張立萍， 佘秋鈿， 范 敏，游瑞云， 劉 琳， 盧玉棟*

（1. 奢脈國際化妝品（北京）有限公司，北京 100000；2. 福建師范大學 化學與材料學院，福建省先進材料化工基礎重點實驗室，福建 福州 350117）

虎耳草［Saxifraga stolonifera (L.) Meerb.］是一種多年生的常綠草本植物，屬于雙子葉植物綱?；⒍萑菘扇胨帲莒铒L清熱、涼血解毒，具有抗炎消腫、治療濕疹、治凍瘡、外傷止血、鎮(zhèn)咳等多種藥理活性[1]，還可作為細胞凋亡誘導劑，調(diào)控前列腺癌細胞的凋亡[2]。

虎耳草中含有的主要活性物質(zhì)可分為三大類，分別是多酚類、黃酮類、有機酸類[3]。1988 年，羅厚蔚等人利用乙醇作為提取溶劑，回流提取虎耳草中的化學物質(zhì)，經(jīng)過有機溶劑萃取，層析分離得到巖白菜素、槲皮素-3-鼠李糖苷、槲皮素、原兒茶酸、沒食子酸等8 種結(jié)晶化合物，其中槲皮素、槲皮苷均屬于黃酮類化合物[4]?；⒍葜兴狞S酮類化合物能夠起到消炎、抗氧化、抑菌、降低血管脆性、降血脂、治療過敏、抗自由基等多種對生物活性有益的作用[5]。

虎耳草中活性成分的提取工藝主要有回流提取、超聲提取、索氏提取和冷浸提取[6]、微波輔助萃取技術、膜分離技術和超微粉碎技術。對于虎耳草提取液中主要活性成分的分離，一是通過有機溶劑萃取進行分離，二是通過色譜分離純化[7]。

現(xiàn)如今，虎耳草在市場上的應用較為局限，針對虎耳草應用受到限制的問題，需要深入探討虎耳草中活性成分的功效，為虎耳草在高附加值領域的應用提供基礎數(shù)據(jù)、提高其活性成分的廣泛應用。本文提取虎耳草中活性成分，通過體外抑制小鼠單核細胞白血病細胞（簡稱Raw-Blue 細胞）的炎癥產(chǎn)生、牛津杯法判斷常見細菌對虎耳草的敏感程度以及體外測定羥基自由基的清除率[8]等方法從各方面評價虎耳草中活性成分的功效。

1 實驗

1.1 實驗儀器與藥品

1.1.1 實驗儀器

電熱干燥箱，VIS-721，上海亞榮生化儀器廠；電子天平，CARY 50，Varian；721 可見分光光度計，RE-52A，上海佑科儀器儀表廠；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海亞榮生化儀器廠；細菌培養(yǎng)箱，福州科遠貿(mào)易有限公司；超凈操作臺，蘇州凈化設備有限公司；集熱式磁力攪拌器，DF-101S；無菌注射器，江蘇康友醫(yī)用器械有限公司；酶標儀，Spectra max Plus384，Molecular Devices。

1.1.2 實驗藥品

亞硝酸鈉，AR，天津市瑞金特化學品有限公司；硝酸鋁，AR，天津市紅巖化學試劑廠；十二水合磷酸氫二鈉、二水合磷酸二氫鈉，AR，上海展云化工有限公司；水楊酸，AR，上海實驗試劑有限公司；無水乙醇、氫氧化鈉、蘆丁標準品、六水合硫酸亞鐵、抗壞血酸、過氧化氫，均為AR，國藥集團化學試劑有限公司；虎耳草，安徽亳州中藥材交易市場；菌種：大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌，均由福建師范大學生命科學學院提供。L-多巴、石油醚、正丁醇、乙酸乙酯、蘑菇酪氨酸酶、脂多糖LPS、Raw-Blue 細胞、營養(yǎng)瓊脂均為生工公司提供。

1.2 虎耳草活性成分的提取

1.2.1 冷凝回流法和冷浸法提取虎耳草

冷凝回流法：稱取10.0 g 干燥虎耳草于一潔凈圓底燒瓶中，在冷凝回流下按照料液比1∶13 慢速加入75%乙醇溶液，在70℃條件下反應2 h，抽濾得第一次虎耳草提取液。以料液比為1∶6 將75%乙醇溶液加到虎耳草的濾渣中，冷凝回流1.5 h 后抽濾，合并兩次虎耳草提取液，濃縮干燥至固態(tài)。

冷浸法提取虎耳草活性成分：按照料液比取干燥虎耳草和75%乙醇溶液，混合后放置過夜，同樣得到兩次提取液并合并蒸發(fā)濃縮，得到的濃縮提取液密封冷藏備用。

本文后續(xù)實驗都使用這兩種方法提取的虎耳草合并溶液。

1.2.2 紫外分光光度計測定虎耳草提取液中總黃酮含量

以蘆丁為標準樣品測定總黃酮含量。量取3 mL 虎耳草提取液，隨后依次各加入亞硝酸鈉溶液、硝酸鋁溶液、NaOH 溶液、蒸餾水定容至25 mL。在波長為510 nm 條件下測定虎耳草提取液的吸光度，根據(jù)蘆丁標準曲線方程式可得提取物中總黃酮的濃度，其中粗品虎耳草提取液中總黃酮的含量如式（1）所示。

