徐丹，李瑞陽，李晶，王儒涵，蘭婷，鞏平

(石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，石河子 832000)

胃癌(gastric carcinoma，GC)是最常見的惡性腫瘤之一[1]，由于胃癌高侵襲性及高轉(zhuǎn)移性，大多數(shù)患者確診時已屬晚期。研究發(fā)現(xiàn)[2]，上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)能使細(xì)胞獲得侵襲、轉(zhuǎn)移特征。大蒜素(allicin)是從大蒜中提取的揮發(fā)性油狀物，其主要化學(xué)成分二烯丙基三硫化物(diallyl trisul fidc，DATS)是大蒜素發(fā)揮抗癌活性的主要物質(zhì)[3]。有報道顯示，大蒜素對宮頸癌、結(jié)腸癌等多種腫瘤均有明顯抑制作用[4]，是理想的抗腫瘤藥物。本研究以白細(xì)胞介素6(IL-6)體外誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞系，構(gòu)建胃癌細(xì)胞EMT模型，觀察大蒜素對其E-鈣粘蛋白(E-cadherin)、波形蛋白(vimentin)及核因子κB P65 (NF-κB P65)表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1材料 人胃癌細(xì)胞株HGC-27(中國科學(xué)院細(xì)胞庫，目錄號：TCHu 22) ；大蒜素注射液(Solarbio，規(guī)格：每瓶20 mg，批號：SA8720)；重組人IL-6(美國Peprotech公司，批號：031316-1) ；青鏈霉素混合液( Solarbio，批號：20170720)，RPMI1640培養(yǎng)基[塞默飛世爾(蘇州)生物化學(xué)制品有限公司，批號：8117196]；二甲基亞砜(Solarbio，批號：520C0318) ；胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS，美國Gibco公司，批號：10091-148) ；Transwell試劑盒(美國康寧公司，批號：23317042)；CCK-8試劑盒(日本同仁化學(xué)研究所，批號：KS607)；Matrigel matrix(美國康寧公司，批號：7156009)；無菌超凈工作臺(上海力新公司)；二氧化碳(CO2)培養(yǎng)箱(美國ThermoScientific公司)；顯微鏡(日本奧林巴斯公司)；離心機(德國Eppendorf公司)；7500 FastReal-TimePCR system(美國AB公司)。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞的培養(yǎng) 人胃癌細(xì)胞株HGC-27培養(yǎng)于含10%FBS、青鏈霉素混合液(×100)RPMI-1640培養(yǎng)基，37 ℃、5%CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)箱培養(yǎng)。細(xì)胞70%～80% 融合時以胰蛋白酶消化傳代，每2或3 d傳代1次。共分為4組：空白對照組，培養(yǎng)胃癌細(xì)胞HGC-27，不作任何處理；IL-6組，常規(guī)培養(yǎng)胃癌細(xì)胞HGC-27，加入50 ng·mL-1IL-6培養(yǎng)72 h；大蒜素組，常規(guī)培養(yǎng)胃癌細(xì)胞HGC-27，加入3 μg·L-1大蒜素培養(yǎng)48 h；大蒜素聯(lián)合IL-6組，常規(guī)培養(yǎng)胃癌細(xì)胞HGC-27，加入50 ng·mL-1IL-6培養(yǎng)72 h，再加入3 μg·L-1大蒜素繼續(xù)培養(yǎng)48 h。

1.2.2實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(realtime quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR)實驗 分組同“1.2.1”項，按照RNA提取試劑盒及反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明，提取各組細(xì)胞 RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA。按反應(yīng)條件進行相關(guān)反應(yīng)，每組設(shè)3個復(fù)孔。以肌動蛋白β(actin beta，β-Actin)為內(nèi)參，將空白對照組mRNA表達(dá)量定為100%，以 2-△△Ct法計算E-cadherin、vimentin及NF-κB P65mRNA相對表達(dá)量，PCR反應(yīng)條件為95 ℃30 s，95 ℃5 s，60 ℃30 s，40個循環(huán)。各基因引物由上海生工生物公司設(shè)計合成，引物序列見表1。

