葛建麗 劉敏潔 徐更田 趙 曉 何好超

甲狀腺癌為臨床常見惡性腫瘤，發(fā)生率約占全身惡性腫瘤的1%。超聲為篩查最常見方式，常規(guī)二維超聲檢查能夠有效檢出甲狀腺結(jié)節(jié)，但對結(jié)節(jié)性質(zhì)的評估價值有限[1-2]。超聲造影作為新興定量超聲檢查技術(shù)，可實施評估目標組織器官血流情況，并判斷其功能狀態(tài)及性質(zhì)，明顯提高超聲診斷的分辨力、敏感性和特異性[3]。相關(guān)研究指出，近年來超聲造影發(fā)展迅速，可評價腫瘤內(nèi)微血管灌注情況，超聲造影定量參數(shù)可用于腫塊良惡性鑒別，在甲狀腺良惡性結(jié)節(jié)鑒別方面的應用逐漸增加[4]。此外，有研究指出，明確惡性腫瘤惡性生物學行為有助于開展針對性干預措施，從而改善患者預后[5]?；诖?，本研究在探究超聲造影參數(shù)對甲狀腺癌的診斷價值基礎上，進一步研究其與病灶組織惡性生物學行為的內(nèi)在聯(lián)系，報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2016年8月至2019年7月我院117例接受超聲造影檢查的甲狀腺結(jié)節(jié)患者，根據(jù)細針穿刺活檢結(jié)果判斷結(jié)節(jié)良惡性，其中良性76例作為對照組，惡性41例作為研究組。對比2組一般資料，差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 2組一般資料對比

1.2 選例標準

納入標準：①均行超聲造影檢查；②無超聲造影檢查禁忌；③均經(jīng)細針穿刺活檢確診；④無甲狀腺手術(shù)史；⑤既往未接受相關(guān)治療；⑥患者及家屬知曉本研究，已簽署同意書。

排除標準：①合并其他惡性腫瘤者；②精神疾病患者；③伴有全身感染性疾病者；④嚴重心腦血管疾病患者；⑤肺結(jié)核、乙肝等傳染性疾病患者；⑥血液系統(tǒng)疾病患者；⑦肝腎功能嚴重障礙者；⑧妊娠或哺乳期女性；⑨不能配合完成研究者。

1.3 方法

超聲造影檢查：采用美國GE公司生產(chǎn)的Voluson E8超聲儀，探頭頻率5.0～12.0 MHz?；颊咂教?，首先對頸部、甲狀腺及其周圍行二維超聲檢查，從縱橫斜多切面掃查，觀察并記錄結(jié)節(jié)位置、大小、邊界等基本情況，作出超聲造影檢查前初步診斷，切換至超聲造影模式。采用注射器抽取2 ml超聲造影劑，經(jīng)肘部淺靜脈快速推注，隨后采用5 ml生理鹽水沖管。檢查時探頭及患者應保持不動，持續(xù)觀察3 min以上。選取感興趣區(qū)域并采用軟件獲取時間-強度曲線，定量分析并獲取超聲造影參數(shù)，包括曲線下面積(area under the curve，AUC)、達峰時間(time to peak，TTP)、平均通過時間(mean transit time，MTT)、峰值強度(Peak)。

癌細胞惡性生物學特征檢查：經(jīng)細針穿刺采集所有患者治療組織標本，采用實時熒光定量PCR(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)法檢測目標基因表達量，首先采用磷酸緩沖鹽溶液清洗標本組織，然后行組織碾磨、細胞裂解、總RNA沉淀、清洗干燥、RNA純度測定、樣品cDNA合成、目標基因合成。目標基因包括血管新生基因表達量[血管內(nèi)皮生長因子(vascular epithelial growth factor，VEGF)、中樞性黏液表皮樣瘤(central mucoepidermoid tumor，c-met)、缺氧誘導因子α(hypoxia inducible factorα，HIF-α)]，侵襲基因表達量[趨化因子受體4(chemokine receptor 4，CXCR4)、特異結(jié)合蛋白1(special AT rich sequence binding protein 1，SATB1)、金屬蛋白酶解離素9(A disintegrin and metalloproteinase 9，ADAM9)]，增殖基因表達量[蛋白磷酸酶4調(diào)節(jié)亞基1(protein phosphatase 4 regulates subunit 1，PP4R1)、靶向Xklp2靶蛋白(Targeting protein for Xklp2，TPX2)、線粒體促凋亡蛋白(second mitochondria-derived activator of caspase，Smac)]及自噬基因表達量[Beclin1蛋白(Beclin1)、磷酸酶張力蛋白樣同源物(tension protein analogue，PTEN)、小ras同源蛋白Ⅰ(A ras homologue member Ⅰ，ARHⅠ)]，應用公式2-ΔΔct進行定量分析。

