顏友榮，方向紅，魏 寧，肖 寧

（江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院，江蘇 泰州 225300）

豬圓環(huán)病毒（PCV）自20 世紀(jì)70 年代被發(fā)現(xiàn)以來(lái)，已在全世界廣泛傳播，對(duì)養(yǎng)豬事業(yè)造成巨大影響[1]。PCV-2有較強(qiáng)的致病性[2-3]，在我國(guó)斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征對(duì)豬致病性較明顯且影響較大[4]。隨著國(guó)產(chǎn)PCV-2 滅活苗的推廣應(yīng)用，該病發(fā)病率呈明顯下降趨勢(shì)，但仍有部分地區(qū)有PCV-2感染的報(bào)道[5-6]。為了解蘇中地區(qū)PCV-2感染情況及疫苗免疫效果，本研究對(duì)2020 年9～12 月期間收集到的蘇中地區(qū)15家豬場(chǎng)的363樣本進(jìn)行檢測(cè)，以期為蘇中地區(qū)不同規(guī)模豬場(chǎng)防控PCV-2提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 樣本采集（見(jiàn)表1）

2020 年9～12 月期間，根據(jù)養(yǎng)殖規(guī)模在蘇中地區(qū)選擇15 個(gè)均免疫接種過(guò)PCV-2 滅活苗的豬場(chǎng)，其中大型豬場(chǎng)4個(gè)（存欄量≥5 000頭）、中型豬場(chǎng)5個(gè)（存欄量1 000～5 000頭）、小型豬場(chǎng)6 個(gè)（存欄量≤1 000 頭）。根據(jù)豬場(chǎng)實(shí)際情況，共采集363份血清樣本與363份疑似PCV2病料組織樣本，-20 ℃保存。樣本具體數(shù)量見(jiàn)表1。

表1 蘇中地區(qū)不同規(guī)模豬場(chǎng)樣本采集數(shù)量Tab.1 Number of samples collected from different pig farm in Central Jiangsu

1.1.2 試劑與耗材

基因組DNA 提取試劑盒、DNA 膠回收試劑盒、Taq DNA 聚 合 酶、6×DNA Loading Dye、10×PCR Buffer、dNTPMix、25 mmol/L MgCl2等，均購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司；pMD18-T 載體，購(gòu)自上海寶生物工程有限公司；ELISA試劑盒，購(gòu)自瑞普生物藥業(yè)有限公司。

1.1.3 試驗(yàn)儀器

普通PCR 儀（Thermo 公司，TCA5020）、熒光定量PCR循環(huán)儀（ABI 公司，7500）、分析天平（Sartorius 公司）、全自動(dòng)樣本快速研磨儀（上海凈信實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司）、臺(tái)式冷凍微量高速離心機(jī)（Thermo 公司，Micro7R）、移液器（Thermo 公司，F(xiàn)innpipette F）、多功能酶標(biāo)儀（Molecular Devices公司）等。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 熒光定量PCR抗原檢測(cè)方法

豬病料樣本檢測(cè)采用熒光定量PCR 法，按照病毒DNA 提取試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。參考引物序列文獻(xiàn)[7]，利用美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心引物設(shè)計(jì)軟件進(jìn)行設(shè)計(jì)，委托蘇州金唯智科技有限公司合成PCV2 特異性引物，使用變性聚丙烯酰胺凝膠電泳對(duì)引物進(jìn)行純化。

Pig-GAPDH-F：5'-TCGGAGTGAACGGATTTGGC-3'；Pig-GAPDH-R：5'-TGACAAGCTTCCCGTTCTCC-3'。

熒光定量PCR 反應(yīng)體系（20 μL）：2X Real time PCR Master Mix（SYBR Green）10 μL、模板1 μL（cDNA 稀釋10 倍）、引物MIX（F/R 各為10 μmol/L）2 μL、0.1%DEPC水7 μL。

熒光定量PCR 反應(yīng)條件：94 ℃變性30 s，55 ℃復(fù)性30 s，72 ℃延伸60 s，共30個(gè)循環(huán)；擴(kuò)增結(jié)束取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳，產(chǎn)物大小為1 767 bp。

1.2.2 間接ELISA抗體檢測(cè)方法[8]

