陳桂林，徐姍，吳紫娟，吳祎

(江蘇省常州市第二人民醫(yī)院藥學(xué)部，常州 213000)

冠狀動(dòng)脈球囊擴(kuò)張、冠狀動(dòng)脈內(nèi)溶栓以及冠狀動(dòng)脈旁路移植術(shù)在缺血性心臟病治療中應(yīng)用廣泛，其能夠恢復(fù)心肌血流，挽救患者生命，但手術(shù)造成的缺血/再灌注(ischemia/reperfusion，I/R)損傷已成為日益突出的問(wèn)題[1-2]。研究表明，心肌損傷區(qū)過(guò)量自由基是引發(fā)心肌損傷的關(guān)鍵，自由基清除劑能緩解組織和細(xì)胞損傷[3-5]。五子衍宗丸最早記載于唐代，由五味藥材(枸杞子、菟絲子、覆盆子、五味子、車(chē)前子)組成，有研究認(rèn)為五子衍宗丸多糖具有清除自由基作用[6]。筆者在本研究中從五子衍宗丸提取多糖(即五子衍宗丸多糖)，并用于治療心肌缺血性疾病模型，以探討其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1試藥與儀器 五味子(批號(hào)：20180108)、菟絲子(批號(hào)：20180115)、枸杞子(批號(hào)：20180118)、覆盆子(批號(hào)：20180122)、車(chē)前子(批號(hào)：20180130)各50 g，均購(gòu)自廣州致信藥業(yè)有限公司，經(jīng)本院藥學(xué)部吳祎副主任中藥師鑒定，均符合2015年版《中華人民共和國(guó)藥典》標(biāo)準(zhǔn)。

白細(xì)胞介素6(IL-6)標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自美國(guó)Sigma公司(批號(hào)：2018025556)，IL-12標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自美國(guó)Sigma公司(批號(hào)：2018025891)；正常小鼠心肌細(xì)胞購(gòu)自武漢普諾賽生命科技有限公司(批號(hào)：CP-M073)；噻唑藍(lán)(MTT)比色法試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司(批號(hào)：2018-1123)；乳酸脫氫酶(LDH)、肌酸磷酸激酶(CK)、丙二醛(MDA)、過(guò)氧化氫酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)及谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所(批號(hào)分別為20180315，20180419，20180423，20180321，20180410，20180417)，IL-6酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)試劑盒(批號(hào)：2018-5297)和IL-12 ELISA試劑盒(批號(hào)：2018-09028)購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；小鼠抗人B淋巴細(xì)胞瘤-2基因(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)單克隆抗體(批號(hào)：2018036500)、兔抗鼠Bac多克隆抗體(批號(hào)：2018029985)、兔抗人含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(cysteinyl aspartate specific proteinase，caspase-3)單克隆抗體(批號(hào)：2018061135)、二抗辣根過(guò)氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)標(biāo)記的山羊抗兔IgG、HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG(批號(hào)：2018090046)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。ELISA酶標(biāo)儀購(gòu)自南京德鐵實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司(儀器型號(hào)：HBS-1096C)；免疫蛋白印跡法(Western blotting)電泳儀購(gòu)自美國(guó)Bio-rad公司。

1.2五子衍宗丸多糖的提取與鑒定 將五味子、菟絲子、枸杞子、覆盆子以及車(chē)前子等5 種中藥材粉碎，根據(jù)《中華人民共和國(guó)藥典》2015年版記錄混勻，石油醚回流2 次。藥渣以50%乙醇回流提取，所得樣品以水溶解，再以正丁醇萃取，將藥渣水提取濃縮液混合均勻，乙醇沉淀，干燥后得五子衍宗丸多糖[6]。

五子衍宗丸多糖的鑒定：準(zhǔn)確吸取樣品測(cè)定液2.0 mL，置25 mL比色管，加入50 g·L-1苯酚溶液1.0 mL，旋轉(zhuǎn)混勻器混勻，小心加入濃硫酸10.0 mL于旋轉(zhuǎn)混勻器上，小心混勻，置沸水浴中煮沸2 min，冷卻至室溫，分光光度計(jì)在波長(zhǎng)485 nm處以試劑空白為參比，1 cm比色皿測(cè)定吸光度值。從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出葡聚糖含量，計(jì)算樣品中多糖含量[6]。

1.3細(xì)胞的分組與處理 取正常小鼠心肌細(xì)胞，培養(yǎng)，隨機(jī)分為5組：陰性對(duì)照組，正常小鼠心肌細(xì)胞分離純化后培養(yǎng)[7-8]；誘導(dǎo)組，正常小鼠心肌細(xì)胞培養(yǎng)液加入100 μmol·L-1過(guò)氧化氫(H2O2)，反應(yīng)2 h；大劑量組，以1×10-4mol·L-1五子衍宗丸多糖培養(yǎng)正常小鼠心肌細(xì)胞24 h，加100 μmol·L-1H2O2反應(yīng)2 h；中劑量組，以5×10-5mol·L-1五子衍宗丸多糖培養(yǎng)正常小鼠心肌細(xì)胞24 h，加入100 μmol·L-1H2O2反應(yīng)2 h；小劑量組，以1×10-5mol·L-1五子衍宗丸多糖培養(yǎng)正常小鼠心肌細(xì)胞24 h，加入100 μmol·L-1H2O2反應(yīng)2 h。

