鄧 潔 羅劍波 彭 聰 鄧曉楊

腫瘤研究領(lǐng)域內(nèi)的著名學(xué)者Hanahan于2011年在Cell雜志撰寫綜述，對腫瘤細(xì)胞的十項(xiàng)最主要特征進(jìn)行了總結(jié)，其中包括腫瘤細(xì)胞代謝的異常改變，即代謝重編程[1]。大量研究證實(shí)，代謝重編程與腫瘤的發(fā)生與發(fā)展高度相關(guān)[2-3]。由于腫瘤在快速分裂增殖時(shí)，新生血管往往相對滯后，當(dāng)腫瘤體積不斷增大時(shí)內(nèi)部常出現(xiàn)營養(yǎng)缺乏的慢性微環(huán)境，腫瘤細(xì)胞在營養(yǎng)缺乏環(huán)境中存活的機(jī)制一直是腫瘤代謝研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)問題[4]。目前研究發(fā)現(xiàn)，營養(yǎng)缺乏首先會(huì)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生能量應(yīng)激，此時(shí)腫瘤細(xì)胞通過使原有代謝特征發(fā)生轉(zhuǎn)變，由非能量應(yīng)激狀態(tài)時(shí)的合成代謝轉(zhuǎn)變?yōu)槟芰繎?yīng)激時(shí)的分解代謝，通過分解細(xì)胞內(nèi)糖類、脂類、蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)，對營養(yǎng)缺乏時(shí)的能量危機(jī)做出適應(yīng)性反應(yīng)[5-6]。

人肉毒堿棕櫚?；D(zhuǎn)移酶1A(carnitine palmitoyltransferase 1A,CPT1A)是定位于線粒體內(nèi)膜參與脂肪酸氧化調(diào)控的關(guān)鍵酶，它負(fù)責(zé)將細(xì)胞漿中的脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)至線粒體內(nèi)進(jìn)行后續(xù)的脂肪酸氧化[7]。然而目前，作為參與脂肪酸氧化調(diào)控的重要酶，CPT1A在能量應(yīng)激時(shí)腫瘤細(xì)胞存活中的作用卻尚不清楚。本項(xiàng)目將首次分析CPT1A在卵巢癌細(xì)胞能量應(yīng)激時(shí)的表達(dá)變化及其在細(xì)胞生存中的調(diào)控作用。

1 材料與方法

1.1 材料

人卵巢癌細(xì)胞SKOV3購于ATCC細(xì)胞庫，細(xì)胞采用含10%胎牛血清(四季青生物)的RPMI-1640培養(yǎng)基(上海生工生物)培養(yǎng)，培養(yǎng)箱含5% 濃度的CO2，溫度設(shè)定為37 ℃。

細(xì)胞能量應(yīng)激建模方法：采用HBSS平衡鹽溶液饑餓法作為能量應(yīng)激建模策略。首先，棄去細(xì)胞中RPMI-1640培養(yǎng)液，用商品化的HBSS平衡鹽溶液(Thermo Fisher公司，貨號14025076)將細(xì)胞洗滌2次后加入HBSS繼續(xù)培養(yǎng)3 h或6 h。

1.2 實(shí)驗(yàn)步驟與方法

1.2.1 qRT-PCR 首先，用商品化的RNA提取試劑盒(OMEGA公司，貨號R6688)提取細(xì)胞中總RNA。之后，將所提RNA用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TAKARA公司，貨號RR037A)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。目的基因CPT1A與內(nèi)參基因GAPDH的PCR引物由華大基因合成，CPT1A引物序列為：上游5'-ATGCGCTACTCCCTGAAAGTG-3'，下游5'-GTGGCACGACTCATCTTGC-3'。GAPDH序列為：5'-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3，5'-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3'。最后，采用2-△△Ct法對各組細(xì)胞中CPT1A相對表達(dá)水平進(jìn)行計(jì)算。

