張富友，于曉慧，蔣文明，孫淑紅，趙 鵬，劉華雷，李 陽

（1.山東農(nóng)業(yè)大學，山東泰安 271018；2.中國動物衛(wèi)生與流行病學中心，山東青島 266114）

鸚鵡幼雛病（budgerigar fledgling disease，BFD）是由禽類多瘤病毒（avian polyomavirus，APV），早期稱為鸚鵡幼雛病病毒（budgerigar fledgling disease virus，BFDV）引起的多種鸚鵡幼雛死亡的急性病毒性傳染病，主要感染出殼1～3 周的鸚鵡，表現(xiàn)為厭食、消瘦、皮下出血、腹瀉和呼吸困難等癥狀，死亡率可高達80%，并可感染其他多種禽類[1-2]。日齡較小的虎皮鸚鵡（budgerigar，Melopsittacus undulatus）感染APV 時常被稱為“法國蛻皮（French molt）病”[3]。該病1981 年首次報道于美國和加拿大[4-5]，隨后迅速蔓延到日本、意大利、德國和匈牙利等國家[2，6]。1994 年我國湖北省云夢縣和山東省青島市首次報道發(fā)生BFD[7-11]。此后，該病在我國飼養(yǎng)鸚鵡較多的許多省市廣泛傳播，如湖北、山東、廣東等，給我國伴侶鳥貿(mào)易和鸚鵡養(yǎng)殖業(yè)造成較大經(jīng)濟損失。

APV 屬于多瘤病毒科（Polyom aviridae）多瘤病毒屬（Polyom avirus），是一種無囊膜的雙鏈DNA 病毒，病毒粒子直徑為40～50 mm[4，12]，大小約為5 kb[13]。APV 基因組分為早期、晚期基因編碼區(qū)及非編碼區(qū)。早期編碼區(qū)編碼1 個大腫瘤抗原（大T 抗原）和1 個小腫瘤抗原（小t 抗原）；晚期編碼區(qū)編碼主要結(jié)構(gòu)蛋白VP1 和3 個次要結(jié)構(gòu)蛋白VP2、VP3 和VP4。VP1 蛋白是主要的保護性抗原，而3 個次要蛋白也存在于病毒衣殼中[13-14]。APV 非編碼區(qū)可能含有復制起始位點和早期及晚期啟動增強序列。

目前，該病主要根據(jù)臨床表現(xiàn)和組織學觀察作出初步診斷，而確診需要進行電鏡觀察、病毒中和試驗或PCR 檢測。但現(xiàn)有的檢測方法都存在一定的局限性及非特異性。為提高分子生物學方法檢測APV 的敏感性和特異性，本研究通過用地高辛（digoxinum，DIG）標記核酸探針，建立了一種快速、靈敏、特異的APV 檢測方法，并對鑒定陽性的APV 進行了完整的基因組測序以及遺傳特性和進化程度分析。

1 材料與方法

1.1 病毒和病料

APV 參考株：由山東農(nóng)業(yè)大學家禽腫瘤病實驗室鑒定、保存。病料：收集山東省某鸚鵡養(yǎng)殖場病死虎皮鸚鵡的肝臟、腎臟、心臟等病料組織，經(jīng)研磨后采用組織基因組DNA 提取試劑盒（OMEGA），按說明書提取細胞總DNA，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 核酸探針制備及靈敏度和特異性檢驗

利用本實驗室保存的APV 參考株VP1基因質(zhì)粒，根據(jù)已經(jīng)發(fā)表的APV 全基因組序列，通過序列比對設計引物（AP-F1：5'-CAGAACATATCGAAATGG-3'；AP-R1：5'-TGCAGATATCAAGACTGCC-3'），由上海生物工程有限公司合成探針。按照羅氏公司PCR DIG Probe Synthesis Kit 說明書，合成針對APV 的DIG標記核酸檢測探針。將定量好的陽性參考株核酸梯度稀釋至103、102、101、100、10-1pg/μL，按照文獻[14]方法進行核酸斑點雜交，對制備的探針進行靈敏度檢測，同時與普通PCR 進行敏感性比較。

