易 杭 徐啟鐘 陳楨昌 歐仲越 謝曉桐 黃樂(lè)琪 朱曉琴

1 廣州醫(yī)科大學(xué)第二臨床學(xué)院(廣州 510045) 2 廣州醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)學(xué)院機(jī)能實(shí)驗(yàn)中心(廣州 510045)

近年來(lái)，酒精性肝病發(fā)病率在我國(guó)有明顯增多的趨勢(shì)，世界衛(wèi)生組織報(bào)告指出，全球每年因飲酒死亡的 280 萬(wàn)人中，中國(guó)男性占了一定的比例，對(duì)酒精的過(guò)度依賴已然成為了中國(guó)社會(huì)的嚴(yán)峻的問(wèn)題之一[1- 2]。

香芹酚( carvacrol，CAR) 是對(duì)異基甲苯的衍生物，它的生物效應(yīng)主要為抗菌和抗氧化[3- 4]。據(jù)報(bào)道，香芹酚對(duì)D-氨基半乳糖( D-Ga1N) 誘導(dǎo)的大鼠肝損傷及缺血再灌注肝損傷有保護(hù)作用[5]。香芹酚主要通過(guò)維持肝細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的完整性和維持肝細(xì)胞內(nèi)的氧化—抗氧化平衡，從而發(fā)揮保護(hù)作用。目前，對(duì)香芹酚的研究大多側(cè)重于探索其抗菌作用以及對(duì)其他器官的抗氧化作用，尚未發(fā)現(xiàn)有關(guān)香芹酚通過(guò)抗氧化應(yīng)激來(lái)發(fā)揮解酒護(hù)肝功效的報(bào)道。本研究擬通過(guò)小鼠實(shí)驗(yàn)，探討香芹酚的解酒護(hù)肝作用。

1 資料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料

香芹酚(濃度：99%，Macklin生產(chǎn))；陽(yáng)性對(duì)照藥：海王金樽片，深圳市海王健康科技發(fā)展有限公司。水飛薊賓(Macklin生產(chǎn)) ；56°紅星二鍋頭(北京紅星股份有限公司)。超氧化物歧化酶(SOD)測(cè)試盒、 丙二醛(MDA)測(cè)試盒(Elabscience公司)，BCA 蛋白定量測(cè)試盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組 SPF級(jí)KM種小鼠，健康，雄性，6～8周齡，購(gòu)自廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中 心。所有小鼠均遵循實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理學(xué)要求進(jìn)行飼養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)操作。飼養(yǎng)環(huán)境模擬自然晝夜條件，養(yǎng)殖3天后，隨機(jī)分成5組，每組8只，每只體質(zhì)量(24±2.0)g。①生理鹽水對(duì)照組：生理鹽水灌胃；②低劑量香芹酚組：10 mg/kg香芹酚灌胃；③中等劑量香芹酚組：20 mg/kg香芹酚灌胃；④高劑量香芹酚組：40 mg/kg香芹酚灌胃[6]。

1.2.2 醉酒最適濃度探索 SPF級(jí)KM種小鼠，雄性，40只，6～8周齡，養(yǎng)殖3天后，隨機(jī)分成5組。各組分別給予12 mL/kg,13 mL/kg,14 mL/kg,15 mL/kg,16 mL/kg的56°白酒灌胃，對(duì)照組給予等量的生理鹽水，觀察醉酒數(shù)量和死亡數(shù)量[7]。

1.2.3 小鼠防醉實(shí)驗(yàn) 生理鹽水對(duì)照組用等量的生理鹽水灌胃，香芹酚各組先以相應(yīng)劑量的香芹酚灌胃， 30 min后再以 56°白酒 ( 14 mL/kg) 灌胃處理，空白對(duì)照組給予等量生理鹽水。醉酒的指標(biāo)為翻正反射消失，記錄給藥時(shí)間、翻正反射消失時(shí)間，翻正反射恢復(fù)時(shí)間，醉酒潛伏期和醉酒時(shí)間。其中，翻正反射消失時(shí)間減去給藥時(shí)間為醉酒潛伏期；翻正反射恢復(fù)時(shí)間減去翻正消失時(shí)間為醉酒時(shí)間。

1.2.4 香芹酚對(duì)小鼠血液中的乙醇濃度 生理鹽水對(duì)照組用等量的生理鹽水灌胃，香芹酚各組先以相應(yīng)劑量的香芹酚灌胃， 30 min后再分別給予56°紅星二鍋頭( 14 mL/kg) 灌胃，生理鹽水對(duì)照組以等體積生理鹽水灌胃，以小鼠翻正反射消失作為醉酒指標(biāo)，1 h后眼球取血，通過(guò)重鉻酸鉀-分光光度計(jì)法測(cè)定血液乙醇濃度。取90%的硫酸和2%的重鉻酸鉀溶液，體積比為1:1，配備重鉻酸鉀酸性溶液2 mL，再加入0.3 mL含有乙醇的血液，100 ℃水浴加熱10 min，觀察顏色變化，在600 nm波長(zhǎng)測(cè)量吸光度。通過(guò)公式換算出血液乙醇濃度。

1.2.5 肝臟大體的的影響的探究 取出完整的肝組織，用濾紙吸干表面血漬，觀察肝臟大體，稱量肝臟重量，算出肝指數(shù)。

1.2.6 香芹酚的保肝作用研究 生理鹽水對(duì)照組用等量的生理鹽水灌胃，香芹酚各組先以相應(yīng)劑量的香芹酚灌胃， 水飛薊賓組以37.8 mg/kg灌胃，30 min后再以 56°白酒 ( 14 mL/kg) 灌胃，連續(xù)7天。各組小鼠末次灌胃1 h后，處死小鼠(頸椎脫臼法)，取出肝，用4 ℃的0.9%氯化鈉沖洗除肝表面的血液，制備10% 肝勻漿，分別用于 MDA 含量(TBA 法) 和 SOD檢測(cè)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用 SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理， 計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示， 組間比較采用單因素方差分析(ANOVA)，P<0.05為差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 最適的醉酒濃度探索

