李霞，閆富龍，柯寄明，方曉琳，陳衛(wèi)東，2，3，4，5，彭燦，2，3，4

(1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，合肥 230012；2.安徽省教育廳現(xiàn)代藥物制劑工程技術(shù)研究中心，合肥 230012；3.中藥復(fù)方安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，合肥 230012；4.安徽省中醫(yī)藥科學(xué)院藥物制劑研究所，合肥 230012；5.安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥物代謝研究所，合肥 230012)

秋水仙堿是一種典型的細(xì)胞有絲分裂毒素，結(jié)構(gòu)中的C環(huán)與微管蛋白結(jié)合可阻止其聚合成紡錘絲，使細(xì)胞有絲分裂停止于中期。該藥屬于生物藥劑學(xué)分類系統(tǒng)(biopharmaceutics classification system，BCS)中的Ⅲ類藥物[1-3]，即高溶解、低滲透藥物，臨床主要用于治療痛風(fēng)，治療家族性地中海熱和心包炎等也有效[4-7]。目前國(guó)內(nèi)市場(chǎng)上生產(chǎn)秋水仙堿片仿制藥的廠家較多，不同廠家生產(chǎn)的同一制劑或同一生產(chǎn)廠家不同批號(hào)產(chǎn)品質(zhì)量和療效可能存在一定差異。但文獻(xiàn)有關(guān)秋水仙堿片溶出度的研究筆者較少見到，且多局限于單一溶出介質(zhì)，如水[8]。在多種溶出介質(zhì)下溶出曲線測(cè)定已成為國(guó)內(nèi)外評(píng)價(jià)固體制劑內(nèi)在品質(zhì)的重要手段，是提高仿制藥生物等效性實(shí)驗(yàn)成功率的必經(jīng)之路。筆者在本實(shí)驗(yàn)以秋水仙堿為模型藥物，根據(jù)2015年版《中華人民共和國(guó)藥典》及文獻(xiàn)[8]，采用小杯法建立秋水仙堿片在水、pH值4.5醋酸鹽緩沖液和pH值6.8磷酸鹽緩沖液3種不同溶出介質(zhì)中溶出方法，并采用f2相似性因子評(píng)價(jià)5個(gè)不同廠家秋水仙堿片溶出曲線相似性，以期為國(guó)內(nèi)企業(yè)秋水仙堿片仿制藥質(zhì)量一致性評(píng)價(jià)研究工作和處方工藝開發(fā)提供參考。

1 儀器與試藥

1.1儀器 Waters ACQUITY Arc高效液相色譜儀系統(tǒng)(美國(guó)Waters公司，2489紫外檢測(cè)器，2424蒸發(fā)光散射檢測(cè)器)；YL-060數(shù)控超聲波清洗器(濟(jì)南巴克超聲波科技有限公司，360 W，40 Hz)；電子天平(賽多利斯科學(xué)儀器有限公司，感量：0.01 mg)；ZRS-8L智能溶出實(shí)驗(yàn)儀(天津天大天發(fā)科技有限公司)。

1.2試藥 秋水仙堿片樣品信息見表1。鹽酸、冰醋酸、醋酸鈉、磷酸二氫鉀、氫氧化鈉均為分析純，實(shí)驗(yàn)用水為超純水，甲醇為色譜純。

2 方法與結(jié)果

2.1方法學(xué)考察

2.1.1色譜條件 參考2015年版《中華人民共和國(guó)藥典》及文獻(xiàn)[9-10]，色譜柱：Unitaryl C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm) ；流動(dòng)相：甲醇-水(52：48)；檢測(cè)波長(zhǎng)：254 nm；柱溫：30 ℃；流速：1.0 mL·min-1；進(jìn)樣量：20 μL。

2.1.2溶液的配制 ①對(duì)照品溶液的制備：精密稱取秋水仙堿對(duì)照品3 mg，置50 mL棕色量瓶，分別用相應(yīng)溶出介質(zhì)溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品儲(chǔ)備液。②供試品溶液的制備：取秋水仙堿片，分別在水、pH值4.5醋酸鹽緩沖液以及pH值6.8磷酸鹽緩沖液3種溶出介質(zhì)條件下實(shí)驗(yàn)，取溶出液用孔徑0.22 μm微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液即得。