1.4 觀察指標

(1)2組超聲造影參數(shù)(AUC、TTP、Peak、MTT)。(2)探究AUC、TTP、Peak、MTT對甲狀腺癌的診斷價值。(3)2組病灶組織中血管新生基因表達量(VEGF、c-met、HIF-α)。(4)2組病灶組織中增殖基因表達量(PP4R1、TPX2、Smac)。(5)2組病灶組織中侵襲基因表達量(CXCR4、SATB1、ADAM9)。(6)2組病灶組織中自噬基因表達量(Beclin1、PTEN、ARHI)。(7)探究超聲造影參數(shù)與病灶組織中血管新生、增殖、侵襲及自噬基因表達的相關(guān)性。

1.5 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

2.1 2組超聲造影參數(shù)

研究組AUC、TTP、Peak、MTT均較對照組低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 2組超聲造影參數(shù)對比

2.2 ROC分析超聲造影參數(shù)對甲狀腺癌的診斷價值

分別繪制AUC、TTP、Peak、MTT單一、聯(lián)合診斷甲狀腺癌的ROC曲線，顯示各指標聯(lián)合診斷甲狀腺癌的AUC為0.894(95%CI為0.823～0.943)，高于AUC、TTP、Peak、MTT單一預測的AUC 0.792(95%CI為0.707～0.862)、0.814(95%CI為0.732～0.880)、0.803(95%CI為0.720～0.871)、0.788(95%CI為0.702～0.858)，聯(lián)合診斷甲狀腺癌的最佳敏感度為80.49%，特異度為85.53%。見圖1。

圖1 ROC分析單一及聯(lián)合超聲造影參數(shù)對甲狀腺癌的診斷價值

2.3 2組病灶組織中血管新生基因表達量

研究組VEGF、c-met、HIF-α基因表達量均較對照組高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；研究組PP4R1、Smac基因表達量較對照組低，TPX2基因表達量較對照組高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；研究組CXCR4、SATB1、ADAM9基因表達量較對照組高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；研究組Beclin1、PTEN、ARHⅠ基因表達量較對照組低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表3。

表3 2組病灶組織中血管新生基因表達量對比

2.4 超聲造影參數(shù)與病灶組織中血管新生、增殖、侵襲及自噬基因表達的相關(guān)性分析

超聲造影參數(shù)AUC、TTP、Peak、MTT與病灶組織中癌細胞惡性生物學特征標志物VEGF、c-met、HIF-α、TPX2、CXCR4、SATB1、ADAM9基因表達量呈負相關(guān)關(guān)系，與PP4R1、Smac、Beclin1、PTEN、ARHⅠ基因表達量呈正相關(guān)關(guān)系(P<0.05)。見表4。

表4 超聲造影參數(shù)與病灶組織中血管新生、增殖、侵襲及自噬基因表達的相關(guān)性分析

3 討論

3.1 研究背景

目前，細針穿刺活檢為臨床鑒別甲狀腺結(jié)節(jié)良惡性的“金標準”，但屬于有創(chuàng)檢查，臨床應用具有一定局限性[6]。二維超聲是篩查甲狀腺結(jié)節(jié)的首選影像學方法，可清晰反映甲狀腺結(jié)節(jié)數(shù)量、位置、與周邊組織的關(guān)系等，但部分惡性結(jié)節(jié)超聲表現(xiàn)復雜，存在一定的交叉、重疊，致使二維超聲在具體結(jié)節(jié)良惡性鑒別中存在一定局限性，因此漏診、誤診率較高[7]。近年來，超聲造影技術(shù)得到長足進步，在甲狀腺結(jié)節(jié)良惡性鑒別中的作用越來越受臨床重視。

3.2 超聲造影鑒別甲狀腺結(jié)節(jié)良惡性的價值

超聲造影是利用造影劑反映、觀察組織的血流灌注情況的技術(shù)方法，通過導管將造影劑注入淺靜脈，根據(jù)惡性腫瘤內(nèi)部血供豐富的特征，造影劑流經(jīng)病灶血管可發(fā)生參數(shù)水平異常，不同性質(zhì)的腫瘤時間-強度曲線存在顯著差異，這是超聲造影技術(shù)鑒別腫塊良惡性的主要機制[8]。汪彩英等[9]研究選取178例甲狀腺結(jié)節(jié)患者作為研究對象，經(jīng)超聲造影檢查發(fā)現(xiàn)甲狀腺癌組患者的超聲造影參數(shù)AUC、Peak水平低于甲狀腺良性結(jié)節(jié)組。蒙秋鳳[10]通過對218例接受甲狀腺結(jié)節(jié)切除術(shù)的患者的研究，也發(fā)現(xiàn)超聲造影在甲狀腺良惡性鑒別方面具有良好效果，甲狀腺癌組患者TTP、MTT水平低于甲狀腺腺瘤組患者。本研究結(jié)果中，惡性甲狀腺結(jié)節(jié)患者的超聲造影參數(shù)AUC、TTP、Peak、MTT均顯著低于良性甲狀腺結(jié)節(jié)患者，與上述研究結(jié)果一致，分析其原因在于：惡性甲狀腺結(jié)節(jié)內(nèi)新血管多，且通透性高、排列雜亂，造影劑流過時阻力較大，直接導致超聲造影參數(shù)降低[11]。且本研究進一步通過ROC曲線分析發(fā)現(xiàn)，AUC、TTP、Peak、MTT在甲狀腺癌診斷方面均具有較高應用價值，尤其是各參數(shù)聯(lián)合診斷，AUC高達0.894，大于超聲造影各參數(shù)單一診斷，聯(lián)合診斷的最佳敏感度為80.49%，特異度為85.53%，診斷效能得到良好改善，有助于甲狀腺癌患者的早期診斷及治療，應用價值非常高。