由此分析可得，最佳醉酒濃度為14 mL/kg。隨后實(shí)驗(yàn)中，小鼠攝入酒精濃度均為14 mL/kg。見(jiàn)表1。

表1酒精濃度對(duì)小鼠醉酒的影響

2.2 小鼠防醉實(shí)驗(yàn)

由表2可知，與生理鹽水對(duì)照組比較，香芹酚低中高劑量可小鼠延長(zhǎng)醉酒潛伏期(P<0.05)。與生理鹽水對(duì)照組相比，對(duì)減短醉酒時(shí)間不具作用(P>0.05)。

表2香芹酚對(duì)小鼠醉酒的預(yù)防作用

2.3 香芹酚對(duì)小鼠血液中的乙醇濃度的影響

由表3可知，香芹酚低中劑量組與生理鹽水對(duì)照組相比有差異(P<0.05)，其余各組與生理鹽水對(duì)照組相對(duì)比沒(méi)有差異。

表3 香芹酚對(duì)小鼠血液中的乙醇濃度的影響 (n=8)

2.4 香芹酚對(duì)小鼠肝臟大體的影響

實(shí)驗(yàn)表明，各濃度香芹酚均具有良好的護(hù)肝作用(P<0.05)。見(jiàn)表4。

表4香芹酚對(duì)小鼠肝臟大體的影響 (n=8)

2.5 香芹酚對(duì)小鼠肝組織的SOD，MDA含量的影響

實(shí)驗(yàn)表明，各濃度香芹酚可有效降低炎癥反應(yīng)，提高SOD含量，降低MDA活性。見(jiàn)表5。

表5 香芹酚對(duì)小鼠肝組織中SOD,MDA的影響(n=6)

3 討 論

飲酒過(guò)多會(huì)引起一系列的問(wèn)題，而對(duì)身體造成嚴(yán)重的威脅：飲酒會(huì)導(dǎo)致肝臟、腎臟、大腦等器官的炎癥。醉酒是指人體攝入過(guò)多的酒精，過(guò)多的酒精經(jīng)血液循環(huán)進(jìn)入大腦，造成的行為異常。

酒精進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)后，90%均需通過(guò)肝臟進(jìn)行氧化代謝[8]。在肝內(nèi)，酒精代謝為乙醛，乙醛在體內(nèi)蓄積，導(dǎo)致肝微粒體自由基產(chǎn)生增多，自由基能引起肝細(xì)胞損傷，從而引起氧化應(yīng)激[9-10]。造成肝細(xì)胞損傷。長(zhǎng)期地過(guò)量飲酒會(huì)導(dǎo)致酒精性脂肪肝，酒精性肝炎，肝硬化甚至是肝細(xì)胞癌。而目前市面上的解酒護(hù)肝藥主要通過(guò)加快酒精在體內(nèi)代謝而發(fā)揮作用。加快酒精在體內(nèi)代謝的機(jī)理包括加快肝臟中乙醇的氧化代謝、增強(qiáng)清除自由基的能力等[11]。

本文探討了不同劑量的香芹酚在實(shí)驗(yàn)條件下的解酒護(hù)肝效應(yīng)，實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，低、中、高劑量香芹酚能顯著延長(zhǎng)醉酒時(shí)間，而低、中劑量的香芹酚能降低血液中的乙醇濃度，進(jìn)而對(duì)醉酒小鼠有一定的解酒作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果充分表明，香芹酚對(duì)急性酒精性肝損傷小鼠具有較為顯著的解酒作用。但由于高劑量的香芹酚對(duì)降低血液中的乙醇濃度缺乏統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，該數(shù)據(jù)有待進(jìn)一步考究。實(shí)驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)，與生理鹽水對(duì)照組比較，香芹酚組能夠減輕酒精對(duì)小鼠肝細(xì)胞的損傷，顯著降低肝組織中MDA，但低、中、高濃度之間缺乏統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，該數(shù)據(jù)有待進(jìn)一步考究；肝組織中SOD活性明顯增高，低、中、高濃度之間缺乏統(tǒng)計(jì)學(xué)差異間，該數(shù)據(jù)有待進(jìn)一步考究。由此可見(jiàn)，香芹酚有一定的解酒護(hù)肝作用。但目前香芹酚在酒精性肝損傷的小鼠中的解酒護(hù)肝作用尚不明確。有文獻(xiàn)表明，香芹酚具有良好的抗氧化活性以及清除自由基的能力[12]，香芹酚對(duì) D-氨基半乳糖( D-Ga1N) 誘導(dǎo)的大鼠肝損傷具有明顯保護(hù)作用。另有實(shí)驗(yàn)證明，香芹酚對(duì)缺血再灌注肝損傷也有保護(hù)作用，而香芹酚對(duì)肝損傷的保護(hù)作用與其維持肝細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的完整性和肝臟的氧化—抗氧化平衡有關(guān)[13]。因此，我們推測(cè)，香芹酚主要是通過(guò)抗氧化活性、清除氧自由基來(lái)降低醉酒反應(yīng)、保護(hù)肝臟，這為香芹酚作為解酒護(hù)藥提供一定理論支撐。