2.1.3專屬性考察 分別取對(duì)照品溶液、供試品溶液以及空白對(duì)照溶液，照“2.1.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。結(jié)果表明空白對(duì)照對(duì)測(cè)定無(wú)干擾，對(duì)照品溶液中的秋水仙堿峰與供試品溶液中的秋水仙堿峰保留時(shí)間相同，表明該方法專屬性良好。結(jié)果見圖1。

2.1.4線性關(guān)系實(shí)驗(yàn) 精密量取對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，分別用3種溶出介質(zhì)稀釋，得到濃度約0.05，0.1，0.2，0.5，2.5和5.0 μg·mL-1秋水仙堿系列對(duì)照品溶液。精密量取秋水仙堿系列對(duì)照品溶液20 μL，照“2.1.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，以秋水仙堿濃度(X) 為橫坐標(biāo)，峰面積(Y) 為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程見表2。結(jié)果表明，秋水仙堿在0.05～5.0 μg·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.1.5精密度實(shí)驗(yàn) 取“2.1.3”項(xiàng)對(duì)照品溶液，照“2.1.1”項(xiàng)色譜條件重復(fù)測(cè)定6次，結(jié)果3種介質(zhì)中秋水仙堿峰面積的RSD分別為0.26%，0.77% 和0.62%，表明儀器精密度良好。

2.1.6穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取“2.1.3”項(xiàng)3種介質(zhì)供試品溶液適量，分別于室溫下放置0，2，4，6，8，12，24 h后，照“2.1.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果3種介質(zhì)中秋水仙堿峰面積的RSD分別為為2.9%，1.6%和3.7%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.7加樣回收率實(shí)驗(yàn) 取秋水仙堿片20片，研細(xì)，精密稱取適量(相當(dāng)于秋水仙堿0.5 mg)置100 mL量瓶，加溶出介質(zhì)適量，超聲使藥物溶解，定容。在已知濃度不同溶出介質(zhì)的秋水仙堿溶出液中，分別加入相當(dāng)于秋水仙堿含量80%，100%和120%的對(duì)照品，用相應(yīng)溶出介質(zhì)超聲溶解并稀釋至刻度，搖勻，過(guò)濾，即得3種不同濃度溶液，每個(gè)濃度平行制備3份，取續(xù)濾液按“2.1.1”項(xiàng)條件測(cè)定，結(jié)果見表3，表明方法回收率良好。

2.2溶出度測(cè)定

2.2.1溶出度測(cè)定方法 參照《中華人民共和國(guó)藥典》2015年版四部溶出度測(cè)定方法小杯法(通則0931第三法)[11]，取本品12片，依次以水、pH值4.5醋酸鹽緩沖液、pH值6.8磷酸鹽緩沖液200 mL為溶出介質(zhì)，轉(zhuǎn)速為50 r·min-1，分別于 5，10，15，20，30，40，50，60，90，120，180 min 取樣1 mL，同時(shí)補(bǔ)加等量同溫溶出介質(zhì)，以孔徑0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾，取續(xù)濾液進(jìn)樣，記錄色譜圖，采用高效液相色譜(HPLC)法測(cè)定峰面積，計(jì)算溶出量，以時(shí)間為橫坐標(biāo)，累積溶出百分率為縱坐標(biāo)，繪制溶出曲線。

表1 秋水仙堿片樣品信息

a.對(duì)照品；b.供試品；c.空白對(duì)照品；1.秋水仙堿；A.水；B.pH值4.5醋酸鹽緩沖液；C.pH值6.8磷酸鹽緩沖液。

表2 回歸方程與線性范圍

表3 回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

累積溶出百分率：(RN%)=Mn/M標(biāo)

Mn為累積溶出量(mg)，RN%為累積溶出百分率，V1為溶出介質(zhì)體積，V2為每次取樣體積，Cn為第n個(gè)時(shí)間的溶出濃度，Ci為第i個(gè)點(diǎn)的溶出濃度，M標(biāo)為秋水仙堿片標(biāo)示量(mg)。

5個(gè)廠家不同批次秋水仙堿片在水、pH值4.5醋酸鹽緩沖液、pH值6.8磷酸鹽緩沖液3種溶出介質(zhì)中的累積溶出曲線圖如圖2所示。

A、B.介質(zhì)水；C、D.介質(zhì)pH值4.5醋酸鹽緩沖液；E、F.介質(zhì)pH值6.8磷酸鹽緩沖液。

式中Rt與Tt分別代表受試制劑與參比制劑在時(shí)間點(diǎn)t時(shí)的累積溶出百分率，n為取樣點(diǎn)的個(gè)數(shù)。本實(shí)驗(yàn)采用樣品2-1作為參比制劑。