將本實驗室分離鑒定和制備保存的禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組增生癥病毒（REV）cDNA、雞馬立克氏病病毒（MDV）DNA、雞傳染性貧血病毒（CIAV）DNA、禽白血病病毒（ALV）cDNA、雞呼腸孤病毒（ARV）cDNA、雞傳染性支氣管炎病毒（IBV）cDNA、鸚鵡喙羽病病毒（PBDFV）DNA，使用所制備探針，按照文獻[14]方法進行核酸斑點雜交，對制備探針進行特異性檢測。

1.3 鸚鵡病料APV 核酸檢測

參照已發(fā)表的APV 全基因組序列[15]，通過序列比對，設計合成用于檢測APV 的引物（AP-F：5'-GAACATATCGAAATG-3'；AP-R：5'-CAGATATCAAGACTG-3'）。取2.0 μL 待檢病料所提取DNA 模板，加入23.0 μL 的PCR 混合液：2.5 μL 10×PCR buffer，2.5 μL dNTP（2.5 mmol/L），引物AP-F、AP-R（10 μmol/L）各1.0 μL，0.7 μLTaqDNA Polymerase（3.5 U/μL），加雙蒸水至23.0 μL。PCR 反應條件為：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸50 s，共31 個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。取2.0 μL 上述PCR 產(chǎn)物點樣于尼龍膜上，按照文獻[15]方法，使用制備探針進行核酸斑點雜交檢測。

1.4 陽性樣品APV 全基因組克隆測序和序列分析

取斑點雜交檢測為陽性的病料組織基因組DNA，參考已發(fā)表的APV 全基因組序列[15]，設計合成2 對引物（表1），分段擴增2 段相互重疊的片段，用于陽性樣品APV 的全基因組克隆測序。按TaKaRa ExTaq酶試劑盒（TaKaRa，Code No.RR001A）使用說明，用這2 對引物分別進行PCR擴增。PCR 擴增產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖電泳鑒定并將目的條帶切下，然后使用E.Z.N.A Gel Extraction Kit（OMEGA，USA）回收純化DNA；將純化的DNA 連接到PMD-18T Vector（TaKaRa，Japan）后，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)細胞DH5α；挑取單個菌落以Plasmid Mini Kit（OMEGA，USA）提取質(zhì)粒進行酶切鑒定，陽性克隆送上海生工生物工程有限公司測序。

表1 用于擴增APV 全基因組序列的引物

1.5 序列比對和遺傳進化分析

使用DNAstar 軟件，將分別測序的兩段核苷酸序列進行拼接以獲得病毒的全基因組序列，將其與GenBank中已發(fā)表的代表性APV參考序列（表2）進行全基因組序列比對，分析分離毒株與不同參考毒株間的核苷酸同源性，并繪制分子遺傳進化樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 VP1 基因PCR 擴增和探針標記

以APV-VP1 質(zhì)粒為模板，用AP-F1 和AP-R1引物擴增VP1基因片段，結(jié)果出現(xiàn)與預期相符的731 bp 目的條帶。標記的探針從電泳圖譜上看，明顯滯后于普通dNTP 擴增產(chǎn)物條帶（因帶有DIG標記的dNTP 分子質(zhì)量較大，導致電泳速度較低），說明標記成功（圖1）。