3.3 超聲造影參數(shù)與惡性結(jié)節(jié)惡性生物學特征的關(guān)系

近年來大量研究指出，病灶內(nèi)新血管生成是惡性腫瘤增殖的基礎[12-13]。VEGF作為促進血管新生的主要因子，參與腫瘤血管生成的特異性非常高，且作用強，被認為是惡性腫瘤“血管生成開關(guān)”[14]。c-met是一種膜受體，能識別肝細胞生長因子并與之結(jié)合，發(fā)揮促進血管新生的作用[15]。HIF-α是乏氧相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子，在調(diào)節(jié)腫瘤細胞對缺氧環(huán)境適應性方面具有重要作用，其表達增加可促進腫瘤增殖，也可反映腫瘤內(nèi)部微血管密度[16]。SATB1是調(diào)節(jié)眾多腫瘤細胞侵襲轉(zhuǎn)移的基因，具有上調(diào)金屬蛋白酶表達、促進炎性因子表達的作用，同時能刺激PI3K/Akt信號通路激活，增強腫瘤細胞的遷移侵襲能力[17]。CXCR4由骨髓基質(zhì)細胞及相關(guān)間皮細胞分泌，與特異性配體結(jié)合后可直接參與腫瘤細胞的增殖、浸潤、轉(zhuǎn)移，李魯申[18]、李劍[19]研究均證實其在惡性腫瘤中呈異常高表達狀態(tài)。ADAM9是一種金屬蛋白酶解離素，可降解細胞基質(zhì)，促進細胞接觸，具有促進腫瘤細胞侵襲轉(zhuǎn)移的作用[20]。PP4R1參與DNA修復、細胞應激等多種重要的細胞進程，其表達降低可激活IκB激酶，并促進腫瘤細胞增殖[21]。Smac為促凋亡因子，可解除凋亡抑制蛋白對caspase-3、7、9等的抑制作用，從而抑制腫瘤細胞增殖[22]。楊忠信等[23]報道指出，TPX2在紡錘體組裝及形成過程中發(fā)揮重要作用，TPX2異常高表達可促進腫瘤細胞染色體基因異常、擴增等。本次研究發(fā)現(xiàn)，惡性甲狀腺結(jié)節(jié)患者VEGF、c-met、HIF-α、CXCR4、SATB1、ADAM9及TPX2基因表達量均高于良性結(jié)節(jié)患者，PP4R1、Smac基因表達量低于良性結(jié)節(jié)患者，提示惡性甲狀腺結(jié)節(jié)內(nèi)存在血管新生旺盛，腫瘤細胞的侵襲、增殖能力高。進一步經(jīng)相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，惡性甲狀腺結(jié)節(jié)患者超聲造影參數(shù)與病灶組織中VEGF、c-met、HIF-α、TPX2、CXCR4、SATB1、ADAM9基因表達量呈負相關(guān)，與PP4R1、Smac基因表達量呈正相關(guān)，提示超聲造影參數(shù)不僅能鑒別甲狀腺腫瘤良惡性，同時有助于評估腫瘤內(nèi)血管新生、侵襲和增殖能力。有報道指出，腫瘤細胞的自噬作用是其能動過程，是通過自噬泡內(nèi)溶酶體溶解變性、壞死細胞器的過程，自噬過程發(fā)生異常是導致腫瘤發(fā)生的主要因素之一[24]。Beclin1是近年來新發(fā)現(xiàn)的抑癌基因，其表達增加可發(fā)揮促進癌細胞凋亡及去分化作用，且能加速腫瘤細胞自噬，調(diào)節(jié)其他蛋白定位至自噬前體，促進自噬體的形成[25]。PTEN、ARHⅠ均為臨床常見抑癌基因，PTEN具有雙特異磷酸酶活性，主要通過促進自噬體形成發(fā)揮抑制腫瘤發(fā)生發(fā)展的作用，ARHⅠ在惡性腫瘤細胞內(nèi)的表達較低或缺失能導致自噬過程受阻[26]。本研究發(fā)現(xiàn)，惡性甲狀腺結(jié)節(jié)患者的Beclin1、PTEN、ARHⅠ基因表達量顯著降低，且與甲狀腺癌患者超聲造影參數(shù)呈正相關(guān)關(guān)系，充分表明惡性甲狀腺結(jié)節(jié)內(nèi)存在自噬障礙，通過超聲造影檢查可在一定程度上反映出自噬障礙程度。

綜上可知，超聲造影參數(shù)在甲狀腺癌診斷中具有較高應用價值，且能指導臨床評估癌細胞惡性生物學特征，具有較高臨床應用價值。