陳生雷，王一平，谷崇高，陳欣婷，李鳳艷，舒秀偉

（遼寧益康生物股份有限公司，遼寧 遼陽 111000）

重組禽流感病毒（H5+H7）三價(jià)滅活疫苗（H5N1Re-11株+Re-12株、H7N9H7-Re3株）可預(yù)防由H5亞型2.3.4.4d分支、2.3.2.1d 分支和H7亞型禽流感病毒引起的禽流感[1-3]，多應(yīng)用于雛雞和成雞的免疫，具有免疫效果好、安全性高的特點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于雞養(yǎng)殖生產(chǎn)[4-6]。免疫佐劑是一種能夠強(qiáng)化疫苗抗體生成的物質(zhì)[7]。免疫佐劑與疫苗同時(shí)使用可以提高疫苗的免疫應(yīng)答率[8]。在實(shí)際疫苗免疫中，因?yàn)閯?dòng)物個(gè)體差異造成動(dòng)物免疫效果不理想，重復(fù)接種工作煩瑣，成本較高[9]。為一次性獲得免疫應(yīng)答效果，研究人員不斷研究增加疫苗免疫應(yīng)答率的方法。其中使用免疫佐劑是目前最有效的實(shí)現(xiàn)疫苗免疫增強(qiáng)的方式[10-12]。本試驗(yàn)采用不同抗原含量配比并添加免疫佐劑，通過效力檢驗(yàn)了解免疫佐劑對禽流感抗體產(chǎn)生的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

28日齡SPF雞由遼寧益康生物股份有限公司提供。

1.2 試驗(yàn)材料

禽流感H5N1Re-11株滅活抗原、H5N1Re-12株滅活抗原、H7N9H7-Re3株滅活抗原，均由遼寧益康生物股份有限公司制備檢驗(yàn)。白油（大連百潤祥經(jīng)貿(mào)有限公司，批號688826）、吐溫（CRODA 公司，批號46389）、司本（CRODA公司，批號45278）。免疫佐劑（Ⅱ）由遼寧益康生物股份有限公司制備，檢驗(yàn)。

1.3 試劑與儀器

禽流感病毒H5亞型陽性血清（Re-11株）、禽流感病毒H5亞型陽性血清（Re-12株）、禽流感病毒H7亞型陽性血清（H7-Re3 株）、禽流感病毒H5亞型血凝抑制試驗(yàn)抗原（Re-11 株）、禽流感病毒H5亞型血凝抑制試驗(yàn)抗原（Re-12 株）和禽流感病毒H7亞型血凝抑制試驗(yàn)抗原（H7-Re3 株），均由遼寧益康生物股份有限公司提供。

T25高速剪切機(jī)（IKA公司）、BSC-1304IIA2生物安全柜（北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司）、3k15高速冷凍離心機(jī)（Sigma公司）。

1.4 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

取95 份注射白油加熱，加入5 份司本-80，混勻，高壓滅菌。94 份含定量免疫佐劑（Ⅱ）的抗原加入6 份滅菌吐溫-80，充分振蕩使吐溫-80完全溶解。乳化罐中加入3份油相與2份水相，充分?jǐn)嚢枞榛?～8 ℃保存。

將禽流感的3 種抗原按不同抗原含量添加免疫佐劑（Ⅱ）配苗乳化，分別為：A組抗原含量為30%，不添加免疫佐劑，設(shè)為對照組；B 組抗原含量為30%，添加免疫佐劑（Ⅱ）；C 組抗原含量為25%，添加免疫佐劑（Ⅱ）；D 組抗原含量為20%，添加免疫佐劑（Ⅱ）；E 組抗原含量為15%，添加免疫佐劑（Ⅱ）；F 組為不免疫對照組。按乳化試驗(yàn)方法進(jìn)行成品疫苗的配制，各分組分別制備300 mL成品疫苗。成品疫苗配制方案見表1。對28 日齡SPF 雞進(jìn)行疫苗免疫，劑量為0.3 mL/只。