表1 RT-qPCR引物序列

1.2.3CCK-8實驗 取對數(shù)生長期胃癌細(xì)胞株HGC-27，胰酶消化，制成單細(xì)胞懸液，每孔100 μL接種于96孔板(每孔2.0×103個)，細(xì)胞貼壁后棄去原培養(yǎng)液，分別以配制好的IL-6、大蒜素、大蒜素聯(lián)合IL-6培養(yǎng)液處理，空白對照組加入等體積RPMI 1640混合培養(yǎng)液，置于37 ℃恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)，分別于24，48和72 h加入CCK-8 試劑(每100 μL培養(yǎng)液含CCK-8試劑10 μL)，繼續(xù)培養(yǎng)2 h，酶聯(lián)免疫檢測儀檢測波長450 nm處各孔吸光度(A值)。

1.2.5Transwell體外侵襲實驗 將1：8稀釋Matrigel(RMPI 1640稀釋)加入Matrigel侵襲小室上室，37 ℃放置2 h，水化基底膜，制備細(xì)胞懸液：按照“1.2.1”項分組，隨后用胰蛋白酶消化各組處理好的細(xì)胞，終止消化后離心棄去培養(yǎng)液，無血清RPMI 1640培養(yǎng)基沖懸，借助細(xì)胞計數(shù)板調(diào)整細(xì)胞密度，接種6×104含無血清培養(yǎng)液于小室上室，向小室下室24孔板加入含20%FBS的RMPI 1640培養(yǎng)液，37 ℃培養(yǎng)48 h。取出侵襲小室，吸凈上室培養(yǎng)基，甲醛固定20 min，結(jié)晶紫染色，磷酸鹽緩沖液清洗3次，棉簽輕輕擦凈上室，倒置顯微鏡下計數(shù)膜背面細(xì)胞數(shù)，隨機計數(shù)6個視野，取平均值，每組重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1E-cadherin、vimentin及NF-κB P65表達(dá)情況 RT-qPCR檢測結(jié)果顯示，與空白對照組比較，IL-6組E-cadherin表達(dá)下調(diào)，vimentin及NF-κB P65表達(dá)上調(diào)(均P<0.05)；與空白對照組比較，大蒜素組E-cadherin表達(dá)上調(diào)，Vimentin及NF-κB P65表達(dá)下調(diào)(均P<0.05)；與IL-6組比較，大蒜素聯(lián)合IL-6組E-cadherin表達(dá)上調(diào)，Vimentin及NF-κB表達(dá)下調(diào)，均差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖1。

2.2CCK-8實驗結(jié)果 見表2。與空白對照組比較，大蒜素組不同時間細(xì)胞增殖能力明顯減弱，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)；與空白對照組比較，IL-6組不同時間細(xì)胞增殖能力更高(均P<0.05)；與IL-6組比較，大蒜素聯(lián)合IL-6組不同時間細(xì)胞增殖能力減弱(均P<0.05)。見圖2。

2.3細(xì)胞劃痕實驗 空白對照組、IL-6組、大蒜素組、大蒜素聯(lián)合IL-6組12 h劃痕愈合比分別為(27.78±6.72)%，(23.50±3.49)%，(5.70±3.85)%，(13.29±5.03)%；24 h劃痕愈合比分別是(46.60±2.10)%，(51.06±2.11)%，(29.30±3.07)%，(36.43±0.96)%。與空白對照組12，24 h比較，大蒜素組劃痕愈合百分比減小，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與IL-6組12，24 h比較，大蒜素聯(lián)合IL-6組劃痕愈合百分比縮小(P<0.05)，尤其是24 h，IL-6組劃痕處幾乎被遷移細(xì)胞遮蓋，而大蒜素聯(lián)合IL-6組細(xì)胞遷移能力明顯減弱(圖3)。

①與空白對照組比較，t=-6.933～7.473，P<0.05；②與IL-6組比較，t=-4.052～3.575，P<0.05。

表2 4組細(xì)胞不同時間增殖能力比較(A450)

2.4Transwell體外侵襲實驗結(jié)果 空白對照組、IL-6組、大蒜素組、大蒜素聯(lián)合IL-6組每視野穿過Transwell侵襲小室的細(xì)胞數(shù)均呈正態(tài)分布，分別為139.00±9.35，161.40±18.93，91.00±12.21，109.60±2.51。與空白對照組比較，大蒜素組侵襲數(shù)目明顯減少，IL-6組侵襲數(shù)目增多，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與IL-6組比較，大蒜素聯(lián)合IL-6組侵襲數(shù)目表現(xiàn)出減少趨勢，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖4。

