陳 樸， 馬艷婷， 陳 楠， 于正麟， 程韻楓， 潘柏申， 郭 瑋， 王蓓麗

（1.復旦大學附屬中山醫(yī)院檢驗科，上海 200032；2. 復旦大學附屬中山醫(yī)院血液科，上海 200032）

骨髓增殖性腫瘤（myeloproliferative neoplasms，MPN）是一組以1系或多系造血系統(tǒng)終末細胞增殖為特征的克隆性疾病，起源于造血干細胞。MPN中最常見的亞型是經(jīng)典型MPN，即費城染色體（Philadelphia chromosome，Ph）陰性（Ph-）或BCR-ABL陰性的MPN，包括真性紅細胞增多癥（polycythemia vera，PV）、原發(fā)性血小板增多癥（essential thrombocythemia，ET）和原發(fā)性骨髓纖維化（primary myelofibrosis，PMF）[1]。除已知的JAK2 V617F及12號外顯子（exon12）、CALR、MPL突變是MPN的驅動因素外[2-3]，MPN還與炎癥反應密切相關，基因表達譜顯示許多與免疫和促炎細胞因子相關的基因在MPN中異常表達[4-5]。本研究擬通過分析MPN患者炎癥相關細胞因子水平，探討MPN發(fā)病及向骨髓纖維化轉化過程中炎性指標的變化規(guī)律，揭示其在Ph-MPN進展監(jiān)測、預后判斷、療效評估及疾病治療等方面的臨床應用價值。

1 材料和方法

1.1 研究對象

選取2017年2月—2018年2月復旦大學附屬中山醫(yī)院血液科門診及住院的MPN患者50例），其中男29例、女21例，年齡（62±13）歲，包括PV 16例、ET 25例、PMF 9例?；颊呒膊》中驮\斷及骨髓纖維化分級（MF-0級：無交叉分散的線型網(wǎng)硬蛋白，與正常骨髓一致；MF-1級：存在許多交叉松散的網(wǎng)硬蛋白網(wǎng)，尤其是在血管周圍區(qū)域；MF-2級：廣泛交叉彌漫而密集的網(wǎng)硬蛋白增多，偶見常由膠原構成的灶性厚纖維束和/或局灶性骨硬化；MF-3級：廣泛交叉的彌漫而密集的網(wǎng)硬蛋白增多，以及由膠原構成粗糙的厚纖維束，通常伴有骨硬化）均按世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO）2016年的診斷標準確診，排除Ph陽性或BCR-ABL融合基因陽性者。

選取同期復旦大學附屬中山醫(yī)院體檢健康者20名作為正常對照組，其中男13名、女7名，年齡（57±11）歲。排除心臟疾病、腦血管疾病、糖尿病、結締組織病、腫瘤、感染、肝功能損傷、腎功能損傷等。

1.2 方法

1.2.1 樣本采集與處理 分別使用乙二胺四乙酸二鉀抗凝管（美國BD公司）及含分離促凝膠的真空采血管（美國BD公司）采集所有對象的靜脈血6 mL，低溫（2～8 ℃）條件下1 007×g離心10 min分離血清，分裝于1.5 mL微量離心管（德國Eppendorf公司）中，-80 ℃冷凍保存?zhèn)溆?。MPN患者外周血樣本均在初診時收集。

1.2.2 核酸提取 基因組DNA抽提試劑盒購自廈門致善生物科技股份有限公司，檢測儀器為Lab-Aid 820核酸提取儀（廈門百維信生物科技有限公司）。

1.2.3 基因突變檢測 采用聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）進行基因檢測，引物序列見表1。試劑盒購自日本Takara公司，儀器為ABI Veriti PCR儀（美國ABI公司）。PCR擴增體系為15 μL，其中PCR反應液10 μL、引物F/R 1 μL、去離子水4 μL。PCR反應條件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 20 s，56 ℃ 20 s，72 ℃ 30 s，共45次循環(huán)；40 ℃保溫30 s。PCR擴增產物純化后采用Sanger測序法分析JAK2及MPL基因突變情況，儀器為ABI 3130基因測序儀（美國ABI公司）。采用實時熒光PCR檢測CALR基因突變情況，試劑盒購自上海源奇生物醫(yī)藥科技有限公司，儀器為Light Cycler 480 PCR擴增檢測儀（德國Roche Lightcycler公司）。

