趙梓岐 倪坤明 付偉偉 丁士剛

北京大學第三醫(yī)院消化科(100183)

胃癌是全球范圍內多發(fā)的惡性腫瘤，早期癥狀隱匿不易發(fā)現、晚期預后相對較差，是嚴重威脅人類健康的疾病之一。流行病學研究[1]顯示，2019年我國胃癌發(fā)病率為43.1/10萬，居全國惡性腫瘤發(fā)病率第2位，死亡率達29.6/10萬，防治形勢較為嚴峻。胃癌是一種多因素導致的疾病，目前已知主要危險因素包括環(huán)境危險因素和個人危險因素，前者包括膳食因素、吸煙、幽門螺桿菌感染、職業(yè)暴露、胃部手術等，后者包括家族易感性、基因多態(tài)性以及胃潰瘍、惡性貧血等疾病。胃癌的一般發(fā)病機制涉及由慢性胃炎發(fā)展至慢性萎縮性胃炎，進而進展為假幽門腺化生、腸化生、異型增生等癌前病變的一系列過程。胃癌發(fā)生的相關分子學機制仍未完全明確，是多年來的研究熱點之一。諸多研究證實，外泌體在包括胃癌在內的多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中扮演著關鍵角色。本文就外泌體及其內容物對胃癌發(fā)生、發(fā)展的作用作一綜述。

一、外泌體的生物學特性

外泌體是直徑為30～150 nm的細胞外囊泡，幾乎所有類型的細胞均可產生，其由包含跨膜蛋白并包裹胞質蛋白、脂質或核酸的脂質雙層組成。最初，外泌體被認為是丟棄細胞中廢物的場所?，F有研究[2]則表明，在生理和病理條件下，外泌體可通過轉運特定的外泌體內容物，如蛋白質、DNA、mRNA、非編碼RNA等，來調節(jié)局部和遠處的細胞通訊。近年諸多研究[3-4]顯示，外泌體是腫瘤發(fā)生、生長、血管形成以及遠處轉移的重要介質，與人類的正常生理穩(wěn)態(tài)和包括癌癥在內的多種疾病密切相關。

外泌體的生物發(fā)生始于質膜的內向出芽，形成含有膜蛋白的早期內含體。隨著內含體內陷和特定蛋白質、核酸的封閉，形成多囊體。此后上述兩種微泡與質膜發(fā)生融合，并向胞外釋放外泌體。多囊體形成的調節(jié)在內體分揀轉運復合體(endosomal sorting complex required for transport, ESCRT)的驅動下完成，ESCRT包括約30種蛋白質，在真核生物中具有保守性。此外，與外泌體形成有關的機制亦有神經酰胺途徑、4次跨膜蛋白途徑等。概括而言，外泌體是一類細胞外信號體，在正常生理環(huán)境中可促進真核細胞間的廣泛生物通訊；而在惡性腫瘤中，此種調節(jié)機制可影響癌細胞的存活和生長[5]。

二、 外泌體影響胃癌發(fā)生、發(fā)展的機制

腫瘤的發(fā)生與腫瘤微環(huán)境有密切聯系，而外泌體可通過多種途徑作用于腫瘤微環(huán)境，進而影響腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。腫瘤微環(huán)境是腫瘤細胞及其周圍正常細胞、基質等的總稱，主要包括腫瘤細胞、T細胞、巨噬細胞等免疫細胞、血管內皮細胞、周細胞、腫瘤相關成纖維細胞(cancer-associated fibro-blasts, CAFs)、脂肪細胞、細胞外基質等[6]。胃癌細胞自身及其所處的腫瘤微環(huán)境內的多種細胞均可產生外泌體，經多種機制促進或抑制胃癌的發(fā)生、發(fā)展。

1. 調節(jié)腫瘤細胞生長增殖：CAFs是腫瘤微環(huán)境的重要組成部分，可通過分泌成纖維細胞活化蛋白、α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)等為腫瘤細胞創(chuàng)造適宜的增殖環(huán)境，從而促進腫瘤轉移和血管生成。CAFs的來源主要包括組織內原有成纖維細胞、間質干細胞分化以及上皮-間質轉化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)。胃癌細胞源性外泌體可誘導胃黏膜毛細血管周細胞的增殖、遷移，并增加周細胞的CAFs相關標記物表達，進而通過介導運輸骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2激活PI3K/Akt、MEK/ERK通路，促進周細胞向CAFs轉化[7]。此外，胃癌來源的外泌體亦可通過TGF-β/Smad通路誘導人臍帶來源的間充質干細胞(hucMSCs)向CAFs分化[8]。