式中，ρ為質(zhì)量濃度，VR為溶劑體積，VS為提取物體積，VQ為稀釋試樣的溶液的體積，m為試樣的質(zhì)量。

1.3 虎耳草提取液抗氧化性能的測定

準確稱取0.5 g 固態(tài)虎耳草提取液，用pH=6.8 的磷酸鹽緩沖液溶解配制成0.4 mg/mL 虎耳草溶液。取11 個25 mL 容量瓶，依次向其中分別加不同體積虎耳草溶液，隨后各加入2.5 mL 9.0 mM 水楊酸-75%乙醇溶液、9.0 mM 硫酸亞鐵溶液、0.3%過氧化氫溶液啟動反應，用蒸餾水定容至25 mL。在波長510 nm 測定其吸光度值Ax’，記錄三組平行數(shù)據(jù)取平均值。維生素C 作為陽性對照實驗。自由基清除率計算如公式（2）所示。

式中，A0為空白管的吸光度，AX為加入自由基清除劑后的吸光度。

1.4 虎耳草提取液的分離

固態(tài)虎耳草乙醇提取物溶于100 mL 蒸餾水中，用50 mL 丙酮沉淀部分皂苷后，蒸發(fā)濃縮、烘干。100 mL 蒸餾水重溶，按浸提液與萃取溶劑1∶1（V/V）依次經(jīng)石油醚、乙酸乙酯、正丁醇溶劑，在室溫下萃取，得到的石油醚部分、乙酸乙酯部分和正丁醇部分萃取物，冷藏保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 虎耳草提取液及不同溶劑萃取物的體外抗炎性能評價

將Raw-Blue 細胞以每孔5 000 個鋪至96 孔板內(nèi)，待細胞貼壁完全，加入虎耳草總提取液或者不同溶劑萃取物，培養(yǎng)2 小時。將炎癥刺激物LPS 加入，培育24 小時。最后，將150 μL 顯色液加入96 孔板中，取50 μL 的上清液，混勻后培養(yǎng)0.5～2 小時。根據(jù)吸光度變化程度評價虎耳草總提取液及不同溶劑萃取劑的體外抗炎活性。

1.6 虎耳草總提取液及不同溶劑萃取物的體外抑菌功效研究

采用牛津杯方法對70%乙醇溶液、虎耳草提取液以及不同溶劑的萃取液進行抑菌實驗。

1.7 虎耳草有效成分對酪氨酸酶作用的研究

取2 mL L-多巴溶液，分別加入0.5 mL 不同濃度虎耳草提取液，濃度分別為250、500、1000、2000、4 000、5 000 μg/mL。接著分別加入0.5 mL 酪氨酸酶溶液，快速振蕩搖勻，并在黑暗下反應至酶活力最大值。反應后在475 nm 處測定吸光值A’，平行記錄三組數(shù)據(jù)并取平均值。以0.5 mL pH＝6.8 的磷酸緩沖溶液作為虎耳草不同濃度提取液的空白對照。根據(jù)各組在475 nm 下的吸光值可計算不同濃度虎耳草提取液對酪氨酸酶的抑制率（%）。抑制率可根據(jù)式（3）計算。

式中，各組 a: 磷酸鹽緩沖液、L-多巴溶液、酪氨酸酶溶液；b: 磷酸鹽緩沖液、L-多巴溶液；c: L-多巴溶液、虎耳草提取液、酪氨酸酶溶液；d: L-多巴溶液、虎耳草提取液、磷酸鹽緩沖液。

2 結(jié)果與討論

2.1 虎耳草提取液的固含量及總黃酮含量

采用冷凝回流法和冷浸法結(jié)合對干燥的虎耳草進行提取，并通過測定得其固含量和提取率分別為7.18 mg/mL 和14.9%。由于黃酮母核中多帶酚羥基，酚羥基能和鋁離子產(chǎn)生黃色絡合物，實驗采用蘆丁作為對照品對總黃酮進行含量測定[9]，實驗數(shù)據(jù)表明吸光度A值與蘆丁濃度呈線性關系。以吸光度A值為縱坐標，對照品的濃度（C）為橫坐標，繪制標準工作曲線，并得到線性回歸方程A＝13.658C＋0.009 8，R2＝0.999 3。再根據(jù)實驗所得的虎耳草提取液總黃酮含量為5.86%。

2.2 虎耳草提取液的抗氧化性能

為了探究虎耳草總提取液的抗氧化性能，本實驗用羥基自由基的清除率來表示抗氧化性能的優(yōu)劣。以維生素C 作為對照品，在波長510 nm 處對各溶液進行吸光值的測量。從原理上來看，溶液顏色越淺，測得的吸光值越小，則說明自由基的清除率越高，即抗氧化性能越好。根據(jù)分別添加的維生素C 溶液以及虎耳草提取液的濃度梯度與對自由基的清除率的數(shù)據(jù)繪出趨勢圖，如圖1 所示。