表1 成品疫苗配制方案Tab.1 Finished vaccine formulation program

1.5 測定指標(biāo)及方法

分別于免疫后7、14、21 d 對雞靜脈采血，37 ℃孵育1 h，6 000 r/min 離心3 min，分離血清，-20 ℃保存。采用HI 方法測定禽流感H5亞型Re-11 株和Re-12 株、禽流感H7亞型H7Re-3株HI抗體效價(jià)，標(biāo)定抗原為4單位抗原。

2 結(jié)果與分析

2.1 HI抗體平均值（見表2）

由表2 可知，作為不免疫對照組的F 組，抗體效價(jià)至21 d 仍小于1.0，表明免疫成功。免后7、14 d，B 組H5亞型和H7亞型HI抗體均高于其他試驗(yàn)組；免后21 d，D、E組HI抗體效價(jià)效果較好，均不低于B、C 組。結(jié)果表明，免疫佐劑對抗體提升具有一定效果。

2.2 H5 亞型（Re-11 株）HI 不同組抗體變化檢測結(jié)果（見表2）

由表2可知，免后7、14 d，B組的禽流感H5亞型Re-11株的HI 抗體結(jié)果高于其他組；免后21 d，與A 組相比，B組、C組、D組和E組HI抗體效價(jià)均高約1.5～1.9個(gè)滴度。

2.3 H5 亞型（Re-12 株）HI 不同組抗體檢測測定結(jié)果（見表2）

由表2 可知，免后7 d，B 組禽流感H5亞型Re-12 株的HI抗體結(jié)果高于其他組；免后14 d，B組、C組和D組的HI抗體結(jié)果均略高于E組；免后21 d，與A組相比，B組、C組、D組和E組HI抗體效價(jià)均高約1.5～1.7個(gè)滴度。

2.4 H7 亞型（Re3 株）HI 不同組抗體變化檢測結(jié)果（見表2）

由表2可知，免后7、14、21 d，B組、C組、D組和E組H7亞型Re-3株的HI抗體無顯著差異；21 d結(jié)果顯示，各組HI抗體值在8.9～9.3之間，較A組高約0.9～1.3個(gè)滴度。

表2 HI抗體平均值（1∶X）Tab.2 Average value of HI antibody(1∶X)

3 討論

重組禽流感病毒滅活疫苗為強(qiáng)制免疫疫苗品種[13]，廣泛應(yīng)用于蛋雞、肉雞和水禽等免疫，通過疫苗的免疫產(chǎn)生較高的抗體，從而達(dá)到對高致病性禽流感的預(yù)防作用[14-15]。如何能夠及時(shí)有效地產(chǎn)生和提升抗體，成為各企業(yè)和科研單位的公關(guān)方向。免疫佐劑是一類通過非特異性途徑提高機(jī)體對抗原或微生物特異性反應(yīng)的物質(zhì)[16-17]。本試驗(yàn)通過應(yīng)用相同含量抗原和不同含量抗原添加免疫佐劑制備禽流感疫苗進(jìn)行效力檢驗(yàn)，結(jié)果表明，30%抗原含量添加免疫佐劑組（B 組）在免疫后7、14 d 的HI 抗體效價(jià)略高于抗原含量低或未添加免疫佐劑的組別；免后21 d，添加免疫佐劑的不同抗原含量各組間HI抗體效價(jià)差異不顯著，并且較30%抗原含量不添加免疫佐劑組（A組）高約0.9～1.9個(gè)滴度。

4 結(jié)論

試驗(yàn)結(jié)果表明，免疫佐劑能夠提高雞群對禽流感疫苗的免疫應(yīng)答效果，降低抗原含量時(shí)還能夠保證21日效力檢驗(yàn)的即時(shí)效價(jià)。由于本試驗(yàn)依據(jù)禽流感效力檢驗(yàn)方法進(jìn)行抗體判定，所以對于免疫佐劑在降低抗原含量使用的情況下是否能夠達(dá)到4個(gè)月的免疫持續(xù)期，并保證抗體效價(jià)在6Log2 以上，仍需進(jìn)一步監(jiān)測跟蹤。同時(shí)，還需對雞群生產(chǎn)性能等指標(biāo)進(jìn)行監(jiān)測，以驗(yàn)證免疫佐劑的安全性。