張 儀， 王增閣， 王 劍

（上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬上海兒童醫(yī)學(xué)中心遺傳分子診斷科，上海 200127）

罕見(jiàn)病又稱“孤兒病”，是單病種發(fā)病率很低、極少見(jiàn)的疾病。此類疾病臨床表型異質(zhì)性大，在診療過(guò)程中易漏診、誤診，加之治療方法有限，不僅影響患兒的生存質(zhì)量，亦使其家庭背負(fù)巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[1]。因此，罕見(jiàn)病的有效診治是醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中亟待解決的一個(gè)問(wèn)題。目前，國(guó)際上已確認(rèn)約7 000種罕見(jiàn)病，患者總數(shù)約占人類疾病患者總數(shù)的10%[2-3]。隨著罕見(jiàn)病診斷技術(shù)的進(jìn)步，不斷有新的病種被識(shí)別。我國(guó)人口基數(shù)大，使得罕見(jiàn)病并不“罕見(jiàn)”，然而多數(shù)臨床醫(yī)生未接受過(guò)系統(tǒng)的遺傳學(xué)培訓(xùn)，限制了罕見(jiàn)病診斷技術(shù)以及治療方法的有效運(yùn)用[4]。

早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早干預(yù)是控制罕見(jiàn)病病情發(fā)展的重要措施，而許多罕見(jiàn)病缺少規(guī)范化臨床實(shí)驗(yàn)室診斷標(biāo)準(zhǔn)，規(guī)范化診斷技術(shù)是提高罕見(jiàn)病診治效率的重要環(huán)節(jié)。本文就罕見(jiàn)病實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)作一綜述，旨在概括性分析各項(xiàng)技術(shù)的優(yōu)缺點(diǎn)，幫助臨床醫(yī)生系統(tǒng)了解罕見(jiàn)病診斷技術(shù)的發(fā)展歷程及趨勢(shì)，理解和選擇用于不同疾病的診斷技術(shù)。

1 細(xì)胞遺傳學(xué)技術(shù)

1.1 染色體核型分析

染色體核型分析作為細(xì)胞遺傳學(xué)檢測(cè)的常用方法，自20世紀(jì)60年代問(wèn)世至今，一直是臨床檢測(cè)染色體數(shù)目或結(jié)構(gòu)異常的常規(guī)技術(shù)，以G顯帶核型分析為主，分辨率為5～7 Mb，是從細(xì)胞水平分析遺傳物質(zhì)，多用于檢測(cè)三倍體、節(jié)段非整倍體及大范圍染色體結(jié)構(gòu)異常等，可檢測(cè)染色體平衡易位及倒位。臨床上常用于不孕不育癥、超聲提示異常、有致畸因素接觸史、流產(chǎn)史或有家族史等患者的產(chǎn)前診斷，常見(jiàn)的染色體疾病如21-三體綜合征、Klinefelter綜合征、Tuner綜合征、染色體易位等均可采用此技術(shù)進(jìn)行診斷。染色體核型分析實(shí)驗(yàn)操作較為簡(jiǎn)便，可直觀體現(xiàn)細(xì)胞遺傳物質(zhì)的全景，但分辨率較低、實(shí)驗(yàn)周期較長(zhǎng)，且結(jié)果分析對(duì)專業(yè)性要求高。近年來(lái)，隨著生物信息學(xué)技術(shù)的發(fā)展，CytoGPS等工具能夠幫助收集、整合核型數(shù)據(jù)，提高數(shù)據(jù)的實(shí)用性，使下游的數(shù)據(jù)分析更為方便[5-6]。