表1 引物序列

1.2.4 細胞因子檢測 采用IMMULITE 1000 全自動化學發(fā)光分析儀（德國西門子公司）及配套試劑（化學發(fā)光法）檢測血清腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-alpha，TNF-α）、白細胞介素（interleukin，IL）-1β、白細胞介素2受體（interleukin 2 receptor，IL-2R）、IL-6、IL-8及IL-10水平。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計分析。對計量資料進行正態(tài)分布檢驗和方差齊性檢驗。呈非正態(tài)分布的數(shù)據(jù)以中位數(shù)（M）[四分位數(shù)（P25～P75）]表示，2個組之間比較采用Mann-WhitneyU檢驗，多組間比較采用Kruskal-Wallis檢驗，兩兩比較采用Bonfferonit檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 MPN組與正常對照組各項細胞因子水平的比較

MPN組血清TNF-α、IL-2R、IL-6和IL-8水平均顯著高于正常對照組（P＜0.001），血清IL-10水平顯著低于正常對照組（P＜0.001）。2組之間血清IL-1β水平差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

進一步對MPN的3種亞型進行分析，PV組、ET組及PMF組血清IL-2R、TNF-α、IL-6和IL-8水平均高于正常對照組（P＜0.05），血清IL-10水平均低于正常對照組（P＜0.05）。PMF組血清IL-2R水平高于PV組和ET組（P＜0.05）。PV組、ET組及PMF組之間血清IL-1β水平差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表2。

表2 MPN組與正常對照組各細胞因子水平的比較 M（P25～P75）

2.2 MPN患者的基因突變情況

MPN患者JAK2 V617F突變的總檢出率為76.0%（38/50），其中PV患者檢出率為93.8%（15/16）、ET患者檢出率為68.0%（17/25）、PMF患者檢出率為66.7%（6/9）。MPN患者JAK2 exon12突變總檢出率為2.0%（1/50，該例為PV患者）。MPN患者MPL突變總檢出率為2.0%（1/50，該例為ET患者）。MPN患者CALR突變總檢出率為16.0%（8/50），其中ET占75.0%（6/8），PMF占25.0%（2/8）。有2例患者（1例ET和1例PMF患者）未檢測到突變，為三陰ET/PMF。3種基因突變均未見彼此有合并突變。正常對照組JAK2 V617F、JAK2 exon12、MPL和CALR突變均為陰性。

2.3 JAK2 V617F突變陽性的不同類型MPN患者各細胞因子水平的比較

PMF組JAK2 V617F突變陽性患者血清IL-2R水平顯著高于PV組和ET組JAK2 V617F突變陽性患者（P＜0.01）。PMF組JAK2 V617F突變陽性患者血清TNF-α和IL-8水平高于ET組JAK2 V617F突變陽性患者（P＜0.05）。PMF組JAK2 V617F突變陽性患者血清IL-6水平高于PV組JAK2 V617F突變陽性患者（P＜0.05）。3組JAK2 V617F突變陽性患者之間其他細胞因子水平差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表3。

表3 JAK2 V617F突變陽性的不同類型MPN患者各細胞因子水平比較 M（P25～P75）

2.4 不同骨髓纖維化分級的MPN患者細胞因子水平的比較

骨髓纖維化分級為MF-3級的MPN患者血清TNF-α水平高于MF-0級患者（P＜0.05），血清IL-2R水平高于MF-2級患者（P＜0.05）。骨髓纖維化不同分級之間血清IL-1β、IL-6、IL-8和IL-10水平差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表4。

