紙片浸入菌懸液，35 ℃溫育4 h。制備0.5麥?zhǔn)蠞岫却竽c埃希菌（ATCC 25922）菌懸液，并均勻涂布MH平板，用10 μL接種環(huán)將美羅培南紙片取出貼至MH平板，同一受試菌mCIM和eCIM試驗管中的美羅培南紙片貼于同一MH平板，35 ℃溫育20 h，測量抑菌圈直徑。結(jié)果判斷：（1）mCIM試驗，若美羅培南抑菌圈直徑為6～15 mm或直徑為16～18 mm，但抑菌圈內(nèi)有散在菌落，則結(jié)果陽性，即產(chǎn)碳青霉烯酶；（2）eCIM試驗，當(dāng)mCIM結(jié)果為陽性時，若2張紙片抑菌圈直徑之差≥5 mm，則判為陽性，即產(chǎn)金屬酶。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。敏感性比較采用χ2檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 碳青霉烯類耐藥基因檢測結(jié)果

117株CRE中，有108株檢出碳青霉烯類耐藥基因，其中91株攜帶blaKPC-2、8株攜帶blaNDM-1、6株攜帶blaNDM-5、2株攜帶blaIMP-4、1株同時攜帶blaKPC-2和blaIMP-4基因。50株碳青霉烯類敏感腸桿菌科細(xì)菌均未檢出碳青霉烯耐藥基因。見圖1。

圖1 部分碳青霉烯類耐藥基因PCR產(chǎn)物電泳分析

2.2 MHT、mCIM、eCIM表型篩查

108株攜帶碳青霉烯酶基因的CRE中，MHT陽性94株，敏感性為87%；陰性14株，均攜帶blaNDM基因；mCIM均為陽性，敏感性為100%，顯著高于MHT（χ2=14.97，P＜0.01）。14株攜帶blaNDM基因的菌株eCIM顯示陽性，2株攜帶blaIMP基因的菌株在EDTA濃度為5、10、20 mmol/L時eCIM均顯示為陰性；1株同時攜帶blaKPC和blaIMP基因的菌株，eCIM為陰性；eCIM敏感性為82.4%（14/17）。50株碳青霉烯類敏感腸桿菌科細(xì)菌MHT 、mCIM和eCIM均為陰性。見圖2、表2。

圖2 部分MHT、mCIM和eCIM結(jié)果

表2 MHT、mCIM、eCIM碳青霉烯酶表型篩查結(jié)果 株

3 討論

CRE感染是一個全球性的健康問題，快速、準(zhǔn)確地檢測CRE對于預(yù)防和控制其傳播至關(guān)重要。MHT操作簡單、不需特殊試劑及儀器，目前已被臨床微生物實驗室廣泛采用。MHT對大多數(shù)碳青霉烯酶，特別是KPC酶的敏感性是可以接受的，但對產(chǎn)金屬β-內(nèi)酰胺酶的敏感性較低[4-6]，在超廣譜β-內(nèi)酰胺酶或頭孢菌素酶與孔蛋白缺失的分離株中會出現(xiàn)假陽性結(jié)果，而在產(chǎn)NDM酶的菌株中會產(chǎn)生假陰性結(jié)果。有研究發(fā)現(xiàn)MHT檢測NDM酶的敏感性為50%[4]，本研究產(chǎn)NDM酶的14株腸桿菌科細(xì)菌MHT均為陰性，不同臨床實驗室采用MHT檢測NDM酶的敏感性的差異可能與判讀標(biāo)準(zhǔn)有關(guān)。

由于MHT在檢測上的局限性，2018年CLSI推薦mCIM聯(lián)合eCIM作為新的碳青霉烯酶表型篩查方法[1]。mCIM操作簡單，結(jié)果易解釋，而且不受菌齡、藥物敏感性試驗紙片以及細(xì)菌是否產(chǎn)生黏液的影響[7]，在大多臨床實驗室都可以開展，比MHT有更高的敏感性和特異性[8]。本研究結(jié)果顯示，MHT的敏感性為87.0%，mCIM的敏感性為100.0%，2種方法的特異性均為100.0%。

eCIM是輔助mCIM用于區(qū)分腸桿菌科細(xì)菌產(chǎn)絲氨酸碳青霉烯酶還是產(chǎn)金屬β-內(nèi)酰胺酶，可指導(dǎo)臨床用藥。新研制的內(nèi)酰胺-內(nèi)酰胺酶抑制劑組合（頭孢他啶-阿維巴坦和美羅培南-法硼巴坦）以及其他正在開發(fā)的藥物（亞胺培南/西拉他丁-瑞來巴坦）對大多數(shù)產(chǎn)絲氨酸碳青霉烯酶菌株都有效，但對產(chǎn)金屬β-內(nèi)酰胺酶菌株無效[9]。

eCIM檢測腸桿菌科細(xì)菌的敏感性＞95%[1]，但本研究2株產(chǎn)IMP酶的菌株（1株肺炎克雷伯菌、1株產(chǎn)酸克雷伯菌）eCIM出現(xiàn)假陰性，EDTA終濃度調(diào)整到20 mmol/L仍為陰性結(jié)果。但有研究結(jié)果顯示，在EDTA終濃度為0.1 mmol/L時，攜帶IMP酶的腸桿菌科細(xì)菌eCIM顯示陰性，EDTA終濃度為5 mmol/L時，eCIM則為陽性[10]。本研究中出現(xiàn)假陰性結(jié)果的原因有待進(jìn)一步研究。

與其他表型篩查方法一樣，eCIM不能區(qū)分同時含有絲氨酸酶和金屬酶菌株中的這2種酶。本研究中1株同時攜帶KPC和IMP的肺炎克雷伯菌，mCIM陽性，但eCIM陰性。

本研究涉及的菌株數(shù)量有限，只檢測到3類碳青霉烯酶，其中主要為KPC和NDM。我國腸桿菌科碳青霉烯酶主要為KPC和NDM[11]，其他包括IPM、VIM和OXA-48在腸桿菌科臨床分離株中較為少見[12]。本研究mCIM和eCIM檢測KPC和NDM的敏感性和特異性均達(dá)到100.0%。

綜上所述，采用mCIM篩查碳青霉烯酶比MHT更加敏感和特異，與eCIM聯(lián)合使用可以區(qū)分絲氨酸酶和金屬酶，可有效協(xié)助臨床治療CRE感染。