1.2 熒光標(biāo)記原位雜交（fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH）

FISH是將探針標(biāo)記上熒光素來(lái)檢測(cè)DNA序列的一種雜交方法，能夠分析染色體數(shù)目，幫助解析染色體（質(zhì)）空間結(jié)構(gòu)，研究染色質(zhì)結(jié)構(gòu)變異，包括易位、缺失、重復(fù)等。此方法具有簡(jiǎn)便易行、定位準(zhǔn)確、靈敏度高及特異性高等優(yōu)勢(shì)，在臨床診療中主要用于產(chǎn)前診斷和植入前診斷，檢測(cè)細(xì)胞或組織樣本是否存在染色體或基因異常，為各種遺傳病的診斷、分型和預(yù)后提供有力依據(jù)[7-8]。FISH的分辨率高于染色體核型分析，在人類中期染色體上的分辨率水平為1～3 Mb，但檢測(cè)位點(diǎn)有限，只能通過(guò)制備特異性探針檢測(cè)已知位點(diǎn)。但即使多色熒光原位雜交（multiple-fluorescence in situ hybridization，M-FISH）的出現(xiàn)彌補(bǔ)了位點(diǎn)上的不足[5]，也不能完全克服FISH的局限性。隨著FISH技術(shù)的發(fā)展與完善，其分辨率得到改善，靈敏度不斷提高，DNA纖維熒光原位雜交、比較基因組原位雜交（comparative genomic hybridization，CGH）、三維熒光原位雜交（three-dimensional fluorescence in situ hybridization，3D-FISH）等技術(shù)的出現(xiàn)和推廣，相信未來(lái)FISH技術(shù)在罕見(jiàn)病實(shí)驗(yàn)室診斷方面的應(yīng)用也會(huì)有所突破[9]。

1.3 染色體微陣列分析（chromosomal microarray analysis，CMA）

CMA是通過(guò)掃描全基因組檢測(cè)染色體數(shù)目或結(jié)構(gòu)異常的一項(xiàng)技術(shù)，又被稱為 “分子核型”，可檢測(cè)各種拷貝數(shù)變異（copy number variation，CNV）、單親二倍體、雜合性缺失及嵌合體等染色體異常，并可對(duì)染色體的非平衡性變化進(jìn)行準(zhǔn)確的檢測(cè)和定位[10]。由于CMA可更直觀、準(zhǔn)確地描述異?；蚱蔚膩?lái)源，因此被認(rèn)為是罕見(jiàn)病CNV檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn)[11]。CMA目前已廣泛應(yīng)用于胚胎植入前診斷、產(chǎn)前診斷、新生兒篩查及血液病診斷等領(lǐng)域，針對(duì)多發(fā)畸形、孤獨(dú)癥、智力障礙、神經(jīng)肌肉疾病、先天性心臟病及先天性代謝性疾病等進(jìn)行診斷。CMA具有高通量的特點(diǎn)，既能全面掃描基因組，又兼具極高的分辨率，可檢出＞1 kb的基因組CNV，因此可用于傳統(tǒng)技術(shù)不能解決的疑難復(fù)雜疾病的診斷[12]。CMA也具有一定的局限性：（1）不能檢測(cè)染色體平衡易位及倒位；（2）針對(duì)同一樣本，不同檢測(cè)平臺(tái)得出的結(jié)果存在一定的差異；（3）常會(huì)出現(xiàn)一些臨床意義不明的CNV，導(dǎo)致結(jié)果難以判讀。盡管如此，大量的研究結(jié)果仍顯示出CMA在罕見(jiàn)病診斷，尤其是產(chǎn)前診斷中的巨大優(yōu)勢(shì)[12]。近年來(lái)，CMA逐漸向集成化、小型化發(fā)展，芯片實(shí)驗(yàn)室的開(kāi)發(fā)將CMA檢測(cè)步驟集成在小型化平臺(tái)上，無(wú)標(biāo)記檢測(cè)技術(shù)還將進(jìn)一步簡(jiǎn)化未來(lái)的CMA設(shè)備[13]。

1.4 單分子光學(xué)圖譜技術(shù)