1.4心肌細(xì)胞活力檢測(cè) 采用MTT比色法檢測(cè)分離純化的小鼠心肌細(xì)胞活力。將小鼠心肌細(xì)胞分組處理，每孔加5 mg·mL-1MTT 20 μL，反應(yīng)4 h。除去上清液，加二甲基亞砜(DMSO)150 μL，酶標(biāo)儀檢測(cè)波長(zhǎng)570 nm處吸光度值(A值)。

1.5總抗氧化能力及氧化平衡體系酶測(cè)定 應(yīng)用酶偶聯(lián)法檢測(cè)心肌肌酸激酶(creatine kinase，CK)；比色法檢測(cè)心肌細(xì)胞總抗氧化能力(total antioxidant capacity of cardiomyocytes，T-AOC)，2，4 -二硝基苯肼顯色法檢測(cè)乳酸脫氫酶(LDH)活性，硫代巴比妥酸法檢測(cè)丙二醛(MDA)含量，黃嘌呤氧化酶法檢測(cè)超氧化物歧化酶(SOD)活力，二硫代二硝基苯甲酸法檢測(cè)谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)含量，鉬酸銨法檢測(cè)過(guò)氧化氫酶(catalase，CAT)活力。

1.6ELISA法檢測(cè)小鼠IL-6與IL-12水平 酶標(biāo)儀測(cè)量在波長(zhǎng)450 nm處A值，以標(biāo)準(zhǔn)品A值為橫坐標(biāo)，以0，0.5，1，2，5，10 ng·μL-1IL-6的A值為縱坐標(biāo)；以IL-12標(biāo)準(zhǔn)品A值為橫坐標(biāo)，以0，5，10，20，50，100 pg·μL-1IL-12A值為縱坐標(biāo)，根據(jù)Curve Expert1.3版軟件繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)樣品A值，以Excel WPS計(jì)算相應(yīng)濃度。

1.7Western blotting檢測(cè)相關(guān)蛋白表達(dá) 將小鼠心肌組織研磨成粉末，裂解30 min，4 ℃離心，提取上清液，二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA)蛋白活性測(cè)定試劑盒檢測(cè)蛋白定量。取蛋白30 μg進(jìn)行10%聚丙烯酰胺凝膠電泳(polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE)，電泳分離的蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜，室溫下5%脫脂牛奶反應(yīng)1 h，充分洗滌，分別添加一抗小鼠抗人Bcl-2單克隆抗體(1：1 000 )、兔抗鼠Bax多克隆抗體(1：1 000 )及兔抗人caspase-3單克隆抗體(1：1 000)，4 ℃過(guò)夜，充分洗滌，添加HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG(1：10 000)或HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG(1：10 000)，室溫反應(yīng)30 min，充分洗滌，電化學(xué)發(fā)光(electrochemiluminescence，ECL)化學(xué)發(fā)光液反應(yīng)1 min，全自動(dòng)數(shù)碼凝膠圖像分析系統(tǒng)攝影。

2 結(jié)果

2.1心肌細(xì)胞活力 結(jié)果見(jiàn)表1。與陰性對(duì)照組比較，誘導(dǎo)組心肌細(xì)胞A值降低(P<0.05)，提示其細(xì)胞活力下降；與誘導(dǎo)組比較，五子衍宗丸多糖各劑量組A值升高(P<0.05)，提示五子衍宗丸多糖可有效提升被H2O2損傷的心肌細(xì)胞活力。

2.2心肌細(xì)胞上清液LDH與CK釋放量 結(jié)果見(jiàn)表2。與陰性對(duì)照組比較，誘導(dǎo)組心肌細(xì)胞上清液LDH和CK釋放量升高(P<0.05)；與誘導(dǎo)組比較，五子衍宗丸多糖各劑量組細(xì)胞上清液LDH與CK釋放量均降低(P<0.05)。

2.3心肌細(xì)胞SOD與MDA含量測(cè)定結(jié)果 結(jié)果見(jiàn)表3。與陰性對(duì)照組比較，誘導(dǎo)組心肌細(xì)胞SOD活力降低(P<0.05)；與誘導(dǎo)組比較，五子衍宗丸多糖各劑量組SOD活力增加(P<0.05)；與陰性對(duì)照組比較，誘導(dǎo)組細(xì)胞MDA含量升高(P<0.05)；與誘導(dǎo)組比較，五子衍宗丸多糖高劑量組MDA降低(P<0.05)。