采用間接ELISA 法檢測(cè)豬血清樣本中的PCV2 抗體[9-10]。具體操作分為4 個(gè)步驟：向每個(gè)ELISA 板孔中加入100 μL 特異性抗原，37 ℃溫育1 h，4 ℃保存16 h，洗滌去除未結(jié)合的抗原；取100倍稀釋血清樣本與陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照各100 μL，分別加入ELISA板孔中，37 ℃孵育1 h，洗滌并除去游離物；ELISA板的每個(gè)孔中再加入100 μL酶標(biāo)抗體，37 ℃孵育1 h，洗滌并去除未反應(yīng)的酶標(biāo)抗體；每孔添加100 μL 底物，15 min 后添加50 μL 終止液，30 min后用微孔板閱讀器觀察顯色結(jié)果。通過(guò)顯色結(jié)果定性判斷豬血清樣本PCV2抗體情況，定量分析抗體數(shù)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 蘇中地區(qū)豬病料病原學(xué)檢測(cè)結(jié)果（見(jiàn)表2、表3）

表2 蘇中地區(qū)不同規(guī)模豬場(chǎng)豬病料病原學(xué)檢測(cè)結(jié)果Tab.2 Etiological results of diseased feed from different pig farm in Central Jiangsu

表3 蘇中地區(qū)不同年齡段豬病料病原學(xué)檢測(cè)結(jié)果Tab.3 Etiological results of pig disease feeds of different age in Central Jiangsu

由表2 可知，豬病料樣本PCV2 陽(yáng)性率為10.7%，其中大、中、小型豬場(chǎng)病料PCV2 陽(yáng)性率分別為4.9%、7.1%、18.8%。

由表3 可知，仔豬、母豬、育肥豬組織病料PCV2 陽(yáng)性率分別為2.3%、9.4%、16.9%。

2.2 蘇中地區(qū)豬血清學(xué)檢測(cè)結(jié)果（見(jiàn)表4、表5）

表4 蘇中地區(qū)不同規(guī)模豬場(chǎng)血清學(xué)檢測(cè)結(jié)果Tab.4 Serological results of pig farms of different sizes in Central Jiangsu

表5 蘇中地區(qū)不同年齡段豬血清學(xué)檢測(cè)結(jié)果Tab.5 Serological results of pigs of different age in Central Jiangsu

由表4 可知，363 份豬血清樣本通過(guò)間接ELISA 抗體檢測(cè)，其中328 份PCV2 抗體檢測(cè)呈陽(yáng)性，陽(yáng)性率達(dá)到90.4%。大、中、小型豬場(chǎng)PCV2抗體陽(yáng)性率分別為94.1%、89.6%、88.2%。

由表5 可知，仔豬、母豬、育肥豬血清樣本PCV2 抗體陽(yáng)性率分別為80.0%、92.6%、95.1%，育肥豬PCV2 抗體陽(yáng)性比例最高，仔豬最低。

3 討論

結(jié)果表明，蘇中地區(qū)的豬場(chǎng)有少數(shù)豬感染PCV2，小型豬場(chǎng)感染陽(yáng)性率最高，大型豬場(chǎng)感染陽(yáng)性率最低，這可能與豬場(chǎng)管理規(guī)范程度、生物安全防控水平以及疫苗免疫程序有密切關(guān)系[11]。一般情況下，無(wú)論是否免疫PCV2疫苗，8～10 周齡左右豬體內(nèi)的PCV2 抗體處于最低值[12]，期間極易感染病毒，因此育肥豬感染率最高比較合理；仔豬感染率最低，可能與獲得母豬的母源抗體有一定的關(guān)系。通過(guò)血清學(xué)抗體檢測(cè)，免疫接種過(guò)PCV-2滅活苗的豬抗體陽(yáng)性率超過(guò)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部規(guī)定的最低70%免疫合格標(biāo)準(zhǔn)[13]，說(shuō)明豬群免疫效果較好，但不能區(qū)分是感染陽(yáng)性還是免疫陽(yáng)性。PCV2 能引起豬群發(fā)病或隱性感染，使豬群免疫受到抑制，降低豬群免疫力和疫苗的免疫效果[14]，因此全部接種PCV2 疫苗的豬群抗體陽(yáng)性率并未達(dá)到100%。由本試驗(yàn)結(jié)果可知，極少數(shù)豬體內(nèi)PCV2病原與抗體同時(shí)存在[15]，疫苗產(chǎn)生的特異性免疫抗體并不能完全消除豬體內(nèi)的PCV2病原。

4 結(jié)論

通過(guò)對(duì)豬圓環(huán)病毒2 型感染情況及免疫效果調(diào)查，蘇中地區(qū)豬群通過(guò)疫苗預(yù)防并未達(dá)到理想的效果，仍少量豬群感染。做好常規(guī)免疫工作的同時(shí)，還要做好生物安全措施，提高飼養(yǎng)管理水平。