韓子逸沈詩怡張金鑫周燕趙昕劉明江徐霄龍

(1. 揚州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院,江蘇 揚州 225009; 2. 江蘇省動物重要疫病與人畜共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心,江蘇 揚州 225009; 3. 首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京中醫(yī)醫(yī)院,北京 100010)

角叉菜膠是一種從海藻中提取的含硫酸多糖,被廣泛用于制備動物的各種炎癥及血栓模型[1-2],其中角叉菜膠誘導(dǎo)的小鼠尾部血栓模型是目前科學(xué)研究中最為常用的血栓模型之一。該模型具有簡便快捷、成本低的優(yōu)點,模型條件通常為(20 ±1)℃室溫條件下,將0.20% ～0.80%劑量的角叉菜膠生理鹽水溶液注入小鼠腹腔,造模6 ～12 h 內(nèi)小鼠尾尖將出現(xiàn)暗紅色血栓并逐漸向尾根擴(kuò)大,24 h左右血栓區(qū)域趨于穩(wěn)定[3-4]。但筆者認(rèn)為采用該方法建立的模型出栓速度過快且損傷嚴(yán)重,與正常情況下血栓形成栓塞致組織病變所需時間不符,不利于相關(guān)防治藥物的研究工作。因此,本試驗采用低劑 量(0.02%、 0.04%、 0.06%、 0.08%、 0.10%、0.20%)的角叉菜膠生理鹽水溶液(0.01 mL/g)連續(xù)腹腔注射(每天1 次)的方式探索小鼠慢性血栓模型的條件,為血栓相關(guān)研究工作提供更加適宜的動物模型。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

70只5周齡SPF 級ICR 小鼠雄性,體重(21 ±2)g,購自揚州大學(xué)實驗動物中心【SCXK(蘇)2017-0007】;飼養(yǎng)于揚州大學(xué)實驗動物中心【SYXK(蘇)2017-0044】;所有操作均符合實驗小鼠的飼養(yǎng)過程和其他實驗操作均符合實驗動物倫理學(xué)要求(審批號:YZUDWLL-202005-002)以及中華人民共和國《實驗動物管理條例》。飼養(yǎng)條件:(20 ± 1)℃,30%～40%濕度,自由采食飲水,12 h 循環(huán)燈光,適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d 后進(jìn)行實驗。

1.1.2 主要試劑與儀器

角叉菜膠、生理鹽水溶液、檸檬酸鈉水溶液。凝血時間(thrombin time,TT)試劑盒、凝血酶原時間(prothrombin time,PT)試劑盒、活化部分凝血活酶時間(activated partial thromboplastin time,APTT)試劑盒、纖維蛋白原(fibrinogen,FIB)試劑盒,均購自上海太陽生物技術(shù)有限公司;半自動血凝儀(PUN-2048A),購自北京普朗新技術(shù)有限公司;超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)試劑盒、丙二醛(malondialdehyde,MDA)試劑盒,均購自南京建成有限公司,上述指標(biāo)均采用化學(xué)發(fā)光法并按照試劑盒說明書進(jìn)行檢測。炎癥因子IL-1β、IL-10、TNF-α 試劑盒,購自abclonal 有限公司,炎癥因子指標(biāo)均采用酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)并按照試劑盒說明書進(jìn)行檢測,酶標(biāo)儀(Epoch)購自美國博騰儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 藥物制備

配置濃度為0.02%、0.04%、0.06%、0.08%、0.10%、0.20%的角叉菜膠生理鹽水溶液,現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.2.2 動物分組及造模方法

將70 只ICR 雄性小鼠隨機分為7 組,每組10只,即:空白對照組、0.02%劑量組、0.04%劑量組、0.06%劑量組、0.08%劑量組、0.10%劑量組、0.20%劑量組。造模條件:空白組每天腹腔注射生理鹽水溶液0.01 mL/g,其余各組按照對應(yīng)濃度分別腹腔注射角叉菜膠溶液0.01 mL/g;注射角叉菜膠后,每天眼觀各組小鼠尾尖處有無黑尾,當(dāng)出現(xiàn)黑尾即判定該小鼠出栓,出栓小鼠不再注射角叉菜膠并立即處死采樣,未出栓小鼠繼續(xù)注射相應(yīng)濃度的角叉菜膠溶液并觀察至第10 天;各組持續(xù)處理并觀察10 d;各組小鼠于(20 ± 1)℃下自由飲水、進(jìn)食。