表2 用于繪制APV 毒株分子遺傳進化樹的參考株

圖1 APV 探針標記結(jié)果

2.2 核酸探針靈敏性檢測

將APV 陽性對照核酸倍比稀釋至103、102、101、100、10-1pg/μL，分別取2 μL 點樣在尼龍膜上，使用制備的APV 核酸探針進行斑點雜交。由圖2可見，APV 特異性核酸片段為2×103～2×100pg的量時，核酸顯色，呈陽性反應；APV 特異性核酸片段為2×10-1pg 的量時及陰性對照，核酸均不顯色，呈陰性反應。敏感性統(tǒng)計結(jié)果見表3。由圖3 可見，當APV 特異性核酸片段在2×105～2×101pg的量時，PCR 電泳結(jié)果呈陽性反應；而APV 特異性核酸片段為2 pg 量時及陰性對照核酸，PCR 電泳結(jié)果呈陰性反應。結(jié)果表明，該探針可檢測到2 pg 量的APV 特異性核酸片段，且本檢測方法較普通的PCR 檢測方法具有更好的敏感性。

圖2 APV 核酸探針靈敏性檢測結(jié)果

表3 APV-VP1 探針的靈敏性檢測信號強度統(tǒng)計

圖3 PCR 靈敏性檢測結(jié)果

2.3 核酸探針特異性檢測

將已知背景的REV-DNA、MDV-DNA、CIAV-DNA、ALV-DNA、ARV-DNA、IBV-DNA、PBFDV-DNA 以及APV-VP1 陰性核酸、陽性核酸分別點樣在尼龍膜上，使用制備的APV 核酸探針進行斑點雜交。由圖4 可見，僅有APV-VP1 陽性核酸顯色，呈現(xiàn)陽性反應，而陰性核酸和REV、MDV、CIAV、ALV、ARV、IBV 以及PBFDV 的DNA 均不顯色，呈陰性反應，表明合成的核酸探針特異性強，僅識別APV 陽性核酸而不識別其他非APV 核酸成分。

圖4 APV 探針的特異性檢測結(jié)果

2.4 核酸探針病料檢測

對收集的8 份病死鸚鵡肝臟、腎臟、心臟等病料組織提取的DNA，用本研究建立的方法進行檢測，檢出2 份陽性（圖5），均來自肝臟樣品。

圖5 臨床病料樣品PCR 產(chǎn)物斑點雜交檢測結(jié)果

2.5 陽性樣品APV 全基因組序列測定與進化分析

利用DNAstar 軟件，對2 個陽性樣品的PCR片段進行了APV 全基因組核苷酸序列測定，并分別命名為APV-SD03 株和APV-SD05 株，全長分別為5 952 bp 和5 956 bp。將序列提交到GenBank，獲得的序列號分別是MH712455 和MH712456。

BLAST 和DNAstar 軟件分析結(jié)果顯示，本研究所得到的APV-SD03 株和APV-SD05 株序列與GenBank 中已發(fā)表的25 株APV 分離株全基因組序列同源性為99.3%～99.7%。序列比對結(jié)果顯示，APV-SD03 株共有17 個核苷酸位點的改變，APVSD05 株共有18 個核苷酸位點的改變。統(tǒng)計不同基因組區(qū)域堿基變異情況可見，2 株毒株均在大T 抗原區(qū)發(fā)生了最高的變異率，且APV-SD05 株在T/t抗原區(qū)，4 724 位置處有1 個核苷酸替換，并引起了氨基酸V →A 的改變。

對GenBank 收錄的25 個APV 全序列以及APV-SD03 株和APV-SD05 株序列，使用MEGA 5.0 軟件繪制以全基因組核苷酸序列為基礎的APV毒株分子遺傳進化樹（圖6）。在該進化樹中，可以將其劃分為Ⅰ—Ⅳ家系：家系Ⅰ分離株的地理范圍包括美洲、歐洲以及亞洲，其中5 株從雞分離到，而其他的則從鳥分離到；家系Ⅱ主要為亞洲的日本分離株和中國分離株，都從鳥分離到；家系Ⅲ為單獨的大分枝；家系Ⅳ包含了澳洲的新西蘭分離株、美國分離株以及2012 年的中國高密分離株，也都從鳥分離到。從進化樹推測，分離毒株在物種的特異性上存在一點關系，而在地理分布上沒有明顯關聯(lián)。在該研究中，APV-SD03 株和APV-SD05 株位于家系Ⅱ的同一支上，表明兩分離株基因組之間在流行病學上相關聯(lián)；該家系中其他分離株的宿主都是鳥類，且只有FJ385773、APV-SD03 株、APVSD05 株為中國分離株，其他4 株均為日本分離株，可以看出其與日本分離株之間有較近的親緣關系。2012 年中國高密分離的WF-GM01 株位于家系Ⅳ中，而APV-SD03 株、APV-SD05 株與其基因組序列進行比對后發(fā)現(xiàn)有部分氨基酸的突變，從而導致了上述幾株毒株不在一個分支上。