單分子光學(xué)圖譜技術(shù)可針對(duì)單個(gè)DNA分子描繪出有序的全基因組限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)圖譜，在分析髙復(fù)雜區(qū)重復(fù)序列和基因組結(jié)構(gòu)變異等方面有極大優(yōu)勢(shì)。該技術(shù)通過(guò)內(nèi)切酶對(duì)基因組DNA進(jìn)行原位切割并標(biāo)記熒光，切割后DNA片段的順序保持不變，經(jīng)超長(zhǎng)單分子高分辨率熒光成像生成酶切位點(diǎn)分布圖。將此技術(shù)與高通量測(cè)序技術(shù)結(jié)合，能夠保持測(cè)序數(shù)據(jù)的序列順序，克服讀長(zhǎng)短產(chǎn)生的誤差，可輔助基因組精確組裝[14]。單分子光學(xué)圖譜技術(shù)還能用于致病性結(jié)構(gòu)變異的檢測(cè)，包括基因組內(nèi)的DNA片段插入、缺失、重復(fù)、倒位、易位及DNA拷貝數(shù)變化等。美國(guó)BioNano公司推出的光學(xué)圖譜平臺(tái)用于臨床檢測(cè)的有效性已得到驗(yàn)證，該技術(shù)能夠成功鑒定出經(jīng)典結(jié)構(gòu)變異疾病——杜氏肌營(yíng)養(yǎng)不良癥的各種結(jié)構(gòu)變異，有望取代肩肱肌營(yíng)養(yǎng)不良癥的分子診斷“金標(biāo)準(zhǔn)”——Southern印記雜交技術(shù)[15-16]。該技術(shù)能夠提供全基因組范圍內(nèi)的結(jié)構(gòu)變異及其順序，能夠檢測(cè)倒位和平衡易位等大小為kb級(jí)別的平衡變異，具有很高的靈敏度，但該技術(shù)無(wú)法檢測(cè)到微小片段的缺失或插入。目前，該技術(shù)的樣本處理、檢測(cè)及數(shù)據(jù)分析流程正在不斷被優(yōu)化，相信單分子光學(xué)圖譜技術(shù)的臨床應(yīng)用未來(lái)可期。

2 分子遺傳學(xué)技術(shù)

2.1 基因組水平

2.1.1 聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）相關(guān)技術(shù) PCR通過(guò)對(duì)特定DNA分子進(jìn)行指數(shù)級(jí)擴(kuò)增的方式，引領(lǐng)診斷技術(shù)真正邁入“分子時(shí)代”。實(shí)時(shí)熒光定量PCR在基因位點(diǎn)分型、拷貝數(shù)變異檢測(cè)等方面有一定的應(yīng)用價(jià)值，但由于其通量較低（單次只能對(duì)幾個(gè)目標(biāo)位點(diǎn)或區(qū)域進(jìn)行檢測(cè)），限制了其在罕見(jiàn)病診斷上的應(yīng)用。另外，還有一些基于PCR的衍生技術(shù)，如限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)分析（restriction fragment length polymorphism，RFLP）及高分辨率熔解曲線（high resolution melting，HRM）等，可檢測(cè)罕見(jiàn)病基因點(diǎn)突變類型[17]；PCR結(jié)合Southern印跡雜交技術(shù)可用于檢測(cè)三核苷酸重復(fù)序列突變（如脆性X綜合征及脊髓小腦共濟(jì)失調(diào)）[18]。