1.2.3 檢測指標(biāo)

(1)出栓率、尾栓平均長度:每天記錄各組的出栓小鼠數(shù)量以及尾部血栓長度。

(2)血凝四項:小鼠處死前收集的血液置于含檸檬酸鈉的離心管中,離心(1500 r/min、4℃、10 min)取上層血漿,半自動血凝儀檢測血凝四項。

(3)炎癥因子指標(biāo):小鼠處死后采集結(jié)腸組織,按照炎癥因子試劑盒說明書測定結(jié)腸組織與血漿中IL-1β、IL-10 及TNF-α 的含量。

(4)氧化應(yīng)激指標(biāo):小鼠處死后采集結(jié)腸組織,按照氧化應(yīng)激試劑盒說明書測定結(jié)腸組織與血漿中谷胱甘肽過氧化物酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、丙二醛(MDA)的含量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

使用 GraphPad Prism 6.0 多重比較分析(ordinary one-way ANOVA)并繪制小鼠血凝四項表格、氧化應(yīng)激指標(biāo)及ELISA 結(jié)果柱狀圖,P＜0.05 為差異具有顯著性,P＜0.01 為差異具有極顯著性。

2 結(jié)果

2.1 各組出栓率與尾栓平均長度

如表1 所示,0.02%劑量組小鼠試驗期間無尾部血栓形成;0.04%劑量組小鼠第4 天出栓2 只,第5、6 天各出栓1 只,出栓率40%;0.06%劑量組小鼠第5 天出栓2 只,第6 天出栓8 只,出栓率100%;0.08%劑量組第4 天出栓9 只,第5 天出栓1 只,出栓率100%;0.10%劑量組小鼠第2 天出栓10 只,出栓率100%;0.20%劑量組小鼠第1 天出栓10 只,出栓率100%。

表1 各組小鼠尾部血栓出栓結(jié)果(n=10)Table 1 Results of thrombus outlet in the tail of mice in each group(n=10)

如圖1 所示,自0.06%劑量組至0.20%劑量組,小鼠黑尾長度逐漸延長,黑尾顏色逐漸加深。

圖1 各組小鼠尾部血栓照片F(xiàn)igure 1 Photos of thrombus in the tail of mice in each group

2.2 各組血凝四項結(jié)果

如表2 所示,與空白對照組相比,0.02%劑量組小鼠血凝四項均無顯著差異;0.04%劑量組小鼠僅PT 顯著延長(P＜0.05);0.06%劑量組小鼠FIB 含量顯 著 升 高(P＜ 0.05),APTT 顯 著 縮 短(P＜0.05),TT 顯著延長(P＜0.05),PT 極顯著延長(P＜0.01);0.08%劑量組、0.10%劑量組與0.20%劑量組FIB 含量極顯著升高(P＜0.01),APTT 極顯著縮短(P＜0.01),TT、PT 均極顯著延長(P＜0.01)。

表2 各組血凝四項結(jié)果(n=5)Table 2 Results of hemagglutination in each group(n=5)

2.3 各組炎癥因子指標(biāo)檢測結(jié)果

如圖2,與空白對照組比,0.06%劑量組與0.08%劑量組結(jié)腸組織中IL-1β 顯著升高(P＜0.05)、0.20%劑量組IL-1β 極顯著升高(P＜0.01)、0.06%劑量組與0.08%劑量組TNF-α 顯著升高(P＜0.05)、0.20%劑量TNF-α 極顯著升高(P＜0.01)、0.06%劑量組與0.08%劑量組IL-10 顯著降低(P＜0.05)、0.20%劑量組IL-10 極顯著降低(P＜0.01)。