此外，外泌體調節(jié)腫瘤細胞生長的機制亦包括：胃癌細胞源性外泌體和內含微RNA(miRNA)可通過CD97上調ERK、JNK、p38等MAPK通路關鍵成員的磷酸化水平、激活下游蛋白表達，促進胃癌細胞增殖并增強其侵襲力[9]；胃黏膜上皮細胞產生的外泌體可功能性轉運高毒力幽門螺桿菌菌株的毒力因子CagA蛋白,促進其進入其他胃黏膜細胞，此可能與早期胃癌的發(fā)生有關[10]。

2. 調節(jié)腫瘤相關免疫功能：體內巨噬細胞分為M1、M2表型，粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)、脂多糖(LPS)、干擾素-γ(IFN-γ)等可使單核細胞分化為M1表型，發(fā)揮吞噬殺傷微生物、分泌炎性因子、刺激特異性免疫、抑制腫瘤生長等功能；而巨噬細胞集落刺激因子(M-CSF)、白細胞介素-4(IL-4)、IL-10等則可使單核細胞分化為M2表型，具有促進基質重編程、組織修復、血管生成、增強腫瘤生長的作用。腫瘤相關巨噬細胞(tumor-associated macrophages, TAMs)在腫瘤微環(huán)境中主要呈現M2表型，可分泌腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、TGF-β、血管內皮生長因子(VEGF)、IL-10以及多種趨化因子，從而促進腫瘤細胞增殖和轉移、抑制相關免疫功能、促進血管生成等[11]。研究[12]發(fā)現，胃癌源性外泌體可促進PD1+TAMs的產生以及TAMs向M2表型轉化，繼而增加IL-10分泌、抑制CD8+T細胞功能，有利于腫瘤細胞增殖。此外，體內胃癌源性外泌體可通過激活NF-κB通路來促進巨噬細胞表型轉換，進而誘導腫瘤細胞的增殖和侵襲[13]。

髓系來源的抑制細胞(myeloid-derived suppressor cells, MDSCs)是一類未成熟的髓系細胞，可抑制T細胞活性。胃癌外泌體通過減少CD8+T細胞與自然殺傷細胞(NK細胞)數量、增加CD4+T細胞數量、募集MDSCs來產生免疫抑制微環(huán)境。CD8+T細胞是針對腫瘤的關鍵免疫細胞。有研究[14]顯示，腫瘤來源的外泌體改變基因表達和細胞因子分泌模式可能與腫瘤源性外泌體內容物富集有關。此外，胃癌細胞源性外泌體可激活Hsp72/TLR2通路、進而誘導MDSCs以增加IL-6的分泌，通過自分泌途徑進一步增強其免疫抑制作用。

此外，有研究[15]發(fā)現，含人高遷移率族蛋白B1(HMGB1)的胃癌細胞源性外泌體作用于Toll樣受體4(TLR4)，可激活NF-κB通路，使體內中性粒細胞自噬作用增強，同時促進其極化為N2表型以發(fā)揮促進腫瘤細胞增殖、轉移以及抑制腫瘤免疫的功能。經胃癌細胞源性外泌體刺激后，MDSCs一方面可上調CD69、CD25等與T細胞激活有關的表面標記物表達，另一方面可抑制單個核細胞增殖，從而激活人髓系白血病單核細胞(THP1細胞)和巨噬細胞，增加多種前炎性因子表達[16]。

3. 調節(jié)腫瘤血管生成：一方面，腫瘤源性外泌體可轉運多種血管生長相關因子以調節(jié)腫瘤血管生成，如VEGF、基質金屬蛋白酶(MMP)以及多種miRNA，亦可通過抑制低氧誘導因子-1(HIF-1)等表達，促進血管生成[17]；另一方面，部分腫瘤源性外泌體內含血管生成蛋白(ANG)，此為一種內切核酸酶，可參與新生血管形成、腫瘤發(fā)生、發(fā)展以及固有免疫調節(jié)等過程，同時對VEGF、表皮細胞生長因子(EGF)、堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)等多種血管生成因子發(fā)揮的效應具有允許作用[18]。

三、外泌體內容物對胃癌發(fā)生、發(fā)展的作用

1. 外泌體內蛋白：腫瘤源性外泌體內含多種調節(jié)細胞生長、分化以及維持其正常生理功能的蛋白，包括多種癌基因表達產物、酶、生物因子、熱休克蛋白以及轉錄因子等，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中起有重要作用。