1.2.2 Western Blot 首先，用RIPA蛋白裂解液裂解卵巢癌細(xì)胞并提取細(xì)胞總蛋白，BAC法對蛋白濃度進(jìn)行測定后加入2×上樣緩沖液并置于沸水中煮沸5 min。隨后，用加樣器將各組細(xì)胞蛋白加入聚丙烯酰胺凝膠各孔中并進(jìn)行電泳。第一階段電泳采用90 V恒壓，待樣品進(jìn)入分離膠后將電壓增大至120 V，溴酚藍(lán)被電泳至凝膠底部時(shí)即可停止電泳。隨后用濕轉(zhuǎn)法將凝膠中蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，用5%脫脂奶粉室溫封閉1 h后，分別加入用封閉液稀釋過的CTP1A與GAPDH抗體于4 ℃反應(yīng)過夜，TPBS洗膜3次后加入二抗并在室溫下繼續(xù)反應(yīng)1.5 h，繼續(xù)用TPBS洗膜3次后用化學(xué)發(fā)光法對最終條帶進(jìn)行檢測。

1.2.3 siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞 首先，合成靶向CPT1A的RNA干擾片段與無關(guān)對照片段(Qiagen公司)。siRNA轉(zhuǎn)染步驟為：首先，于轉(zhuǎn)染前一日將細(xì)胞以1.5×105個(gè)/孔的密度接種至6孔板中，采用脂質(zhì)體lip2000作為介質(zhì)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。隨后，用無血清培養(yǎng)基分別稀釋siRNA片段與lip2000，放置5 min后將兩種稀釋液混和，混合液放置25 min后即可加入6孔板中(每孔100 μl)，細(xì)胞置于孵箱中培養(yǎng)6 h后即可更換含血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

1.2.4 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡 首先，按上步所述方法對卵巢癌細(xì)胞中CPT1A表達(dá)進(jìn)行干涉處理，用胰蛋白酶消化并離心收集細(xì)胞，PBS洗滌兩次后按試劑盒操作說明(US Everbright lnc 公司，貨號Y6026)對各組卵巢癌細(xì)胞進(jìn)行Annexin V與PI染色，染色結(jié)束后即可上流式細(xì)胞儀進(jìn)行各組細(xì)胞的凋亡分析。

1.2.5 細(xì)胞氧耗速率分析 首先，按上步所述方法對卵巢癌細(xì)胞中CPT1A表達(dá)干涉，用胰蛋白酶消化并離心收集細(xì)胞。細(xì)胞氧耗速率分析采用液相氧電極(英國漢莎公司)。首先，對陽極與陰極電極進(jìn)行認(rèn)真清洗，清洗過后按先陽性后陰性的順序依次連接電極，連接完畢后打開電腦軟件并對電極進(jìn)行校正，隨后建立“零氧線”并依次加入各組細(xì)胞并進(jìn)行氧耗速率測定。

1.2.6 胞內(nèi)ATP檢測 首先，按上步所述方法對卵巢癌細(xì)胞中CPT1A表達(dá)干涉，用胰蛋白酶消化并離心收集細(xì)胞，隨后用ATP檢測試劑盒(碧云天生物公司，貨號S0026)中提供的ATP檢測裂解液對細(xì)胞進(jìn)行裂解并將裂解液于4 ℃條件下12 000 g離心5 min。最后，按試劑盒操作說明對各組細(xì)胞中ATP進(jìn)行檢測。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件對結(jié)果進(jìn)行分析，采用單因素方差分析對2組間差異進(jìn)行分析，P<0.05時(shí)認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 能量應(yīng)激可誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞中CPT1A表達(dá)上調(diào)

分別對卵巢癌細(xì)胞SKOV3進(jìn)行HBSS培養(yǎng)3 h與6 h，利用qRT-PCR與western blot方法檢測CPT1A表達(dá)后發(fā)現(xiàn)(圖1)：HBSS饑餓處理后，SKOV3細(xì)胞中CPT1A表達(dá)在mRNA與蛋白水平均顯著升高；隨HBSS饑餓處理時(shí)間由3 h延長到6 h，CPT1A表達(dá)呈逐步升高趨勢。表明能量應(yīng)激可上調(diào)CPT1A表達(dá)，且呈時(shí)間依賴效應(yīng)。

