顏友榮，方向紅，魏 寧，肖 寧

（江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院，江蘇 泰州 225300）

豬圓環(huán)病毒（PCV）自20 世紀(jì)70 年代被發(fā)現(xiàn)以來，已在全世界廣泛傳播，對養(yǎng)豬事業(yè)造成巨大影響[1]。PCV-2有較強(qiáng)的致病性[2-3]，在我國斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征對豬致病性較明顯且影響較大[4]。隨著國產(chǎn)PCV-2 滅活苗的推廣應(yīng)用，該病發(fā)病率呈明顯下降趨勢，但仍有部分地區(qū)有PCV-2感染的報道[5-6]。為了解蘇中地區(qū)PCV-2感染情況及疫苗免疫效果，本研究對2020 年9～12 月期間收集到的蘇中地區(qū)15家豬場的363樣本進(jìn)行檢測，以期為蘇中地區(qū)不同規(guī)模豬場防控PCV-2提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 樣本采集（見表1）

2020 年9～12 月期間，根據(jù)養(yǎng)殖規(guī)模在蘇中地區(qū)選擇15 個均免疫接種過PCV-2 滅活苗的豬場，其中大型豬場4個（存欄量≥5 000頭）、中型豬場5個（存欄量1 000～5 000頭）、小型豬場6 個（存欄量≤1 000 頭）。根據(jù)豬場實際情況，共采集363份血清樣本與363份疑似PCV2病料組織樣本，-20 ℃保存。樣本具體數(shù)量見表1。

表1 蘇中地區(qū)不同規(guī)模豬場樣本采集數(shù)量Tab.1 Number of samples collected from different pig farm in Central Jiangsu

1.1.2 試劑與耗材

基因組DNA 提取試劑盒、DNA 膠回收試劑盒、Taq DNA 聚 合 酶、6×DNA Loading Dye、10×PCR Buffer、dNTPMix、25 mmol/L MgCl2等，均購自生工生物工程（上海）股份有限公司；pMD18-T 載體，購自上海寶生物工程有限公司；ELISA試劑盒，購自瑞普生物藥業(yè)有限公司。

1.1.3 試驗儀器

普通PCR 儀（Thermo 公司，TCA5020）、熒光定量PCR循環(huán)儀（ABI 公司，7500）、分析天平（Sartorius 公司）、全自動樣本快速研磨儀（上海凈信實業(yè)發(fā)展有限公司）、臺式冷凍微量高速離心機(jī)（Thermo 公司，Micro7R）、移液器（Thermo 公司，F(xiàn)innpipette F）、多功能酶標(biāo)儀（Molecular Devices公司）等。

1.2 試驗方法

1.2.1 熒光定量PCR抗原檢測方法

豬病料樣本檢測采用熒光定量PCR 法，按照病毒DNA 提取試劑盒說明書操作，進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。參考引物序列文獻(xiàn)[7]，利用美國國家生物技術(shù)信息中心引物設(shè)計軟件進(jìn)行設(shè)計，委托蘇州金唯智科技有限公司合成PCV2 特異性引物，使用變性聚丙烯酰胺凝膠電泳對引物進(jìn)行純化。

Pig-GAPDH-F：5'-TCGGAGTGAACGGATTTGGC-3'；Pig-GAPDH-R：5'-TGACAAGCTTCCCGTTCTCC-3'。

熒光定量PCR 反應(yīng)體系（20 μL）：2X Real time PCR Master Mix（SYBR Green）10 μL、模板1 μL（cDNA 稀釋10 倍）、引物MIX（F/R 各為10 μmol/L）2 μL、0.1%DEPC水7 μL。

熒光定量PCR 反應(yīng)條件：94 ℃變性30 s，55 ℃復(fù)性30 s，72 ℃延伸60 s，共30個循環(huán)；擴(kuò)增結(jié)束取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳，產(chǎn)物大小為1 767 bp。

1.2.2 間接ELISA抗體檢測方法[8]