圖6 APV 毒株分子遺傳進化樹

3 討論

APV 是引起鸚鵡類（種、群）發(fā)生高死亡率的急性病毒性傳染病病原。20 世紀80 年代初，此病首先在美國和加拿大被報道，隨后相繼在日本、意大利、匈牙利等國家出現(xiàn)。我國首次于1994 年報道該病流行[4-10]。2002—2005 年，有研究[16]證實，我國臺灣鸚鵡中存在APV。2008 年后，國內(nèi)多家寵物鸚鵡養(yǎng)殖場連續(xù)暴發(fā)由APV 引起的BFD，給我國養(yǎng)鳥業(yè)帶來重大損失[17]。還有研究[19]顯示，不同基因型的APV 在我國共同流行[18]。至今，BFD 仍在我國某些地區(qū)散發(fā)流行。目前，對于本病的防治尚無較好的控制手段。

目前，APV 核酸檢測主要基于建立的PCR 法。該方法雖靈敏度高，但有時會出現(xiàn)非特異性反應，一般需要將PCR 產(chǎn)物回收后連接到相應載體上，經(jīng)過測序才可作出最終判斷，這就大大增加了檢測的時間和成本。因此，亟需建立一種更加快速、準確、易操作的檢測方法。DIG 標記DNA 探針雜交檢測法具有特異性強、靈敏性高、操作方便、檢測時間短、性質(zhì)穩(wěn)定等優(yōu)點，是目前常用的分子生物學診斷技術。本研究建立了一種針對APV 的特異性核酸探針斑點雜交檢測方法，并通過相應試驗驗證了其可以檢測到2 pg 量的APV 核酸，且只對APV 核酸呈現(xiàn)陽性反應，而對REV、MDV、CIAV、ALV、ARV、IBV 以及PBFDV 的DNA 均呈現(xiàn)陰性反應，證明該APV 的核酸探針斑點雜交檢測方法具有較高的靈敏度和較強的特異性。

本研究利用制備探針對發(fā)病鸚鵡病料進行APV 檢測，共檢出2 份陽性樣品，并對其進行了全基因組序列測定及遺傳進化分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)2 株毒株與國內(nèi)外已發(fā)表的25 株APV 全基因組核苷酸同源性高度一致，為99.3%～99.7%。該序列分析結(jié)果也與之前Rott 等[20]、Phalen 等[21]和Johne等[22]研究報道的結(jié)果一致。APV 序列分子結(jié)構(gòu)方面，通過序列比對，分析其堿基變異情況，可知T抗原變異率最高，推測這可能與APV 的宿主范圍廣泛有關。APV 全基因組序列繪制的遺傳進化樹顯示，27 株APV 共劃分為Ⅰ—Ⅳ家系。本研究的APV-SD03 株和APV-SD05 株都位于Ⅱ家系的同一分枝上，表明兩分離株在流行病學上相關聯(lián)。從整體進化樹可推測，分離毒株在種屬特異性上存在一點關系，而在地理位置間沒有顯著關系。

我國是一個候鳥遷移和家禽養(yǎng)殖大國，因此有效控制鳥類的APV 感染非常重要。本研究建立了一種靈敏度更高、特異性更強的PCR 產(chǎn)物斑點雜交檢測方法，并對鑒定陽性的毒株進行全基因組序列測定及遺傳進化分析，從而加深了對APV 進化途徑的了解，對于預防和控制APV 感染具有重要意義。