注：A:qRT-PCR實(shí)驗(yàn)分析；B:Western Blot實(shí)驗(yàn)分析。圖1 能量應(yīng)激(HBSS處理)對卵巢癌細(xì)胞中CPT1A表達(dá)的影響

2.2 下調(diào)CPT1A可加重饑餓誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡

為研究CPT1A在能量應(yīng)激時(shí)卵巢癌細(xì)胞生存中的調(diào)控作用，我們首先合成了靶向CPT1A的siRNA干涉片段(si-CPT1A)，將其轉(zhuǎn)染SKOV3細(xì)胞并利用qRT-PCR與western blot對干涉效率進(jìn)行檢測后發(fā)現(xiàn)(圖2A與2B)：我們合成的siRNA可顯著下調(diào)SKOV3細(xì)胞中CPT1A表達(dá)。

注：A:qRT-PCR實(shí)驗(yàn)分析；B:Western Blot實(shí)驗(yàn)分析。圖2 siRNA下調(diào)卵巢癌SKOV3中CPT1A表達(dá)的效率分析

隨后，我們利用流式細(xì)胞術(shù)，分析了下調(diào)CPT1A對饑餓處理時(shí)卵巢癌細(xì)胞存活的影響，結(jié)果如圖3所示：用siRNA下調(diào)CPT1A表達(dá)后，饑餓誘導(dǎo)的卵巢癌細(xì)胞凋亡被顯著增強(qiáng)，表明CPT1A具有抑制能量應(yīng)激時(shí)卵巢癌細(xì)胞凋亡的作用。

注：A為典型凋亡檢測結(jié)果；B為統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果。圖3 流式細(xì)胞術(shù)分析下調(diào)CPT1A對卵巢癌細(xì)胞凋亡的影響

2.3 下調(diào)CPT1A可降低饑餓時(shí)卵巢癌細(xì)胞的氧耗與ATP生成

為初步探討CPT1A是否通過增強(qiáng)脂肪酸氧化與能量ATP產(chǎn)生，進(jìn)而發(fā)揮保護(hù)能量應(yīng)激時(shí)卵巢癌細(xì)胞凋亡，我們進(jìn)一步分析了下調(diào)CPT1A表達(dá)對能量應(yīng)激時(shí)卵巢癌細(xì)胞氧氣消耗速率與能量ATP產(chǎn)生的影響，結(jié)果如圖4與圖5所示：用siRNA下調(diào)CPT1A表達(dá)后，能量應(yīng)激時(shí)卵巢癌細(xì)胞的氧氣消耗速率與能量ATP產(chǎn)生均顯著降低，提示下調(diào)CPT1A可能通過抑制脂肪酸氧化而加重饑餓時(shí)細(xì)胞的凋亡。

圖4 下調(diào)CPT1A對能量應(yīng)激時(shí)卵巢癌細(xì)胞氧耗速率的影響

圖5 下調(diào)CPT1A對能量應(yīng)激時(shí)卵巢癌細(xì)胞ATP生成的影響

3 討論

代謝重編程是腫瘤細(xì)胞新的十大特征之一，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，促進(jìn)代謝重編程發(fā)生的分子機(jī)制是目前腫瘤研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)[8]。腫瘤細(xì)胞具有異?？焖俜至言鲋车奶匦?，而與之相比，腫瘤的血管新生則相對滯后，常導(dǎo)致實(shí)體腫瘤內(nèi)部出現(xiàn)慢性營養(yǎng)缺乏微環(huán)境，腫瘤細(xì)胞克服營養(yǎng)缺乏微環(huán)境得以存活的機(jī)制是該腫瘤代謝領(lǐng)域的重要科學(xué)問題之一[4,9]。目前觀點(diǎn)認(rèn)為，營養(yǎng)缺乏時(shí)腫瘤細(xì)胞主要通過使原有代謝特征發(fā)生轉(zhuǎn)變，由以合成代謝為主轉(zhuǎn)變?yōu)橐匝趸纸獯x為主，通過氧化分解胞內(nèi)糖、脂等生物大分子，對營養(yǎng)缺乏做出適應(yīng)性反應(yīng)[10]。然而，哪些關(guān)鍵代謝酶介導(dǎo)了能量應(yīng)激時(shí)腫瘤細(xì)胞代謝重編程并促進(jìn)細(xì)胞存活尚不十分清楚。