當(dāng)50≤f2≤100 時(shí)，表明兩種制劑的溶出曲線相似。相似因子f2計(jì)算結(jié)果見表4。

表4 f2因子結(jié)果統(tǒng)計(jì)

由表4可知，秋水仙堿片在水、pH值4.5醋酸鹽緩沖液以及pH值6.8磷酸鹽緩沖液中f2相似因子均在50～100內(nèi)，說(shuō)明不同廠家秋水仙堿片體外溶出行為一致。

3 討論

3.1溶出度與相似因子 在我國(guó)藥品市場(chǎng)上仿制藥占比很大，但仿制藥質(zhì)量參差不齊，嚴(yán)重影響了藥品安全和有效性評(píng)價(jià)。我國(guó)于2012年開始進(jìn)行仿制藥質(zhì)量一致性評(píng)價(jià)工程?？疾熘苿┰诙喾N溶出介質(zhì)下的溶出狀況，可以全面反映制劑的內(nèi)在質(zhì)量[13]。近年來(lái)研究認(rèn)為，基于生物藥劑學(xué)分類系統(tǒng)(biopharmaceutics classification system，BCS)理論的溶出實(shí)驗(yàn)是最能替代藥物生物等效性研究的體外實(shí)驗(yàn)方法。溶出曲線相似性比較的方法有很多，常見的有兩條溶出曲線相似性參數(shù)法、模型依賴法，以及非模型依賴法等。模型依賴法參數(shù)物理意義不能解釋清楚。而兩條溶出曲線相似性參數(shù)法借鑒了相似等效限法中的逐點(diǎn)比較的做法，在計(jì)算中考慮到溶出值的差與溶出的離散度，并在結(jié)果判斷中引入基本相似與整體相似的概念，計(jì)算簡(jiǎn)便。但是兩條溶出曲線相似性參數(shù)法為點(diǎn)與點(diǎn)的比較，未考慮溶出值與時(shí)間的交互作用。筆者在本實(shí)驗(yàn)中采用非模型依賴法中f2相似因子法評(píng)價(jià)溶出曲線的相似性，該方法為國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局(CFDA)推薦使用的方法，也是目前CFDA 推行的口服固體制劑質(zhì)量一致性評(píng)價(jià)中使用最廣泛的方法[14-16]，該法簡(jiǎn)單迅速，可準(zhǔn)確評(píng)價(jià)受試制劑和參比制劑的溶出行為差異。

筆者在本實(shí)驗(yàn)中選擇了溶出行為較為穩(wěn)定、溶出均一性良好的樣品2-1作為參比制劑，且采用f2相似因子法評(píng)價(jià)5個(gè)不同廠家不同批次秋水仙堿片的溶出曲線相似性，這在一定程度上可以反映5個(gè)廠家片劑內(nèi)在質(zhì)量差異。若f2值≥50，則認(rèn)為兩條溶出曲線溶出行為相似。該方法簡(jiǎn)單，可用于快速評(píng)價(jià)受試制劑與參比制劑溶出行為的相似性。

3.2溶出介質(zhì)的選擇 固體制劑口服給藥后，藥物的吸收取決于藥物從制劑中的溶出或釋放、藥物在生理?xiàng)l件下的溶解以及在胃腸道的滲透。此外，溶出度實(shí)驗(yàn)應(yīng)盡可能在生理?xiàng)l件下進(jìn)行。根據(jù)《普通口服固體制劑溶出曲線測(cè)定與比較指導(dǎo)原則》及相關(guān)文獻(xiàn)[13]，需要考察參比制劑和仿制制劑在多種介質(zhì)中溶出曲線的一致性。由于秋水仙堿是一種生物堿，在前期多次預(yù)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，秋水仙堿片在pH值1.2鹽酸溶液的溶出實(shí)驗(yàn)中不穩(wěn)定，所以筆者在本實(shí)驗(yàn)中主要考察了秋水仙堿片在水、pH值4.5醋酸鹽緩沖液以及pH值6.8磷酸鹽緩沖液中的溶出狀況。