高風(fēng)麗 李竹英

（黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150040）

支氣管哮喘（簡稱哮喘）是以氣道慢性炎癥，氣道高反應(yīng)性和氣道重塑為主要特征，因其不斷增長的發(fā)病率和死亡率而備受世界關(guān)注。中國肺健康研究顯示，目前我國哮喘患病人數(shù)約4 570萬，總體發(fā)病率達(dá)4.2%［1］。平喘顆粒是劉建秋教授傳承前輩思想并結(jié)合多年臨床實踐經(jīng)驗所創(chuàng)立，劉教授認(rèn)為哮喘慢性持續(xù)期的病機(jī)根本為陽虛痰盛，故平喘顆粒組方的核心思想為溫陽益氣、化痰平喘。前期研究發(fā)現(xiàn)［2-4］，平喘顆粒可以通過干預(yù)氣道上皮細(xì)胞自噬與凋亡，調(diào)節(jié)樹突細(xì)胞免疫功能，降低嗜酸性粒細(xì)胞活性和功能等途徑發(fā)揮治療哮喘的作用，但其對哮喘氣道重塑的具體機(jī)制尚不明確?；|(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）和基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制劑-1（TIMP-1）能夠通過影響細(xì)胞外基質(zhì)的沉積和降解以及平滑肌細(xì)胞的功能和遷移來引發(fā)氣道重塑［5-6］。本實驗通過觀察平喘顆粒對哮喘小鼠肺組織中MMP-9、TIMP-1水平的影響，探討平喘顆粒在改善氣道重塑方面的作用機(jī)制，為臨床應(yīng)用平喘顆粒治療哮喘提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 選取8周齡健康清潔級雌性BALB/c小鼠30只，購自遼寧長生生物技術(shù)股份有限公司，許可證號：SCXK（遼）2015-0001，體質(zhì)量（20±2）g，飼養(yǎng)環(huán)境溫度（22±1）℃，濕度為45%～55%，自由進(jìn)食飲水，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后開始實驗。

1.2 試藥與儀器 平喘顆粒，組方：淫羊藿200 g，太子參150 g，黃芪 150 g，五味子150 g，知母100 g，炙麻黃100 g，款冬花（炙）150 g，地龍100 g，罌粟殼40 g。藥材加水煎煮2次，每2小時過濾1次，通過醇沉方式［7］濃縮成稠膏，相對密度為1.20～1.25（60 ℃），加入蔗糖、糊精適量制成1 000 g顆粒，由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院制備，批號：20180723。普米克令舒（吸入用布地奈德混懸液），2 mL/支，阿斯利康公司，批號：H20140475。卵蛋白（上海阿拉丁生化科技股份有限公司，A107820）；MMP-9 ELISA試劑盒（廈門侖昌碩生物科技有限公司，20381）；TIMP-1 ELISA試劑盒（廈門侖昌碩生物科技有限公司，20382）。超聲霧化機(jī)NB-150U，歐姆龍自動化（中國）有限公司；石蠟切片機(jī)RM2235，德國Leica；Lx81研究級倒置熒光顯微鏡，日本Olymps公司；酶標(biāo)儀ELX-800，美國伯騰儀器有限公司；微量移液器Proline，芬蘭百得實驗室儀器（中國）有限公司；電熱恒溫培養(yǎng)箱DH36001B，天津市泰斯特儀器有限公司。

1.3 分組與造模 40只BALB/c小鼠隨機(jī)分為4組，每組10只，分別是對照組、哮喘組、平喘顆粒組、普米克令舒組。對照組腹腔注射及霧化吸入等體積生理鹽水代替OVA激發(fā)，其余3組進(jìn)行慢性哮喘造模。根據(jù)文獻(xiàn)［8］方法，應(yīng)用OVA致敏液［100 μg OVA+1 mg Al（OH）3］激發(fā)BALB/c小鼠，制備慢性哮喘小鼠模型。于實驗第1、14日給予小鼠腹腔注射0.2 mL致敏液，22 d后進(jìn)行霧化激發(fā)，霧化吸入1%OVA溶液，每次30 min，每周進(jìn)行3次，連續(xù)激發(fā)8周。