CPT1A是參與細(xì)胞脂肪酸氧化調(diào)控的關(guān)鍵酶，負(fù)責(zé)將細(xì)胞漿中的游離脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)至線粒體進(jìn)行后續(xù)的氧化[7]。近年來，CPT1A被證實(shí)與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展相關(guān)。如Wang等研究發(fā)現(xiàn)，CPT1A介導(dǎo)的脂肪酸氧化可促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞的侵襲與轉(zhuǎn)移能力[11]。此外，Xiong等研究證實(shí)，CPT1A被證實(shí)可通過調(diào)控血管內(nèi)皮生長因子VEGF而促進(jìn)乳腺癌的淋巴管生成[12]。Shi等在急性白血病中研究發(fā)現(xiàn)，CPT1A表達(dá)與患者預(yù)后顯著相關(guān)，高表達(dá)患者具有較差的預(yù)后[13]。Tan等證實(shí)，通過RNA下調(diào)CPT1A可增強(qiáng)鼻咽癌對放療的敏感性[14]。我們研究證實(shí)，CPT1A在能量應(yīng)激時(shí)表達(dá)顯著上調(diào)，下調(diào)CPT1A可加重饑餓誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，表明CPT1A具有促進(jìn)能量應(yīng)激時(shí)腫瘤細(xì)胞存活的作用。因此，上述研究共同表明，CPT1A是一個(gè)重要的促癌基因，不但能在正常情況下促進(jìn)腫瘤進(jìn)展，也可在應(yīng)激條件下促進(jìn)腫瘤細(xì)胞存活。

CPT1A是重要的脂肪酸氧化調(diào)控酶，CPT1A發(fā)揮促能量應(yīng)激時(shí)腫瘤細(xì)胞存活是否是通過促進(jìn)脂肪酸氧化呢？為回答以上問題，我們對兩個(gè)最主要的細(xì)胞氧化代謝指標(biāo)(細(xì)胞氧氣消耗速率與ATP生成)進(jìn)行了分析并發(fā)現(xiàn)：下調(diào)CPT1A表達(dá)后，能量應(yīng)激時(shí)卵巢癌細(xì)胞的氧氣消耗速率與能量ATP產(chǎn)生均顯著降低，表明CPT1A極可能是通過激活脂肪酸氧化而促進(jìn)能量應(yīng)激時(shí)卵巢癌細(xì)胞的存活。與我們結(jié)果類似，Sang-Min等的研究同樣證實(shí)，增強(qiáng)的脂肪酸氧化可促進(jìn)能量應(yīng)激時(shí)腫瘤細(xì)胞的存活[15]。該研究發(fā)現(xiàn)能量應(yīng)激可激活細(xì)胞內(nèi)能量感受器AMPK(AMP-activated protein kinase)，后者進(jìn)一步磷酸化活化參與脂肪酸氧化第一步反應(yīng)調(diào)控的關(guān)鍵酶ACC1(Acetyl-CoA carboxylas 1)活性，進(jìn)而激活細(xì)胞內(nèi)脂肪酸氧化，最終促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞的存活。上述結(jié)果共同提示：激活脂肪酸氧化是能量應(yīng)激時(shí)腫瘤細(xì)胞存活的重要機(jī)制。

本研究首次在卵巢癌證實(shí)，能量應(yīng)激時(shí)CPT1A表達(dá)顯著上調(diào)，進(jìn)一步通過促進(jìn)脂肪酸氧化與ATP生成而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞存活。提示CPT1A是治療卵巢癌的潛在分子靶標(biāo)。