①三次跨膜結構域(tripartite motif, TRIM): TRIM家族屬于一類泛素連接酶，在細胞增殖、分化、凋亡以及DNA修復、轉錄調節(jié)等方面均發(fā)揮重要作用，其成員TRIM3具有抑癌功能。研究[19]發(fā)現，胃癌患者血清外泌體中TRIM3表達水平較健康人群有所下降，而TRIM3過表達可通過調控干細胞增殖分化、EMT等途徑抑制胃癌的發(fā)生和轉移。

②人胃動蛋白1(gastrokine 1, GKN1): GKN1是由胃黏液分泌細胞產生的一種胃特異性蛋白，可隨黏液分泌至胃黏膜表面，在維持胃黏膜完整性和穩(wěn)態(tài)、調節(jié)細胞增殖分化方面發(fā)揮重要作用，屬抑癌因子。研究[20]表明，GKN1通過外泌體形式被胃黏膜分泌和內吞，可抑制胃癌細胞增殖并誘導腫瘤細胞凋亡。

③其他：在胃癌發(fā)生過程中，腫瘤附近浸潤的M2巨噬細胞可高水平表達載脂蛋白E(ApoE)，并由外泌體將其轉運至鄰近癌細胞，從而激活PI3K/Akt信號通路，促進胃癌細胞增殖和轉移[21]。在幽門螺桿菌感染后的胃癌細胞所釋放的外泌體中，磷酸化形式的間質表皮轉化因子(MET)表達水平明顯升高，可通過刺激IL-1β分泌等方式促進TAMs表型轉化、促進腫瘤生長和進展[22]。對p53敲除的骨髓間充質干細胞的研究[23]發(fā)現，其產生的外泌體可轉運泛素蛋白連接酶E3成分N識別蛋白2(UBR2)至胃癌細胞和p53未敲除的干細胞，導致Wnt/β-catenin通路異常激活，發(fā)揮促進胃癌進展、轉移以及增強胃癌細胞的干細胞性等作用。

2. 外泌體內RNA

①MiRNA：近年在外泌體內發(fā)現了多種miRNA，可被鄰近或遠處細胞吸收，起調節(jié)作用[24]。同時外泌體內miRNA亦具有相關的主動分揀機制，即miRNA的3’末端等特異序列可指導其整合入外泌體，而中性鞘磷脂酶-2(nSMase-2)、蘇素化的核不均一核糖核蛋白(hnRNP)等分子亦可控制miRNA分揀[25]。外泌體miRNA在疾病進展中起重要作用，并能刺激血管生成、促進腫瘤轉移[26]。除包裝入外泌體或微泡外，miRNA亦可包裝入高密度脂蛋白中，或與囊泡外AGO2蛋白結合，以上三者均可保護miRNA免受降解。這種通過循環(huán)囊泡傳遞信息的途徑是細胞間通訊的第三種方式，與接觸性信號轉導和可溶性分子信號轉導同等重要[25]。

外泌體中miRNA的功能可分為兩類：一種是常規(guī)功能，即前述的負調節(jié)功能，可引起目標基因表達水平特征性變化；另一種是取決于miRNA種類的特異性功能，對于某些miRNA，當其作為外泌體內成分而非細胞內成分發(fā)揮作用時，此功能方能體現。外泌體中各種不同類型的miRNA在胃癌腫瘤微環(huán)境中發(fā)揮不同功能，如miR-423-5p可促進胃癌細胞增殖和遷移[27]、let-7 miRNA維持致瘤表型和轉移潛能[28]、miR-130a促進血管生成和腫瘤生長[29]、miR-21抑制細胞凋亡[30]、miR-34過表達可抑制胃癌細胞的增殖、侵襲以及運動[31]等。

②長鏈非編碼RNA(lncRNA)：研究[32]發(fā)現，一種長度為26 bp的lncRNA X26nt含量在胃癌細胞源性外泌體中明顯升高，其可轉運入血管內皮細胞，進而降低細胞內血管內皮鈣黏蛋白水平，促進細胞的增殖、遷移、血管形成等，加速腫瘤生長和血管生成。此外，研究[33]發(fā)現，胃癌患者血清分離的外泌體內lncRNA HOTTIP表達水平較健康人群升高，其具有作為胃癌生物標記物的潛力。