從圖1 中可知，虎耳草提取液在低濃度時，抗氧化性能不穩(wěn)定，在較高濃度時具有與維生素C 相當?shù)目寡趸阅埽⑶以谙嗤瑢嶒灄l件下測得虎耳草提取液濃度為0.048 mg/mL 時，對羥基自由基的清除率達75.7%。

圖1 不同濃度的維生素C 和虎耳草提取液對羥基自由基的清除率

圖2 虎耳草總提取液及不同溶劑萃取物對炎癥的抑制作用

2.3 虎耳草總提取液及不同溶劑提取物的抗炎性能

為了探究虎耳草總提取液對Raw-Blue 細胞的體外抗炎性能，本實驗利用脂多糖LPS 作為炎癥刺激物對Raw-Blue 細胞進行發(fā)炎刺激。實驗中設置十組情況分別進行，這里將組名簡稱為空白、LPS、虎、虎+LPS、石、石+LPS、乙、乙+LPS、正、正+LPS，對應編號1 至10。通過酶標儀檢測出細胞溶液體系的吸光值變化程度來判斷測試樣品中抗原的濃度，從而評價虎耳草總提取液以及它的不同溶劑萃取物的抗炎性能。

從圖2 可以比較明顯地看出，有加入虎耳草總提取液組和乙酸乙酯溶劑萃取物組比空白組測得的吸光值大幅度減小，這說明虎耳草總提取液及乙酸乙酯萃取物本身具有很好的抗炎性能。并且在加入炎癥刺激物LPS 后，乙酸乙酯萃取物對細胞的炎癥抑制作用與虎耳草總提取液的效果相近。

2.4 虎耳草總提取液及不同溶劑萃取物的抑菌性能

為了研究虎耳草總提取液的抑菌性能，本實驗以金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、銅綠假單胞菌三種常見細菌為試驗菌種，運用牛津杯法對虎耳草總提取液進行抑菌性能檢測。實驗結(jié)果如表1 所示，虎耳草總提取液對三種較為常見的細菌均有抑菌活性，其中對大腸桿菌的抑制效果最佳。虎耳草總提取液的石油醚相萃取物對大腸桿菌的作用雖然稍強于對金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌的抑制作用，但總體表現(xiàn)為低敏。金黃色葡萄球菌和大腸桿菌對乙酸乙酯相與正丁醇相萃取物的敏感程度相當，而對于銅綠假單胞菌，正丁醇萃取物的抑制作用最明顯。綜合比較來看，虎耳草正丁醇相的萃取物抑菌性能最佳。

表1 牛津杯法對虎耳草總提取液及不同溶劑萃取物的抑菌性能檢測（抑菌圈直徑/ mm）

2.5 虎耳草提取液對酪氨酸酶的抑制作用

為了探究虎耳草提取液濃度對酪氨酸酶的酶活力抑制作用的影響，本實驗設置了虎耳草溶液的梯度濃度，反應至酶活力活性最大值，通過對酶活力活性的測定，得到酶活力趨于穩(wěn)定值的時間。從圖3 可知，虎耳草提取液對酪氨酸酶的抑制率在濃度為4 000 μg/mL 處達到最大效果，抑制率為79.25%。提取液濃度在250～4 000 μg/mL時，對酶活力的抑制率逐漸增強，而濃度大于4 000 μg/mL時，對酶活力的抑制率迅速降低。說明虎耳草提取液在較低濃度時就表現(xiàn)出較好的抑制酪氨酸酶活力的功效，若能加入到護膚產(chǎn)品中，可以達到美白的效果。

圖3 虎耳草提取液濃度對酪氨酸酶的影響

3 結(jié)論

1）通過回流提取與冷浸提取合并所得虎耳草提取物的固含量為7.18 mg/mL，提取率為14.9%。采用紫外分光光度計法，蘆丁作為實驗對照品，測得黃酮總含量為5.86%。

2）虎耳草提取液具有很好的抗氧化活性，與維生素C 進行比較，在低濃度時，維生素C 表現(xiàn)出強的抗氧化活性，而在稍高濃度時，虎耳草提取液的抗氧化性能與維生素C 相當。當虎耳草提取液濃度為0.048 mg/mL 時，對羥基自由基的清除率達到75.7%。

3）虎耳草總提取液及不同溶劑萃取物均具有不同程度的抗炎性能，其中，虎耳草總提取液乙酸乙酯萃取物能發(fā)揮最大的抗炎功效。

4）通過牛津杯法對虎耳草提取液的抑菌性能檢測表明，虎耳草提取液能夠抑制常見的普通細菌，具有一定的抑菌性能。具體地，虎耳草總提取液正丁醇萃取物抑菌性能最佳。

5）虎耳草提取液對酪氨酸酶的活性具有較強的抑制作用，測試體系在黑暗環(huán)境下反應30 min，使得酶活力達到最大、最穩(wěn)定值。在提取液濃度為4 000 μg/mL 處達到最大抑制效果，抑制率為79.25%。