諶 飛， 覃再隆， 陳少科， 范 歆， 李 川， 易 賞， 沈亦平， 羅靜思

（1.廣西壯族自治區(qū)婦幼保健院遺傳代謝中心實驗室，廣西 南寧 530002；2.廣西壯族自治區(qū)婦幼保健院內分泌遺傳病?？?，廣西 南寧 530002）

PRKAR1A基因主要指導蛋白激酶A（protein kinase A，PKA）調節(jié)亞單位的合成，是PKA四聚體（2個調節(jié)亞單位、2個催化亞單位）的關鍵組成部分之一。PRKAR1A蛋白具有抑制/激活PKA活化的重要功能，參與調節(jié)環(huán)磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）的細胞內物質代謝以及調控細胞的增殖、分化和凋亡[1]。PRKAR1A基因由1個N端調節(jié)性二聚化/對接結構域、1個包含抑制位點的連接接頭和2個cAMP結合域共同構成。PRKAR1A蛋白本身是一個無活性復合體，與cAMP分子結合后引起可逆的空間構象變化，從而激活PKA并釋放出活性催化亞基，是cAMP信號傳導的主要介導方式[2]。PRKAR1A基因變異通常導致以黏液瘤、色素沉著和內分泌功能亢進三聯(lián)征為典型特征的卡尼復合征，臨床上常需要與McCune-Albright綜合征和庫欣綜合征鑒別[3]。關于卡尼復合征在心胸外科、皮膚科和腫瘤外科等領域的研究已有大量報道[4-5]，但關于PRKAR1A基因變異導致肢端發(fā)育不全1型的病例我國罕見報道。肢端發(fā)育不全1型是一種以身材矮小、嚴重短指畸形、面中部發(fā)育不良和甲狀腺功能異常為主要特征的骨骼發(fā)育不良疾病，其他常見的臨床表現(xiàn)還包括骨齡提前、肥胖癥以及涉及甲狀旁腺激素、促甲狀腺激素（thyroid stimulating hormone，TSH）、降鈣素、生長激素釋放激素和促性腺激素的多激素抵抗等[6-7]。本研究擬通過分析PRKAR1A基因突變導致的肢端發(fā)育不全1型患兒的實驗室指標與疾病表型，旨在為肢端發(fā)育不全1型的鑒別診斷和早期干預提供參考。

1 材料和方法

1.1 研究對象

選取2016年3月—2019年12月廣西壯族自治區(qū)婦幼保健院確診為肢端發(fā)育不全1型的患兒4例，其中男2例、女2例，年齡1～12歲。本研究經(jīng)廣西壯族自治區(qū)婦幼保健院倫理委員會批準，患兒監(jiān)護人均知情同意，并簽署知情同意書。

1.2 樣本采集及測序

收集4例患兒的臨床資料（性別、就診年齡、出生情況、身高、體質量、頭圍、面部畸形、牙齒、短指畸形、智力發(fā)育）及實驗室檢測結果[TSH、生長激素（growth hormone，GH）、糖化血紅蛋白（glycated hemoglobin A1c，HbA1c）、空腹胰島素（fasting insulin，F(xiàn)INS）、胰島素樣生長因子1（insulin-like growth factor 1，IGF-1）、胰島素樣生長因子結合蛋白3（insulin-like growth factor-binding protein 3，IGFBP-3）、促卵泡刺激素（follicle stimulating hormone，F(xiàn)SH）、促黃體生成素（luteinizing hormone，LH）、游離三碘甲狀腺原氨酸（free triiodothyronine，F(xiàn)T3）、游離甲狀腺素（free thyroxine，F(xiàn)T4）、三碘甲狀腺原氨酸（triiodothyronine，T3）、甲狀腺素（thyroxine，T4）、血鉛（plumbum，Pb）、血鎘（cadmium，Cd）、總鈣（calcium，Ca）、堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）、尿常規(guī)]。

采集4例患兒及其父母的靜脈全血3 mL，乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）抗凝，采用Lab-Aid 820核酸自動化提取儀（廈門致善公司）及配套試劑提取基因組DNA。采用Qubit 4.0熒光定量儀（美國Thermo Fisher公司）檢測提取的DNA濃度。采用SureSelect人類全外顯子靶向序列捕獲系統(tǒng)V5試劑盒（美國安捷倫公司）構建基因組DNA的測序文庫，采用HiSeq2500測序系統(tǒng)（美國Illumina公司）進行高通量測序分析。