③環(huán)狀RNA(circRNA)：近年研究[34]發(fā)現，在胃癌患者的癌組織和血清中，外泌體形式的circSHKBP1水平顯著上升，且與疾病不良預后相關。該分子屬于circRNA，在體內外均可發(fā)揮促進胃癌細胞增殖、遷移、侵襲以及血管生成的作用，其主要機制是通過miR-582-3p/HUR/VEGF通路增強VEGF mRNA的穩(wěn)定性，同時直接與熱休克蛋白90結合、阻抑其正常泛素化，最終引起胃癌進展加速。

總之，外泌體是參與胃癌發(fā)生、發(fā)展的多功能載體，內含種類豐富的RNA，可維持細胞惡性表型，促進腫瘤細胞增殖、轉移、遷移、黏附，促進EMT、血管生成，促進成纖維細胞轉化等[35]。

四、外泌體在胃癌診療中的應用潛力

1. 外泌體在生物標記物方面的潛力：近期研究揭示了外泌體內的多種內含物在胃癌的早期診斷、預后分析以及療效評估方面可能具有重要的生物標記物潛力。

①DNA和蛋白質：研究[20]顯示，GKN1在胃癌患者血清外泌體中的水平顯著低于健康人群，且具有一定的鑒別胃癌患者與良性胃部疾病以及肝癌、結腸癌患者的能力，有望成為胃癌的特異性診斷標記物。另有研究[36]對胃液提取的外泌體內的DNA進行BARHL2甲基化分析，證實其可作為早期探測胃癌的臨床標記物。

②MiRNA：有研究[37]發(fā)現miR-92b-3p、let-7g-5p、miR-146b-5p、miR-9-5p這4種血清外泌體miRNA組合的表達水平升高與早期胃癌的進展密切相關，可能成為新的早期胃癌的生物標記物。另有4種血清外泌體的組合為miR-10b-5p、miR-195-5p、miR-20a-3p、miR-296-5p，其在胃癌診斷和預后方面的標記物意義已得到研究證實，在其水平上調后進行的輔助化療可能會降低患者的總生存率[38]。研究[27]發(fā)現，胃癌患者血清外泌體內miR-423-5p含量顯著升高，并與腫瘤細胞淋巴結轉移和預后不良密切相關，可能成為胃癌的預后指標。

③LncRNA：近期研究[39-40]發(fā)現，lncRNA PCSK2-2∶1和lncRNA SLC2A12-10∶1在胃癌患者血清外泌體中的表達水平與健康人群有顯著差異，前者與腫瘤體積、分期、靜脈侵襲情況相關，可作為預測轉移和預后的指標，而后者較傳統診斷指標具有較高的敏感性，可作為新型的胃癌診斷指標。

2. 外泌體在靶向治療方面的潛力：關于外泌體及其內容物在胃癌治療中的潛力，目前研究主要集中在外泌體與胃癌細胞耐藥性方面。順鉑是胃癌化療的常用藥物之一，胃癌患者對該藥的初始反應良好，但大多數患者會隨用藥時間的延長而進展為對順鉑耐藥，其機制包括藥物吸收減少和外排增加、腫瘤細胞內活性藥物成分減少、分子靶點改變、DNA損傷修復加強、前凋亡因子下調以及抗凋亡基因上調等。目前認為外泌體與此過程密切相關。由外周血單核細胞分化來的M2巨噬細胞可產生含有miR-21的外泌體，通過PTEN和PI3K/Akt等通路促進胃癌細胞產生對順鉑的耐藥性[41]。而針對HEK293T細胞株的體外實驗表明，外泌體可用作抗miR-214的轉運載體，可能具有逆轉胃癌對順鉑耐藥性的作用[42]。此外，外泌體內含的c-Met siRNA可顯著抑制胃癌細胞的侵襲性，并在體內、外實驗中表現出部分逆轉胃癌對順鉑耐藥性的作用，有望成為胃癌的潛在治療靶點之一[43]。

五、總結

綜上所述，外泌體是細胞間物質交換與信息傳遞的重要渠道。通過內含的蛋白質、核酸等生物活性物質，外泌體可調節(jié)腫瘤細胞生長增殖、腫瘤相關免疫功能以及腫瘤血管生成，促進或抑制胃癌的發(fā)生、發(fā)展。利用多種方式針對外泌體形式的特定蛋白或核酸進行監(jiān)測，可作為胃癌病變評估、療效監(jiān)測等的參考指標，展現出作為腫瘤早期標記物和治療靶點的潛力。