2.1.2 第1代測(cè)序（Sanger測(cè)序） 20世紀(jì)70年代，Sanger測(cè)序的問(wèn)世標(biāo)志著測(cè)序時(shí)代的開(kāi)始。此技術(shù)基于雙脫氧鏈終止法原理，具有高度準(zhǔn)確及快速簡(jiǎn)捷的特性 。在技術(shù)上，Sanger測(cè)序能從單個(gè)堿基水平進(jìn)行分析，彌補(bǔ)了細(xì)胞遺傳學(xué)技術(shù)分辨率較低的問(wèn)題。在適用范圍上，對(duì)于臨床上診斷較明確的單基因疾病，能得到更直接、準(zhǔn)確的結(jié)果，如ATP7B基因突變導(dǎo)致肝豆?fàn)詈俗儾19]、TYR及OCA2基因突變導(dǎo)致白化病[20]等。迄今為止，Sanger測(cè)序仍是測(cè)序的“金標(biāo)準(zhǔn)”，在人類基因組計(jì)劃中起到了關(guān)鍵性作用。相對(duì)于其他基因檢測(cè)技術(shù)，Sanger測(cè)序的準(zhǔn)確性更高，在基因小突變檢測(cè)及驗(yàn)證方面具有很高的應(yīng)用價(jià)值。但Sanger測(cè)序不適用于沒(méi)有明確候選基因或候選基因數(shù)量較多的情況。

2.1.3 第2代測(cè)序（next-generation sequencing，NGS） NGS實(shí)現(xiàn)了大規(guī)模平行測(cè)序，可對(duì)全基因組進(jìn)行序列分析[21]，主要包括全基因組測(cè)序（whole genome sequencing，WGS）、全外顯子組測(cè)序（whole exome sequencing，WES）與目標(biāo)捕獲測(cè)序?？傮w而言，NGS具有通量大、精度高及數(shù)據(jù)豐富等優(yōu)勢(shì)，使得研究人員能夠精準(zhǔn)定位其感興趣的基因。WANG等[22]通過(guò)WES首次報(bào)道了HFM1雙等位基因突變可導(dǎo)致人類隱性原發(fā)性卵巢功能不全。SCHOLL等[23]對(duì)醛固酮增多癥和高血壓患者進(jìn)行WES，發(fā)現(xiàn)至少1個(gè)CLCN2突變與醛固酮增多癥存在關(guān)聯(lián)。在NGS未出現(xiàn)之前，鑒定新致病基因主要是依靠家系遺傳連鎖分析，不僅需要大家系、多個(gè)樣本參與，而且周期較長(zhǎng)，定位不準(zhǔn)確[24]，而WES只需對(duì)少數(shù)家系成員進(jìn)行測(cè)序分析即可鑒定。如何對(duì)海量的數(shù)據(jù)進(jìn)行準(zhǔn)確解讀是NGS面臨的重大問(wèn)題，需要依靠專業(yè)的遺傳學(xué)與生物信息學(xué)分析團(tuán)隊(duì)來(lái)得到可靠的分析結(jié)果。隨著測(cè)序費(fèi)用的不斷降低，生物信息的快速更迭，使結(jié)果的分析更加全面、更加精確。目前，NGS已成為罕見(jiàn)病基因診斷的主要方法，其不僅能檢測(cè)幾個(gè)堿基的基因小突變，也能分析基因組CNV。但由于NGS的讀長(zhǎng)一般只有150 bp左右，導(dǎo)致其無(wú)法準(zhǔn)確檢測(cè)三堿基重復(fù)疾病和具有同源性基因疾病的相關(guān)基因，如CYP21A2基因、SMN1基因等。