1.3 測序數(shù)據(jù)分析及基因變異位點解讀

采用基因組分析工具（the genome analysis toolkit，GATK）[8]對測序數(shù)據(jù)進行生物信息學分析。采用TGex高通量測序數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)（美國TGex公司）對變異位點進行注釋和篩選，依據(jù)美國醫(yī)學遺傳學和基因組學學會制定的《遺傳變異分類標準與指南》[9]進行變異位點的解讀與分析，結合患兒臨床表型和致病性預測軟件數(shù)據(jù)，確定變異的致病性等級。對于判斷為致病性、可能致病性及臨床意義不明的變異位點，使用PRKAR1A基因的NM_002734. 4轉錄本，采用Sanger測序法對患兒及其家庭成員進行變異位點的二次驗證。

2 結果

2.1 4例肢端發(fā)育不全1型患兒的臨床資料

4名患兒均為足月順產(chǎn)，無家族史，具有相同的典型臨床特征，具體表現(xiàn)為：（1）嚴重的勻稱性身材矮小[低于同年齡、同性別、同地區(qū)平均兒童身高3～6個標準差（-3s～-6s）]、低體質量[低于同年齡、同性別、同地區(qū)平均兒童體質量2～4個標準差（-2s～-4s）]；（2）短肢畸形，手指短而彎曲，指骨、掌骨發(fā)育不全，見圖1；（3）面中部發(fā)育不良，前額突出、眼距寬、長人中、鼻梁塌陷、短球狀鼻及小下頜，見圖2；（4）甲狀腺功能異常，F(xiàn)T3、FT4正常，TSH升高。4例患兒的一般臨床資料及實驗室檢測結果見表1、表2。

表1 4例肢端發(fā)育不全1型患兒的一般臨床資料

表2 4例肢端發(fā)育不全1型患兒實驗室檢測結果

除以上的共同臨床表現(xiàn)之外，不同病例還有各自不同的表現(xiàn)。

病例1：自幼喂養(yǎng)飲食均正常，5歲時發(fā)現(xiàn)生長發(fā)育明顯落后，現(xiàn)青春發(fā)育延遲，骨齡落后；左手正位數(shù)字化攝影提示左手各掌骨及指骨粗短，干骺端增寬，邊緣不規(guī)則呈喇叭狀，骨骺骨小、不規(guī)則，呈錐狀被包埋，部分干骺愈合；關節(jié)間隙清晰，關節(jié)對位關系可，骨齡落后，見圖3（a）。

病例2：除面部及手部影像特征[圖1（a）、圖2（a）]外，垂體磁共振成像（magnetic resonance imaging，MRI）檢查提示脫髓鞘病變[圖4（a）]。

病例3：除面部及手部影像特征[圖1（b）、圖2（b）]外，母親孕期染色體芯片檢查未見異常，5個月會抬頭，獨坐獨走時間不詳，2歲會說話，提示運動及語言發(fā)育遲緩。

圖1 肢端發(fā)育不全1型患兒手部特征

圖2 肢端發(fā)育不全1型患兒面部特征

病例4：骨齡相符，但左手正位數(shù)字化攝影提示明顯的肢端骨骼發(fā)育異常，見圖3（b）；垂體MRI未見明顯異常，垂體高5.6 mm，腦部雙側卵圓中心多發(fā)異常信號，考慮局灶性脫髓鞘病變可能，見圖4（b）。

圖3 肢端發(fā)育不全1型患兒左手正位數(shù)字化攝影特征

圖4 肢端發(fā)育不全1型患兒垂體MRI特征

2.2 全外顯子高通量測序結果

全外顯子高通量測序結果顯示，病例1、病例2和病例3均攜帶PRKAR1A突變（c.1102C＞T/p.Arg368*），病例4攜帶PRKAR1A突變（c.1118A＞G/p.Tyr373Cys）。上述突變在人群數(shù)據(jù)庫[the Exome Aggregation Consortium（ExAC）、Genome Aggregation Database（GnomAD）]中均未見報道，在致病數(shù)據(jù)庫（PubMed、ClinVar）中均檢索到相似癥狀的病例報道。經(jīng)先證者及其父母的Sanger測序二次驗證，確認上述突變均為新發(fā)突變。根據(jù)《遺傳變異分類標準與指南》，上述突變均被確定為致病性變異。