1.4 給藥方法 從第1次霧化激發(fā)的當(dāng)天開始，平喘顆粒組按前期研究的最佳質(zhì)量濃度（1.08 g/mL）含藥溶液灌胃，根據(jù)人體與動物的每千克體質(zhì)量劑量折算系數(shù)計算，按照0.1 mL/10 g灌胃，持續(xù)給藥8周，激發(fā)階段則每次激發(fā)前1 h灌。對照組和哮喘組給予等體積的0.9%氯化鈉注射液灌胃，灌胃時間同平喘顆粒組。普米克令舒組給予普米克令舒藥液0.5 mg/mL（布地奈德1 mg與0.9%氯化鈉注射液2 mL混合），每次霧化30 min，霧化時間同平喘顆粒組。

1.5 標(biāo)本采集與檢測 1）各組小鼠末次激發(fā)24 h后處死，開胸取固定的肺組織行石蠟包埋、切片，將病理切片行Masson染色，光鏡下觀察肺組織的病理學(xué)改變。2）采用計算機(jī)圖像分析系統(tǒng)（Image-Pro Plus Ver?sion 6.0）分析病理圖像，測定支氣管基底膜周徑（Pbm）、氣道平滑肌面積（WAm）、支氣管總面積（WAt），并將測得的WAm、WAt用Pbm標(biāo)準(zhǔn)化，以WAm/Pbm、WAt/Pbm數(shù)值分別表示氣道平滑肌和支氣管管壁的厚度。3）取約小鼠1/2右肺組織勻漿，用ELISA法測定肺組織中MMP-9和TIMP-1的水平，具體操作方法嚴(yán)格按照ELISA試劑盒說明書進(jìn)行。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS20.0統(tǒng)計軟件。計量數(shù)據(jù)以（）表示，組間比較用單因素方差分析，兩兩比較用LSD檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠肺組織Masson染色結(jié)果比較 對照組小鼠肺組織及支氣管結(jié)構(gòu)基本上處于正常狀態(tài)；哮喘組小鼠氣管壁和氣道平滑肌明顯增厚，管腔狹窄，上皮組織增生、脫落，黏膜腫脹、充血，且氣道周圍可見較多的藍(lán)色膠原纖維組織。平喘顆粒組上述病理結(jié)構(gòu)改變明顯減輕，但與正常組仍有差距，氣道周圍可見少量的藍(lán)色膠原纖維組織。普米克令舒組上述病理結(jié)構(gòu)改變和膠原沉積均明顯減輕，見圖1。

圖1 各組小鼠肺組織Masson染色（200倍）

2.2 各組小鼠WAm/Pbm、WAt/Pbm比較 見表1。與對照組比較，哮喘組小鼠氣道平滑肌厚度、支氣管管壁厚度明顯增加（P<0.05）。給予平喘顆粒和普米克令舒治療后小鼠氣道平滑肌厚度、支氣管管壁厚度明顯降低（P<0.05），兩組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。

表1 各組小鼠WAm/Pbm、WAt/Pbm比較（μm2/μm，±s）

表1 各組小鼠WAm/Pbm、WAt/Pbm比較（μm2/μm，±s）

注：與對照組比較，?P<0.05；與哮喘組比較，△P<0.05。下同。

組別對照組哮喘組平喘顆粒組普米克令舒組n 10 10 10 10 WAm/Pbm 13.01±0.60 27.56±0.94*15.36±0.39*△15.50±0.27*△WAt/Pbm 35.59±1.64 70.69±3.01*49.04±1.41*△49.53±1.79*△

2.3 各組小鼠肺組織MMP-9和TIMP-1表達(dá)水平比較 見表2。與對照組比較，哮喘組小鼠肺組織中MMP-9和TIMP-1的表達(dá)水平明顯增高（P<0.05）。給予平喘顆粒和普米克令舒治療后小鼠肺組織中MMP-9和TIMP-1的表達(dá)水平明顯降低（P<0.05），兩組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。

表2 各組小鼠肺組織MMP-9和TIMP-1表達(dá)水平比較（ng/L，±s）

表2 各組小鼠肺組織MMP-9和TIMP-1表達(dá)水平比較（ng/L，±s）

組別對照組哮喘組平喘顆粒組普米克令舒組n 10 10 10 10 MMP-9 55.22±2.10 92.77±4.89*62.39±2.53*△60.74±3.32*△TIMP-1 49.11±1.19 83.01±3.54*54.10±1.73*△53.67±2.63*△