2.1.4 第3代測(cè)序 第3代測(cè)序即單分子測(cè)序，無(wú)需PCR擴(kuò)增即可實(shí)現(xiàn)對(duì)單個(gè)DNA分子的測(cè)序。目前，第3代測(cè)序技術(shù)主要有2種，即單分子實(shí)時(shí)測(cè)序技術(shù)（Single-Molecule Real-Time sequencing technology，SMRT）和納米孔測(cè)序技術(shù)，前者通過(guò)檢測(cè)不同堿基標(biāo)記的熒光信號(hào)進(jìn)行測(cè)序，后者則通過(guò)檢測(cè)不同堿基通過(guò)納米孔的電信號(hào)進(jìn)行測(cè)序[25]。第3代測(cè)序克服了NGS的許多不足，不僅發(fā)揮了單分子測(cè)序的優(yōu)勢(shì)，并且具有超長(zhǎng)讀長(zhǎng)，SMRT平均讀長(zhǎng)可達(dá)10 kb，納米孔測(cè)序技術(shù)可達(dá)5 kb；測(cè)序速度快且無(wú)需前期擴(kuò)增，有效避免了擴(kuò)增引入的系統(tǒng)偏向性；能夠用于檢測(cè)高度雜合的基因組、大的結(jié)構(gòu)變異等[26-27]。MERKER等[28]利用第3代測(cè)序技術(shù)檢測(cè)到PRKAR1A基因的結(jié)構(gòu)變異，從而診斷出1例Carney綜合征。盡管有諸多優(yōu)勢(shì)，但第3代測(cè)序錯(cuò)誤率較高，SMRT可達(dá)到15%[29]，雖然是隨機(jī)性錯(cuò)誤，可通過(guò)多次測(cè)序克服，但其在臨床診斷中的應(yīng)用仍有限。隨著技術(shù)進(jìn)步，第3代測(cè)序必定向長(zhǎng)讀長(zhǎng)、低錯(cuò)誤率發(fā)展，從而高效診斷罕見(jiàn)病。

2.1.5 多重連接探針擴(kuò)增技術(shù)（multiplex ligation-dependent probe amplification，MLPA） MLPA是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的一項(xiàng)DNA定性分析和相對(duì)定量分析技術(shù)。其原理是針對(duì)目標(biāo)基因設(shè)計(jì)多對(duì)雜交探針，在完成雜交連接等一系列反應(yīng)后，將目標(biāo)基因的拷貝數(shù)等比例轉(zhuǎn)化為可供擴(kuò)增的雜交探針的數(shù)目，多用于檢測(cè)人類基因組序列中的微缺失和微重復(fù)，識(shí)別DNA甲基化狀態(tài)，檢測(cè)單核苷酸多態(tài)性和點(diǎn)突變，量化mRNA，可用于診斷脊髓性肌肉萎縮癥、假肥大型進(jìn)行性肌營(yíng)養(yǎng)不良癥及Prader-Willi/Angelman綜合征等疾病的診斷[30]。MLPA操作簡(jiǎn)便、靈敏度高、特異性強(qiáng)、重復(fù)性好，但對(duì)雜質(zhì)極其敏感，當(dāng)存在罕見(jiàn)的多態(tài)性或點(diǎn)突變時(shí)，可能會(huì)減少探針信號(hào)，因此需要結(jié)合其他技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)。MLPA對(duì)非整倍體異常的檢測(cè)效能與經(jīng)典染色體核型分析一致，能快速檢測(cè)出染色體非平衡結(jié)構(gòu)異常及經(jīng)典方法不能檢測(cè)到的微小CNV，但MLPA無(wú)法檢測(cè)低水平嵌合、女性三倍體和平衡染色體異常，如倒位和易位等[31]。