2.4心肌細(xì)胞GSH-Px與CAT含量 結(jié)果見(jiàn)表4。與陰性對(duì)照組比較，誘導(dǎo)組GSH-Px活性降低；與誘導(dǎo)組比較，五子衍宗丸多糖中、大劑量組細(xì)胞GSH-Px活性更高(P<0.05)；與陰性對(duì)照組比較，誘導(dǎo)組CAT活性降低(P<0.05)；與誘導(dǎo)組比較，五子衍宗丸多糖各劑量組CAT活性升高，其中大劑量組CAT活性明顯高于誘導(dǎo)組(P<0.05)。

表1 5組心肌細(xì)胞活力測(cè)定結(jié)果

表2 5組心肌細(xì)胞上清液LDH與CK釋放量測(cè)定結(jié)果

2.5心肌細(xì)胞中IL-6與IL-12 結(jié)果見(jiàn)表5。與陰性對(duì)照組比較，誘導(dǎo)組細(xì)胞培養(yǎng)液IL-6與IL-12含量升高(P<0.05)；與誘導(dǎo)組比較，五子衍宗丸多糖各劑量組細(xì)胞培養(yǎng)液IL-6與IL-12含量降低(P<0.05)。

2.6Bcl-2，Bax及caspase-3蛋白表達(dá) 結(jié)果見(jiàn)表6及圖2。Western bloting結(jié)果表明，誘導(dǎo)組細(xì)胞培養(yǎng)液Bcl-2 及caspase-3蛋白表達(dá)高于陰性對(duì)照組，Bax蛋白表達(dá)量低于陰性對(duì)照組(均P<0.05)。與誘導(dǎo)組比較，五子衍宗丸多糖各劑量組Bcl-2和caspase-3蛋白表達(dá)量減少，Bcl-2 及caspase-3蛋白表達(dá)下調(diào)，Bax蛋白表達(dá)上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表3 5組心肌細(xì)胞SOD及 MDA含量測(cè)定結(jié)果

表4 5組心肌細(xì)胞GSH-Px與CAT含量測(cè)定結(jié)果

3 討論

心肌細(xì)胞損傷時(shí)，心肌細(xì)胞中CK、LDH以及AST等酶被釋放入血，因此其均屬于心肌損傷關(guān)鍵標(biāo)志物[9-10]。MDA導(dǎo)致機(jī)體出現(xiàn)脂質(zhì)過(guò)氧化物[11-12]，一般可用于檢測(cè)細(xì)胞損傷程度[13-14]。MTT檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，H2O2可抑制小鼠心肌細(xì)胞活性，五子衍宗丸多糖能提升過(guò)氧化損傷心肌細(xì)胞活力。本研究結(jié)果顯示，正常心肌細(xì)胞會(huì)被H2O2損傷，心肌細(xì)胞外LDH和CK釋放量升高，細(xì)胞內(nèi)MDA含量升高，表明H2O2引發(fā)細(xì)胞過(guò)氧化損害。

表5 5組心肌細(xì)胞上清液IL-6與IL-12測(cè)定結(jié)果

表6 5組心肌細(xì)胞Bcl-2，Bax及Caspase-3蛋白表達(dá)量測(cè)定結(jié)果

與誘導(dǎo)組比較，五子衍宗丸多糖各劑量組細(xì)胞外液LDH和CK量降低，細(xì)胞內(nèi)MDA含量降低，表明五子衍宗丸多糖可緩解細(xì)胞損傷。SOD可以清除自由基，在抗氧化機(jī)制中十分關(guān)鍵[15-16]。GSH-Px可維護(hù)細(xì)胞膜功能[17-18]。本研究顯示，五子衍宗丸多糖能提升過(guò)氧化損傷心肌細(xì)胞SOD、GSH-Px及CAT活性。表明五子衍宗丸多糖可有效提升心肌細(xì)胞SOD、GSH-Px及CAT活性，抑制脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，對(duì)受損細(xì)胞進(jìn)行修復(fù)。即五子衍宗丸具有清除氧自由基、抗氧化損傷、維持機(jī)體抗氧化防御系統(tǒng)平衡和抑制多元醇通路異常活躍作用，從而減輕組織細(xì)胞損傷，其機(jī)制可能與其抗氧化應(yīng)激、抑制炎癥細(xì)胞因子TNF-α表達(dá)有關(guān)。本研究與殷金龍等[22]研究相互印證，即五子衍宗丸抗炎活性可能通過(guò)抑制核因子-κB 信號(hào)通路介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)以及抗氧化應(yīng)激實(shí)現(xiàn)。

圖2 5組Bcl-2，Bax及caspase-3蛋白表達(dá)

綜上所述，五子衍宗丸多糖可有效緩解心肌細(xì)胞過(guò)氧化損傷，抑制機(jī)體脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，緩解炎癥因子對(duì)心肌細(xì)胞的損傷，其作用機(jī)制可能與下調(diào)Bcl-2 及Caspase蛋白表達(dá)、上調(diào)Bax蛋白表達(dá)有關(guān)。因此推測(cè)五子衍宗丸多糖可用于治療心血管疾病。