2.3 文獻已報道的PRKAR1A基因變異種類分析

本研究整理、分析了ClinVar數(shù)據(jù)庫和各類文獻報道中明確臨床診斷的PRKAR1A變異共計49種，其中引起肢端發(fā)育不全1型的12種變異主要分布于結合區(qū)域（以cAMP結合區(qū)為突變熱點區(qū)域），包括錯義突變11種、無效突變1種；引起卡尼復合征的37種變異則廣泛分布于調節(jié)區(qū)域和結合區(qū)域（以調節(jié)性二聚體為突變熱點區(qū)域），包括錯義突變8種、無效突變29種，見圖5。

圖5 PRKAR1A基因突變基因組位置分布圖

3 討論

本研究統(tǒng)計了2016年3月—2019年12月廣西壯族自治區(qū)婦幼保健院兒科門診246例因身材矮小就診的患兒的全外顯子高通量測序數(shù)據(jù)，檢出4例由PRKAR1A變異導致的肢端發(fā)育不全1型患兒，臨床表現(xiàn)為嚴重身材矮小、低體質量、短指、特殊面容及不同程度的激素異常等，與目前我國報道的1例肢端發(fā)育不全1型患兒的癥狀類似[10]。國外報道的同一變異位點患兒，多數(shù)合并隱睪和肥胖的表現(xiàn)[11-13]，但本研究的2例男性患兒并不具有隱睪、肥胖的臨床表現(xiàn)，所有患兒均表現(xiàn)為嚴重的低體質量和生長發(fā)育遲緩。以往報道的患兒均有骨齡超前，可能與其肥胖導致早熟相關。但本研究4例患兒中，2例患兒表現(xiàn)為骨齡落后。此外，本研究首次揭示PRKAR1A變異患兒存在生長激素部分缺乏，這對患兒的身高改善及生長激素治療是否有指導意義有待進一步研究，不同種族及個體間臨床癥狀存在差異的原因也有待深入研究。本研究整理出PRKAR1A突變患兒的實驗室指標與疾病表型，旨在完善我國肢端發(fā)育不全1型患兒的遺傳病診療數(shù)據(jù)，為臨床診斷和個體化用藥提供理論數(shù)據(jù)支持。

PRKAR1A基因具備基因多效性，其導致的肢端發(fā)育不全1型與卡尼復合征在臨床表現(xiàn)上顯著不同。PRKAR1A基因同一密碼子的不同堿基改變所致的不同氨基酸改變也會導致不同的臨床表型。如c.637G＞A/p.A213T和c.865G＞T/p.G289W會導致以骨骼發(fā)育不良為主要表現(xiàn)形式的肢端發(fā)育不全1型，而c.638C＞A/p.A213D和c.866G＞A/p.G289E會導致以多發(fā)性黏液瘤和皮膚黏膜色素性病變?yōu)橹饕憩F(xiàn)形式的卡尼復合征[12]。卡尼復合征的致病突變機制為功能缺失。ELLI等[13]的研究結果顯示，卡尼復合征患兒的PRKAR1A突變體蛋白在表達后會迅速降解，且不與PKA的催化亞基相互作用。PKA原本需要PRKAR1A蛋白結合cAMP才能改變空間構象，從而激活并釋放催化亞基。而無義介導的mRNA降解（nonsense-mediated mRNA decay，NMD）使PRKAR1A蛋白失去調控抑制作用，從而在無需cAMP的情況下增加PKA活性，最終導致類似于庫欣綜合征的臨床表現(xiàn)。肢端發(fā)育不全1型的致病機制與卡尼復合征完全不同，其突變體蛋白并不會像卡尼復合征患兒的PRKAR1A突變體蛋白一樣迅速降解，缺陷的突變體蛋白降低了PKA調節(jié)性亞基對cAMP的親和力，提升了cAMP活化PKA的濃度閾值，最終導致以多激素抵抗和骨骼發(fā)育不良為主要癥狀的肢端發(fā)育不全1型。RHAYEM等[12]和LE STUNFF等[14]采用PRKAR1A相同氨基酸的不同錯義突變導致的卡尼復合征患兒和肢端發(fā)育不全1型患兒構建過表達細胞系，研究基因突變對PRKAR1A蛋白的影響，并在活細胞中利用生物發(fā)光共振能量轉移檢測PRKAR1A突變體蛋白與催化亞基的相互作用，證實cAMP結合缺陷導致PKA激活抗性是肢端發(fā)育不全1型常見的分子機制。

綜上所述，根據(jù)本研究4例PRKAR1A基因突變導致肢端發(fā)育不全1型患兒的臨床資料，相同基因同一密碼子的不同堿基突變可導致不同的臨床癥狀，說明明確患兒的遺傳背景才能有針對性地進行對癥治療和預后管理，這也為臨床工作中類似病例的診療提供了參考。