2.2 轉(zhuǎn)錄組水平

NGS可對(duì)轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行測(cè)序，即RNA測(cè)序。RNA測(cè)序可檢測(cè)樣本中全部RNA的變異和表達(dá)水平，包括mRNA、微小RNA（microRNA，miRNA）、長(zhǎng)鏈非編碼RNA（long noncoding RNA，lncRNA）等，不僅可診斷某些致病機(jī)制涉及特定RNA的罕見(jiàn)病，還可幫助識(shí)別剪接位點(diǎn)變異所致蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)錄水平異常導(dǎo)致的罕見(jiàn)病。CUMMINGS等[32]利用RNA測(cè)序從遺傳學(xué)角度診斷罕見(jiàn)肌肉疾病，檢測(cè)骨骼肌樣本RNA，表明RNA測(cè)序能夠有效鑒別位于外顯子區(qū)或深內(nèi)含子區(qū)的有害剪接位點(diǎn)變異，總體診斷率可達(dá)35%。RNA測(cè)序在外周血RNA分析中的應(yīng)用可提高臨床診斷率，并減少意義不明變異對(duì)罕見(jiàn)病診斷的干擾；結(jié)合SpliceAI等預(yù)測(cè)軟件進(jìn)行剪接分析，可確定診斷級(jí)別的重要剪接異常，并闡明一些意義不明變異所產(chǎn)生的功能學(xué)效應(yīng)[33]。RNA測(cè)序的臨床應(yīng)用面臨著RNA易降解、組織樣本獲得困難、對(duì)照獲得困難及生物信息學(xué)分析等諸多問(wèn)題，但若這些問(wèn)題能得到有效解決，RNA測(cè)序?qū)⒖赡艹蔀楹币?jiàn)病診斷的重要方法。

3 蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)

蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)可分為蛋白質(zhì)分離、蛋白質(zhì)鑒定、蛋白質(zhì)定量和蛋白質(zhì)生物信息學(xué)分析。經(jīng)典方法如色譜分析等可通過(guò)檢測(cè)蛋白質(zhì)水平等來(lái)輔助診斷疾病，但通量有限，無(wú)法滿足臨床需求。

蛋白質(zhì)芯片、質(zhì)譜等技術(shù)的出現(xiàn)，實(shí)現(xiàn)了對(duì)蛋白質(zhì)表達(dá)水平、轉(zhuǎn)錄后修飾等的高通量檢測(cè)，在疾病蛋白質(zhì)組學(xué)及藥物開(kāi)發(fā)等領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用[34]。蛋白質(zhì)芯片主要分為：（1）分析蛋白質(zhì)芯片，通過(guò)抗體捕獲蛋白質(zhì)來(lái)檢測(cè)其表達(dá)水平及結(jié)合親和力；（2）功能蛋白質(zhì)芯片，分析蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)、核酸、藥物等之間的相互作用；（3）反相蛋白質(zhì)芯片，將待測(cè)組織細(xì)胞裂解物固定于芯片，進(jìn)行定量分析及磷酸化水平、細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等的檢測(cè)[34]。質(zhì)譜技術(shù)通過(guò)檢測(cè)不同質(zhì)荷比的離子及繪制圖譜來(lái)分析蛋白質(zhì)的性質(zhì)，結(jié)合同位素標(biāo)記法可進(jìn)行準(zhǔn)確定量。目前，臨床常用的質(zhì)譜方法包括液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜、基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜等[34]。ROYAL等[35]應(yīng)用質(zhì)譜分析成功診斷出1例免疫熒光法檢測(cè)免疫球蛋白陰性的單克隆免疫球蛋白沉積?。╩onoclonal immunoglobulin deposition disease，MIDD）。VU等[36]應(yīng)用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜成功檢測(cè)到Tay-Sachs病患者神經(jīng)干細(xì)胞的GM2神經(jīng)節(jié)苷脂沉積[36]。GUO等[37]建立了一種基于二維納米超高效液相色譜和質(zhì)譜分析的方法，可從弗里德希氏共濟(jì)失調(diào)患者血小板中檢測(cè)到frataxin蛋白水平下調(diào)，該方法可用于疾病的輔助診斷或干預(yù)效果的判斷。蛋白質(zhì)水平檢測(cè)是罕見(jiàn)病診斷的重要組成部分，蛋白質(zhì)組學(xué)分析結(jié)果可能與疾病表型直接相關(guān)。

此外，X射線晶體學(xué)、核磁共振波譜等技術(shù)可以解析蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)，從蛋白質(zhì)性質(zhì)上為罕見(jiàn)病診斷提供依據(jù)。但由于蛋白質(zhì)翻譯后的修飾及氨基酸殘基之間相互作用等因素的影響，蛋白質(zhì)水平檢測(cè)的復(fù)雜程度遠(yuǎn)高于基因水平檢測(cè)。這要求在發(fā)展核酸水平診斷技術(shù)的同時(shí)，也要注重蛋白質(zhì)水平診斷平臺(tái)的開(kāi)發(fā)。