圖2 各組小鼠結(jié)腸組織與血漿中炎癥因子指標(biāo)檢測結(jié)果Note. A. Detection results of inflammatory factors in colon tissues of mice in each group. B. Detection results of inflammatory factors in plasma of mice in each group.Figure 2 Detection results of inflammatory factors in colon tissues and plasma of mice in each group

與空白對照組相比,0.06%劑量組與0.08%劑量組血漿中IL-β 顯著升高(P＜0.05)、0.20%劑量組IL-β 極顯著升高(P＜0.01)、0.06%劑量組與0.08%劑量組TNF-α 顯著升高(P＜0.05)、0.20%劑量TNF-α 極顯著升高(P＜0.01)、0.06%劑量組與0.08%劑量組IL-10 顯著降低(P＜0.05)、0.20%劑量組IL-10 極顯著降低(P＜0.01)。

2.4 各組氧化應(yīng)激指標(biāo)檢測結(jié)果

如圖3,與空白對照組相比,0.06%劑量組與0.08%劑量組結(jié)腸組織中SOD 顯著降低(P＜0.05),0.20%劑量組SOD 極顯著降低(P＜0.01),0.06%劑量組、0.08%劑量組與0.2%劑量組GSH-Px 均極顯著降低(P＜0.01),0.06%劑量組、0.08%劑量組與0.20%劑量組MDA 均顯著升高(P＜0.05)。

圖3 各組小鼠結(jié)腸組織與血漿中氧化應(yīng)激指標(biāo)檢測結(jié)果Note. A. Detection results of oxidative stress in colon tissues of mice in each group. B. Detection results of oxidative stress in plasma of mice in each group.Figure 3 Detection results of oxidative stress in colon tissues and plasma of mice in each group

與空白對照組相比,0.06%劑量組、0.08%劑量組與0.20%劑量組血漿中SOD 均顯著降低(P＜0.05)、GSH-Px 均極顯著降低(P＜0.01)、MDA 均顯著升高(P＜0.05)。

3 討論

采用角叉菜膠制備的大/小鼠血栓模型不需要進(jìn)行手術(shù)等復(fù)雜操作且對動物造成創(chuàng)傷小,尾部血栓程度易于觀察和測量[5]。角叉菜膠可誘導(dǎo)機體組織急性炎癥反應(yīng),炎癥因子釋放入血后,可損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞并導(dǎo)致血栓形成;因小鼠尾部為單股動脈循環(huán),一旦栓塞很難形成側(cè)支循環(huán)導(dǎo)致尾部組織逐漸缺血壞死[6]。目前普遍采用0.20% ～0.80%劑量的角叉菜膠制備的小鼠尾部血栓模型,該模型出栓時間過短(6 ～12 h)、尾部病變嚴(yán)重,多種防治藥物難以短時間內(nèi)發(fā)揮療效,不利于相關(guān)防治藥物的研究工作。故本試驗采用低劑量的角叉菜膠連續(xù)腹腔注射的方式建立慢性血栓小鼠模型,以期延長尾部血栓形成時間、減輕血栓的嚴(yán)重程度。0.06%、0.08%、0.10%、0.20%劑量組小鼠出栓率均為100%,但各組小鼠集中出栓的時間分別為第6 天(80%)、第4 天(90%)、第2 天(100%)、第1天(100%),因此,0.06%、0.08%角叉菜膠連續(xù)腹腔注射均可建立小鼠慢性血栓模型,除尾部血栓外,其他部位(如耳部、四肢)未見明顯血栓。