3 討論

EMT是許多腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的重要過程。在胃癌、肺癌、乳腺癌等多種腫瘤發(fā)生發(fā)展的過程中均發(fā)現(xiàn)EMT作用[5]。在EMT發(fā)生中，常發(fā)現(xiàn)E-cadherin表達(dá)下調(diào)或E-cadherin-環(huán)連蛋白復(fù)合物功能失調(diào)[6]。存在于間充質(zhì)細(xì)胞中的中間絲蛋白vimentin在調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架蛋白、細(xì)胞粘附分子等方面也起到非常重要的作用。多條通路都能誘導(dǎo)EMT，很多研究認(rèn)為，多種轉(zhuǎn)錄因子及其他調(diào)控因子、microRNAs、各種細(xì)胞微環(huán)境等可通過Wnt/β-catenin、EGFR/Ras和TGF-β/Smad等信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路激活EMT[7]。然而，針對NF-κB信號通路的研究指出，在各類血液腫瘤或?qū)嶓w腫瘤中，例如黑色素瘤[8]、乳腺癌[9]和結(jié)腸癌[10]等，NF-κB的活性組成性高。而且NF-κB活性組成的抑制是通過抑制腫瘤細(xì)胞的組織侵襲和轉(zhuǎn)移能力，降低轉(zhuǎn)化細(xì)胞的惡性增殖能力等方式阻斷腫瘤細(xì)胞的致癌性[11]。NF-κB是一種重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，在刺激因素作用下，胞質(zhì)中的抑制蛋白IκB發(fā)生磷酸化降解，解除了對NF-κB的抑制，釋放其進入核內(nèi)參與調(diào)節(jié)多種基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，使其在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用[12]。

圖2 4組細(xì)胞不同時間增殖能力比較

①與空白對照組比較，t=4.941～8.054，P<0.05；②與IL-6組比較，t=2.890～10.938，P<0.05。

①與空白對照組比較，t=2.372～6.979，P<0.05；②與IL-6組比較，t=-6.066，P<0.05。

大蒜素是多種烯丙基有機硫化物的復(fù)合體，天然存在于百合科植物大蒜的鱗莖中，其有效攝入可抑制多種腫瘤，如肺癌、肝癌及胰腺癌等的發(fā)生[13-14]。本研究探討NF-κB信號通路是否在大蒜素對胃癌EMT作用機制中產(chǎn)生影響。RT-qPCR結(jié)果顯示，與空白對照組比較，IL-6組E-cadherin表達(dá)下調(diào)，vimentin表達(dá)上調(diào)，說明IL-6誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞發(fā)生了EMT；此外，與IL-6組比較，大蒜素聯(lián)合IL-6組E-cadherin表達(dá)上調(diào)，vimentin表達(dá)下調(diào)，表明大蒜素對IL-6誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞的EMT具有抑制作用，即大蒜素對經(jīng)IL-6誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞發(fā)生了EMT；同時大蒜素聯(lián)合IL-6組NF-κB表達(dá)明顯下降，故推測大蒜素可能通過調(diào)節(jié)NF-κB信號通路發(fā)揮對胃癌HGC-27細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的抑制作用。通過增殖、遷移、侵襲等相關(guān)功能實驗進一步證實，發(fā)生EMT的胃癌細(xì)胞系侵襲和轉(zhuǎn)移能力均提高，而大蒜素可逆轉(zhuǎn)這一過程。

此外，EMT也參與細(xì)胞外基質(zhì)、基底膜降解和破壞的溶解酶，從而破壞腫瘤細(xì)胞侵襲的組織學(xué)屏障，便于細(xì)胞從原發(fā)腫瘤分離脫落，發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移。因此，研究EMT分子調(diào)控機制可為研究預(yù)防腫瘤轉(zhuǎn)移提供有利平臺。有研究證實[14]，經(jīng)大蒜素處理的胰腺癌細(xì)胞間質(zhì)細(xì)胞表型向上皮細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化、侵襲、遷移能力明顯減弱，與本研究的結(jié)果一致。CHEN等[15]研究發(fā)現(xiàn)，與對照組比較，大蒜素不僅可以顯著抑制荷瘤小鼠的腫瘤生長，還可以下調(diào)腫瘤組織vimentin的水平。

綜上所述，大蒜素能夠抑制胃癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，這種機制可能通過調(diào)節(jié)NF-κB信號通路，抑制IL-6誘導(dǎo)的胃癌細(xì)胞EMT效應(yīng)實現(xiàn)，從而可能在有IL-6過表達(dá)的晚期腫瘤組織侵襲轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用。但大蒜素對胃癌細(xì)胞具體的作用機制及NF-κB信號通路對EMT的調(diào)控作用有待進一步研究。