4 代謝組學(xué)分析

代謝組學(xué)分析可通過(guò)系統(tǒng)化研究小分子（相對(duì)分子質(zhì)量＜1 500 000）代謝產(chǎn)物，進(jìn)行定性或定量分析，提示疾病發(fā)生過(guò)程中隱藏的生化機(jī)制，幫助篩查、診斷罕見(jiàn)病。代謝組學(xué)診斷方法主要包括靶向和非靶向2種，前者僅檢測(cè)目標(biāo)代謝產(chǎn)物相對(duì)于對(duì)照樣本的變化情況，而后者全面比較分析樣本和對(duì)照樣本代謝成分的顯著差異，并通過(guò)生物信息學(xué)和數(shù)據(jù)庫(kù)聯(lián)系對(duì)應(yīng)生化通路。主要技術(shù)包括核磁共振波譜、質(zhì)譜法、色譜法以及色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)。代謝組學(xué)檢測(cè)已在臨床上用于新生兒遺傳代謝病的篩查。GRAHAM等[38]評(píng)估、整合了WGS數(shù)據(jù)和液相色譜-質(zhì)譜非靶向代謝組學(xué)數(shù)據(jù)，確定了引起先天性代謝病的變異及其優(yōu)先級(jí)，提示代謝組學(xué)檢測(cè)對(duì)于罕見(jiàn)病，尤其是遺傳代謝病的篩查、診斷具有重要意義。代謝水平的變化可實(shí)時(shí)揭示機(jī)體生理病理狀態(tài)，代謝組學(xué)所反映的異常指標(biāo)可能是疾病表型最為直接的證據(jù)。但代謝組學(xué)分析對(duì)檢測(cè)人員相關(guān)專業(yè)技術(shù)和經(jīng)驗(yàn)有很強(qiáng)的依賴性，生物體代謝物組成的復(fù)雜性及水平差異給分析方法的通量、精確定量、檢測(cè)靈敏度和檢測(cè)范圍帶來(lái)了巨大的挑戰(zhàn)，因此代謝組學(xué)要在罕見(jiàn)病實(shí)驗(yàn)室診斷上充分發(fā)揮作用還有很長(zhǎng)一段路要走。目前，學(xué)者們愈發(fā)傾向于通過(guò)集成多組學(xué)技術(shù)，將基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)結(jié)合起來(lái)，以克服單組學(xué)技術(shù)的不足，并將其更加全面、準(zhǔn)確地應(yīng)用于包括罕見(jiàn)病診斷在內(nèi)的生物醫(yī)學(xué)研究中，這為罕見(jiàn)病的實(shí)驗(yàn)室診斷提供了新思路[39]。

5 生化檢測(cè)

生化指標(biāo)檢測(cè)也可輔助診斷罕見(jiàn)病，如血清銅藍(lán)蛋白＜80 mg/L是診斷Wilson病的有力證據(jù)[19]；經(jīng)典型21-羥化酶缺陷癥患者血漿17-羥孕酮水平通常超過(guò)100 μg/L，是重要的診斷指標(biāo)[40]。另外，酶活性測(cè)定也可結(jié)合臨床癥狀對(duì)疾病進(jìn)行診斷，如酸性α-糖苷酶活性測(cè)定法是診斷Ⅱ型糖原累積病的金標(biāo)準(zhǔn)[41]。值得注意的是，代謝物的生化檢測(cè)雖能為一些罕見(jiàn)遺傳代謝病的診治提供思路，但由于某些標(biāo)志物特異性不高，其對(duì)于疾病診斷的意義仍有待進(jìn)一步的研究結(jié)果加以證實(shí)。