血凝四項(PT、APTT、TT、FIB)檢測對診斷凝血系統(tǒng)異常的血液性疾病具有重要意義[7]。血栓形成過程中將消耗大量凝血因子導(dǎo)致PT 延長,而凝血因子的缺失則會引起APTT 的縮短;同時在凝血酶的作用下,FIB 不斷轉(zhuǎn)化為纖維蛋白(血栓主要成分)并使機體血液持續(xù)保持高凝狀態(tài),當(dāng)血液中纖維蛋白含量過高時,機體纖溶增強,纖維蛋白降解產(chǎn)物增多,導(dǎo)致TT 延長[8-9]。0.06%以上各劑量組與空白對照組相比PT、TT、FIB 均顯著升高,APTT顯著降低,表明機體凝血與纖溶平衡被打破,凝血亢進(jìn),導(dǎo)致各組小鼠均出現(xiàn)尾部血栓且0.06%劑量組小鼠在第6 天集中出栓,0.02%與0.04%劑量組小鼠出栓率較低,而0.10%與0.20%劑量組小鼠雖然全部出現(xiàn)尾栓但出栓時間太短,為急性血栓模型,因此,選擇0.06%角叉菜膠連續(xù)腹腔注射6 d 作為慢性血栓小鼠模型條件。

研究表明,腹腔注射角叉菜膠會引起大/小鼠腸道炎癥,大量炎癥介質(zhì)的生成與尾部血栓的形成密切相關(guān)[10-11]。0.06%、0.08%、0.20%劑量組結(jié)腸組織、血液中IL-1β、TNF-α 含量均顯著升高,IL-10含量均顯著降低。另外,血管內(nèi)皮細(xì)胞(vascular endothelial cells,VECs)在血栓形成過程中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用,VECs 通常處于兩種狀態(tài):靜止?fàn)顟B(tài)、激活狀態(tài);靜止?fàn)顟B(tài)的VECs 具有抗血栓作用,當(dāng)局部組織炎癥并釋放的大量炎性介質(zhì)(IL-1β,TNF-α等)可激活VECs,使其抗黏附、抗凝功能將轉(zhuǎn)變?yōu)榇兖じ?、促聚集的功?從而破壞VECs 維持的血凝與纖溶之間的平衡狀態(tài),最終促進(jìn)血栓形成[12]。炎癥與氧化應(yīng)激常伴隨發(fā)生,炎癥、氧化應(yīng)激可導(dǎo)致組織、 細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生大量活性氧(reactive oxide species,ROS),ROS 蓄積將引起血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷;還可促進(jìn)免疫細(xì)胞(單核細(xì)胞、T 淋巴細(xì)胞、肥大細(xì)胞等)的趨化、聚集并釋放大量炎性因子,加劇血管內(nèi)壁的炎癥反應(yīng)[12]。0.06%、0.08%、0.20%劑量組結(jié)腸組織、血液中抗氧化酶(SOD,GSH-Px)活性均顯著降低,氧化產(chǎn)物(MDA)含量均顯著升高。綜上所述,角叉菜膠連續(xù)腹腔注射可引起腸道組織的炎癥、氧化應(yīng)激反應(yīng),炎癥介質(zhì)進(jìn)入血液循環(huán)系統(tǒng),激活VECs(或破壞結(jié)構(gòu)),從而導(dǎo)致小鼠尾部血栓。因此,角叉菜膠誘導(dǎo)的機體炎癥、氧化應(yīng)激反應(yīng)是小鼠尾部血栓形成的重要原因。

0.06%的角叉菜膠溶液連續(xù)腹腔注射6 d 可以建立慢性血栓小鼠模型,該模型形成時間長、尾部病變輕(黑尾長度短、顏色淺),為防治血栓相關(guān)藥物或療法(針刺、艾灸等)的研究提供了更加合適的動物模型。另外,除黑尾率、黑尾長度外,結(jié)合結(jié)腸組織、血液中炎癥、氧化應(yīng)激指標(biāo)變化及血凝四項檢查,可更好的評價藥物或療法的作用。值得注意的是,溫度能夠影響造模成功率,低溫可引起血管收縮、血液流速減慢,導(dǎo)致黑尾時間提前,而高溫則不易形成黑尾[1,13];劉彥霞等[3]研究發(fā)現(xiàn)濕度也是影響該模型的重要因素,濕度越高,黑尾出現(xiàn)時間越早。由于小鼠品種、個體差異及飼養(yǎng)環(huán)境不同,建議開展相關(guān)研究前進(jìn)行預(yù)實驗,確定最佳的藥物濃度及給藥時間。