采用間接ELISA 法檢測豬血清樣本中的PCV2 抗體[9-10]。具體操作分為4 個步驟：向每個ELISA 板孔中加入100 μL 特異性抗原，37 ℃溫育1 h，4 ℃保存16 h，洗滌去除未結(jié)合的抗原；取100倍稀釋血清樣本與陽性對照、陰性對照各100 μL，分別加入ELISA板孔中，37 ℃孵育1 h，洗滌并除去游離物；ELISA板的每個孔中再加入100 μL酶標(biāo)抗體，37 ℃孵育1 h，洗滌并去除未反應(yīng)的酶標(biāo)抗體；每孔添加100 μL 底物，15 min 后添加50 μL 終止液，30 min后用微孔板閱讀器觀察顯色結(jié)果。通過顯色結(jié)果定性判斷豬血清樣本PCV2抗體情況，定量分析抗體數(shù)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 蘇中地區(qū)豬病料病原學(xué)檢測結(jié)果（見表2、表3）

表2 蘇中地區(qū)不同規(guī)模豬場豬病料病原學(xué)檢測結(jié)果Tab.2 Etiological results of diseased feed from different pig farm in Central Jiangsu

表3 蘇中地區(qū)不同年齡段豬病料病原學(xué)檢測結(jié)果Tab.3 Etiological results of pig disease feeds of different age in Central Jiangsu

由表2 可知，豬病料樣本PCV2 陽性率為10.7%，其中大、中、小型豬場病料PCV2 陽性率分別為4.9%、7.1%、18.8%。

由表3 可知，仔豬、母豬、育肥豬組織病料PCV2 陽性率分別為2.3%、9.4%、16.9%。

2.2 蘇中地區(qū)豬血清學(xué)檢測結(jié)果（見表4、表5）

表4 蘇中地區(qū)不同規(guī)模豬場血清學(xué)檢測結(jié)果Tab.4 Serological results of pig farms of different sizes in Central Jiangsu

表5 蘇中地區(qū)不同年齡段豬血清學(xué)檢測結(jié)果Tab.5 Serological results of pigs of different age in Central Jiangsu

由表4 可知，363 份豬血清樣本通過間接ELISA 抗體檢測，其中328 份PCV2 抗體檢測呈陽性，陽性率達(dá)到90.4%。大、中、小型豬場PCV2抗體陽性率分別為94.1%、89.6%、88.2%。

由表5 可知，仔豬、母豬、育肥豬血清樣本PCV2 抗體陽性率分別為80.0%、92.6%、95.1%，育肥豬PCV2 抗體陽性比例最高，仔豬最低。

3 討論

結(jié)果表明，蘇中地區(qū)的豬場有少數(shù)豬感染PCV2，小型豬場感染陽性率最高，大型豬場感染陽性率最低，這可能與豬場管理規(guī)范程度、生物安全防控水平以及疫苗免疫程序有密切關(guān)系[11]。一般情況下，無論是否免疫PCV2疫苗，8～10 周齡左右豬體內(nèi)的PCV2 抗體處于最低值[12]，期間極易感染病毒，因此育肥豬感染率最高比較合理；仔豬感染率最低，可能與獲得母豬的母源抗體有一定的關(guān)系。通過血清學(xué)抗體檢測，免疫接種過PCV-2滅活苗的豬抗體陽性率超過農(nóng)業(yè)農(nóng)村部規(guī)定的最低70%免疫合格標(biāo)準(zhǔn)[13]，說明豬群免疫效果較好，但不能區(qū)分是感染陽性還是免疫陽性。PCV2 能引起豬群發(fā)病或隱性感染，使豬群免疫受到抑制，降低豬群免疫力和疫苗的免疫效果[14]，因此全部接種PCV2 疫苗的豬群抗體陽性率并未達(dá)到100%。由本試驗結(jié)果可知，極少數(shù)豬體內(nèi)PCV2病原與抗體同時存在[15]，疫苗產(chǎn)生的特異性免疫抗體并不能完全消除豬體內(nèi)的PCV2病原。

4 結(jié)論

通過對豬圓環(huán)病毒2 型感染情況及免疫效果調(diào)查，蘇中地區(qū)豬群通過疫苗預(yù)防并未達(dá)到理想的效果，仍少量豬群感染。做好常規(guī)免疫工作的同時，還要做好生物安全措施，提高飼養(yǎng)管理水平。