表4 不同骨髓纖維化分級的MPN患者之間各細胞因子水平的比較 M（P25～P75）

3 討論

PV、ET、PMF是臨床上最為常見的經(jīng)典型MPN，其發(fā)病機制復雜。有研究結果顯示，包括JAK2、CALR和MPL在內的MPN限制性驅動突變異常激活細胞因子受體/兩面神激酶（janus kinase，JAK）2通路及其下游效應物與MPN的發(fā)生密切相關[6]。此類疾病由于病程遷延，且包括纖維化在內的骨髓病變具有病情隱匿、進展緩慢的特點，這給疾病的診療及隨訪帶來了一定的困難。近年來，學者們發(fā)現(xiàn)炎癥在MPN的發(fā)生、發(fā)展中起重要的推動作用，骨髓微環(huán)境的持續(xù)炎癥刺激是導致基因穩(wěn)定性下降及惡性克隆演化的重要誘因，而作為慢性炎癥的主要因素，炎癥相關細胞因子在疾病的病理生理機制中可能具有重要意義[7-8]。外周血細胞因子指標檢測具有便捷、快速等優(yōu)勢，因此在MPN的鑒別診斷、隨訪及療效評價中具有巨大的潛在臨床應用價值。為此，本研究通過檢測MPN患者血清TNF-α、IL-1β、IL-2R、IL-6、IL-8和IL-10水平，以期為尋找與疾病危險性分層及預后評估相關的新指標及開發(fā)潛在治療監(jiān)測靶點提供依據(jù)。

TNF-α是參與全身炎癥反應的細胞信號傳導蛋白，可誘導發(fā)熱、細胞凋亡、惡病質、炎癥反應，并抑制腫瘤發(fā)生和病毒復制，其過度表達與腫瘤的產生相關。IL-1β參與了機體造血系統(tǒng)、神經(jīng)、內分泌系統(tǒng)的反應以及某些抗腫瘤的病理生理過程，還介導了急性髓性白血病、急性淋巴細胞白血病及多發(fā)性骨髓瘤的發(fā)病機制。IL-2R參與了3種細胞內信號傳導途徑，即絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）途徑、磷酸肌醇3-激酶（phosphatidylinositide 3-kinase，PI3K）途徑和JAK/信號轉導及轉錄激活因子（signal transducer and activator of transcription，STAT）途徑[9]，其主要生物學作用包括促進T細胞和自然殺傷（natural killer，NK）細胞活化增殖、抗原特異性記憶T細胞的維持等。IL-6具有調節(jié)免疫應答、調節(jié)造血系統(tǒng)、誘導急性期蛋白、調節(jié)腫瘤生長、調節(jié)神經(jīng)內分泌系統(tǒng)等作用，可通過多種信號途徑直接刺激多種腫瘤細胞的增殖。有研究結果顯示，在多種腫瘤中有失調的IL-6及異常激活的IL-6信號傳導通路[10]。IL-6-JAKSTAT信號通路在多種腫瘤模型中具有重要作用。IL-8在炎癥反應、免疫調節(jié)中起重要作用，可作為炎癥介質引起感染，逐漸侵襲各器官，造成器官功能低下，甚至衰竭，與多種炎性反應性疾病、腫瘤（卵巢癌、胃癌等）和免疫性疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關。IL-10具有雙向免疫調節(jié)作用，不僅影響免疫系統(tǒng)，還可通過調節(jié)生長因子、細胞因子影響許多病理生理過程，包括血管生成、腫瘤形成和感染，還能通過誘導調節(jié)性T細胞在外周免疫耐受中起作用。上述指標在全身性炎癥反應或炎癥信號傳導途徑中發(fā)揮重要作用，并參與了多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。

TNF-α、IL-2R、IL-6和IL-8具有促炎作用，是促炎細胞因子；而IL-10具有抑制炎癥作用，是抗炎細胞因子。本研究結果顯示，MPN患者TNF-α、IL-2R、IL-6和IL-8水平均顯著高于正常對照組（P＜0.001），而IL-10水平則顯著低于正常對照組（P＜0.001）。IL-10的雙向調節(jié)作用使其在不同研究中存在爭議。進一步分析不同類型MPN患者各細胞因子水平的差異，結果顯示PV組、ET組及PMF組血清TNF-α、IL-2R、IL-6和IL-8水平均高于對照組（P＜0.05），PMF組IL-2R水平明顯高于PV組和ET組（P＜0.05）。有研究結果顯示，PMF患者IL-2R與白細胞計數(shù)、紅細胞輸注次數(shù)及JAK2 V617F突變均呈正相關[11]，提示其可作為輔助診斷PMF及隨訪的潛在指標。本研究結果還顯示，PV組、ET組及PMF組血清IL-10水平均低于對照組（P＜0.05），這可能與MPN患者存在炎癥抑制機制失常有關，提示TNF-α、IL-2R、IL-6、IL-8和IL-10在MPN的診斷中有一定的價值，且IL-2R可為MPN亞型的鑒別診斷提供依據(jù)。