6 人工智能（artificial intelligence，AI）技術(shù)

目前，將AI技術(shù)與罕見(jiàn)病實(shí)驗(yàn)室診斷相結(jié)合是一個(gè)熱門話題。AI技術(shù)可將多維度和規(guī)?；拇髷?shù)據(jù)轉(zhuǎn)化為臨床可用的知識(shí)，在NGS的變異分析方面有著可觀的應(yīng)用前景，能夠幫助分析變異可能產(chǎn)生的臨床效應(yīng)，進(jìn)行變異分類，并且能夠預(yù)測(cè)剪接位點(diǎn)變異，因此可作為高通量測(cè)序技術(shù)的數(shù)據(jù)分析方法[42-43]。美國(guó)Genomenon公司開(kāi)發(fā)的Mastermind軟件可識(shí)別任何臨床背景下包含給定變異的所有研究，并依據(jù)臨床相關(guān)性排序，提供全面的基因變異譜，從而縮短工作周期、提高診斷效率[42]。美國(guó)Illumina公司開(kāi)發(fā)的SpliceAI軟件可以預(yù)測(cè)基因組剪接位點(diǎn)的位置，并分析高通量測(cè)序技術(shù)數(shù)據(jù)，有效識(shí)別可造成異常剪接事件的非編碼基因變異[43]。此外，人臉識(shí)別是一項(xiàng)關(guān)鍵的AI技術(shù)，能夠通過(guò)辨別特殊面容幫助診斷罕見(jiàn)病。美國(guó)數(shù)字醫(yī)療公司開(kāi)發(fā)的Face2Gene系統(tǒng)可通過(guò)照片識(shí)別疾病相關(guān)的面部特征，從而輔助識(shí)別罕見(jiàn)病[44]。因此，充分發(fā)揮AI技術(shù)的優(yōu)勢(shì)，尤其是其在實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)分析方面的高效利用，將會(huì)大幅提升罕見(jiàn)病實(shí)驗(yàn)室診斷平臺(tái)的工作效率。

7 總結(jié)

罕見(jiàn)病的表型及遺傳學(xué)異質(zhì)性，使其易被漏診和誤診，錯(cuò)過(guò)最佳干預(yù)時(shí)期。因此，提高罕見(jiàn)病的實(shí)驗(yàn)室診斷效率是目前優(yōu)化罕見(jiàn)病診治流程中極為重要的環(huán)節(jié)之一。隨著科技的進(jìn)步，針對(duì)罕見(jiàn)病的診斷技術(shù)已有了極大的發(fā)展，相關(guān)技術(shù)的優(yōu)缺點(diǎn)見(jiàn)表1。經(jīng)典的細(xì)胞遺傳學(xué)和分子遺傳學(xué)技術(shù)仍扮演著不可替代的重要角色，而單分子光譜技術(shù)、高通量測(cè)序、多組學(xué)分析、AI技術(shù)等新技術(shù)的推廣和應(yīng)用，可彌補(bǔ)已有方法的不足。

續(xù)表1

目前，隨著“精準(zhǔn)醫(yī)療”時(shí)代的到來(lái)，各類前沿的檢測(cè)技術(shù)逐步被應(yīng)用于臨床。臨床一線工作者需根據(jù)患者不同的臨床特征擇優(yōu)選取診斷方法，將前沿技術(shù)與傳統(tǒng)方法交替組合使用，才能更高效、更準(zhǔn)確地診斷疾病。相信隨著罕見(jiàn)病診斷技術(shù)的不斷迭代，尤其是與婦產(chǎn)科學(xué)、生殖醫(yī)學(xué)、遺傳學(xué)及AI技術(shù)的相互滲透，人類會(huì)將生物分子與疾病之間的關(guān)系闡述得越來(lái)越透徹。屆時(shí)，一定會(huì)有更為準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便的實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)被開(kāi)發(fā)出來(lái)，用以造福全人類。