3 討論

氣道重塑是哮喘的重要病理特征，是哮喘反復(fù)發(fā)作和遷延不愈所導(dǎo)致的一系列氣道結(jié)構(gòu)的改變，能夠?qū)е禄颊叱霈F(xiàn)不可逆的氣流受限以及持續(xù)存在的氣道高反性，成為哮喘難以根治的主要原因。氣道重塑的過程極為復(fù)雜，主要改變包括氣道上皮細(xì)胞黏液化生、細(xì)胞外基質(zhì)合成和沉積增加、平滑肌細(xì)胞增殖遷移、上皮下膠原沉積和纖維化等。研究表明，細(xì)胞外基質(zhì)在氣道重塑中起到了重要作用，其在氣道壁過度沉積和降解失衡會導(dǎo)致氣道結(jié)構(gòu)和功能的改變［9］。MMP-9是調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)的主要限速酶，與其特異性抑制劑TIMP-1共同維持著細(xì)胞外基質(zhì)的正常生長和機(jī)體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。正常生理情況下，MMP-9和TIMP-1在機(jī)體中保持平衡狀態(tài)，若MMP-9和TIMP-1出現(xiàn)過度分泌及比例失調(diào)時，這種平衡狀態(tài)將被打破，導(dǎo)致氣道壁的細(xì)胞外基質(zhì)出現(xiàn)異常狀態(tài)從而引發(fā)氣道重塑［10-11］。MMP-9可以通過降解以Ⅳ型膠原為主的細(xì)胞外基質(zhì)和血管中的膠原成分，誘導(dǎo)氣道平滑肌細(xì)胞增殖、分化、遷移至氣道壁和血管外，增加平滑肌肌層厚度和促進(jìn)新血管形成，引發(fā)氣道重塑［12-14］。MMP-9能刺激轉(zhuǎn)化生長因子β1（TGF-β1）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等生長因子的釋放，促進(jìn)上皮下成纖維細(xì)胞的增殖分化而參與氣道重塑［15］。TIMP-1通過與MMP-9發(fā)生特異性結(jié)合而抑制MMP-9的活性，阻礙細(xì)胞外基質(zhì)的降解，使其在氣道內(nèi)過度沉積而引起氣道壁增厚，進(jìn)而導(dǎo)致氣道重塑［16］。

平喘顆粒是黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)自制的中藥制劑，由淫羊藿、太子參、黃芪、五味子、知母、炙麻黃、款冬花、罌粟殼、地龍組成。方中淫羊藿、炙麻黃共為君藥，具有溫補腎陽、宣肺平喘之功；黃芪、太子參、五味子、款冬花、地龍共為臣藥，具有益氣助陽、潤肺生津、止咳平喘之功；罌粟殼斂肺止咳，為方中之佐藥，酸澀收斂，可防君藥辛散耗氣；知母潤肺止咳，引方中諸藥歸經(jīng)，為方中之使藥。方中補陽之劑配伍補陰之品，使陽得陰助而生化無窮，藥物配伍收斂并用，升降有序，虛實同治，與哮喘陽虛痰盛之病機(jī)相合，諸藥合用共奏溫陽益氣、化痰平喘之效。本實驗應(yīng)用OVA致敏液制備慢性哮喘小鼠模型，哮喘組小鼠肺組織可見氣管壁和氣道平滑肌明顯增厚，管腔狹窄，上皮組織增生、脫落，黏膜腫脹、充血，且氣道周圍可見較多的藍(lán)色膠原纖維組織等病理改變，WAm/Pbm、WAt/Pbm均明顯增高，表明哮喘模型制備成功，模型組小鼠存在氣道重塑。研究結(jié)果顯示，與哮喘組相比，平喘顆粒組和普米克令舒組小鼠氣道病理結(jié)構(gòu)改變和膠原沉積均明顯減輕，WAm/Pbm、WAt/Pbm明顯下降，且肺組織中MMP-9和TIMP-1的表達(dá)水平明顯下降。

綜上所述，平喘顆?？梢詼p輕哮喘小鼠肺組織病理學(xué)改變，改善氣道重塑，其機(jī)制可能與抑制MMP-9和TIMP-1的表達(dá)有關(guān)。本文探討了平喘顆粒治療哮喘氣道重塑的作用機(jī)制，但哮喘是一種多因素、多機(jī)制引發(fā)的復(fù)雜病癥，且中藥復(fù)方成分多樣化，可以通過多靶點、多途徑、多環(huán)節(jié)發(fā)揮治療疾病的作用，故我們今后仍需要大量的實驗研究去探索更加深入，更加全面的作用機(jī)制，為臨床的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。