本研究結果顯示，JAK2 V617F突變的總檢出率為76.0%（38/50），其中PV患者檢出率為93.8%（15/16），ET患者檢出率為68.0%（17/25），PMF患者檢出率為66.7%（6/9），與文獻報道[12]基本一致。MPN是一個從早期疾病發(fā)展到晚期疾病的“生物學連續(xù)”的概念，其中起驅動作用的JAK2基因突變可導致JAK2-STAT3炎癥通路異常，繼而引起炎癥級聯(lián)反應，刺激腫瘤克隆演化及疾病進展[13]。有研究結果顯示，MPN由早期較低基因突變負荷的JAK2 V617F陽性ET發(fā)展到較高負荷的PV，再發(fā)展到晚期骨髓纖維化的過程中可能會造成MPN患者細胞因子譜的差異[14]。為此，本研究檢測了JAK2 V617F突變陽性MPN患者中各亞型間各細胞因子的水平，結果顯示，PMF組血清IL-2R水平顯著高于PV和ET組（P＜0.01），血清TNF-α、IL-8水平高于ET組（P＜0.05），血清IL-6水平高于PV組（P＜0.05）。提示在JAK2 V617F突變陽性患者中，高水平的IL-2R、TNF-α、IL-8和IL-6可用于PMF的鑒別診斷。但受限于CALR突變組及MPL突變組樣本數(shù)量過少，無法進行JAK2突變組與其余兩者的組間比較，還有待進一步擴大樣本量后深入研究。

在許多情況下，MPN的3種亞型還不能很好地界定，紅細胞增多的同時可能伴有血小板的增多，甚至會出現(xiàn)骨髓纖維化，臨床上也會出現(xiàn)過渡階段的疾病狀態(tài)，如PMF前期在診斷時表現(xiàn)出典型的ET骨髓組織學表型，但進展為MF的概率較高，而且預后比真正的ET差[15-16]。另一方面，臨床上大多數(shù)PV及ET患者長期處于門診對癥治療及隨訪狀態(tài)，疾病癥狀輕微者甚至無需進行干預，但隨著病程的延長，有相當一部分患者存在進展為骨髓纖維化的潛在風險，嚴重者會發(fā)生骨髓衰竭，但此過程往往比較隱匿，只有通過骨髓活檢等侵入性手段才能加以判斷。在長期隨訪過程中何時進行骨髓活檢及其必要性的判斷對臨床來說是一個難題。外周血細胞因子檢測具有簡單、易行、微創(chuàng)的特點，其與MPN患者疾病進展的相關性研究可為尋找病情監(jiān)測、隨訪的新型指標提供依據(jù)。

骨髓纖維化分級對于MPN中真性紅細胞增多癥后骨髓纖維化、原發(fā)性血小板增多癥后骨髓纖維化、PMF前期及纖維化期PMF的判斷有重要的意義。有研究結果顯示，IL-1β、IL-6、IL-10、IL-12、干擾素誘導蛋白10（interferoninducible protein 10，IP-10）等細胞因子與MPN的纖維化轉化有一定的相關性[7，17]。但可能是由于樣本數(shù)有限，本研究中未明顯體現(xiàn)。本研究結果還顯示，骨髓纖維化分級為MF-3級的MPN患者血清TNF-α水平高于MF-0級患者（P＜0.05），血清IL-2R水平高于MF-2級患者（P＜0.05）。這提示TNF-α、IL-2R水平或許可作為骨髓纖維化分級的參考指標。有關炎性細胞因子在骨髓纖維化早期診斷及分級中的價值仍需不斷深入研究。

綜上所述，MPN患者炎癥相關細胞因子（TNF-α、IL-2R、IL-6、IL-8、IL-10）水平異常，且在3種MPN亞型（PV、ET及PMF）中也存在差異，可作為MPN診斷和分型的參考指標，并可作為疾病演化進展分型的依據(jù)。此外，炎癥相關細胞因子與MPN骨髓纖維化的發(fā)展密切相關，在骨髓纖維化早期診斷、分級及協(xié)助判斷骨髓活檢時機方面有很高的臨床價值。由于本研究樣本量較小，未能根據(jù)JAK2、CALR和MPL基因突變檢測結果對不同基因突變患者進行分組分析，以得出更精確的結論。因此，炎癥相關細胞因子在MPN診斷及分型中的作用仍有待進一步深入研究。