姚菲菲 王 軍 何愛萍

肺癌(lung cancer)是發(fā)病率、致死率最高的惡性腫瘤之一，位于全球癌癥致死率的首位，其不同類型中非小細胞肺癌(non small cell lung cancer,NSCLC)最為常見，占肺癌總量的85%左右[1]。因缺乏早期診斷的分子標記，多數患者確診時已發(fā)展至中晚期，癌細胞發(fā)生了侵襲及轉移。因此，開展肺癌發(fā)生發(fā)展的機制研究，找尋新的診斷及治療靶點對肺癌的臨床治療具有重要意義。近年來研究發(fā)現(xiàn)[2-3]，長鏈非編碼RNA(LncRNA)通過多種途徑參與基因表達的調控，多種LncRNA在腫瘤中均異常表達，可作為腫瘤潛在治療靶點及預后標志物。最新研究發(fā)現(xiàn)HOX基因家族在胚胎發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用，并通過鑒定分析于12號染色體的HOXC基因位點發(fā)現(xiàn)了HOTAIR[4]。據相關研究報道[5-6]，HOTAIR在乳腺癌、宮頸癌等眾多腫瘤中高表達，下調HOTAIR表達后可顯著抑制腫瘤細胞的生長，加快其凋亡速率，且可增加化療藥物的敏感性，提示HOTAIR可作為惡性腫瘤臨床診斷及治療的新靶點。但目前有關HOTAIR在肺癌中的研究相對較少，因此本研究就LncRNA HOTAIR在NSCLC中的表達及作用機制進行了探究，以期為NSCLC的治療及研究提供新的方向和目標。

1 材料與方法

1.1 實驗細胞、試劑、儀器

實驗所用人類非小細胞肺癌細胞系A549、H460、H1650及正常肺組織細胞HBE均購自中國科學院上海細胞庫，于含10%胎牛血清的培養(yǎng)基中接種，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱孵育培養(yǎng)。主要試劑及儀器：DMEM細胞培養(yǎng)基、RPMI1640培養(yǎng)基購自美國Gibco公司；胎牛血清(FBS)購自美國Hyclone實驗室；胰蛋白酶消化液、LipofectamineTM2000轉染試劑購自美國 Invitrogen公司；siRNA由GenePharma公司合成；β-actin購自美國Sigma公司；逆轉錄試劑盒、PCR Master Mix購自TAKARA有限公司；6/24/96細胞培養(yǎng)孔板、Transwell小室購自美國Corning公司；CCK-8試劑盒購自日本Dojindo公司；酶標儀、PCR儀購自美國 Bio-RAD公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞復蘇、培養(yǎng)、傳代 細胞復蘇與培養(yǎng)：于液氮中取出凍存管，37 ℃水浴箱溶解，離心棄上清加入含10%胎牛血清培養(yǎng)基重懸沉淀物，后加入含9 ml細胞培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱恒溫培養(yǎng)，每隔2天更換培養(yǎng)基一次，密切觀察細胞生長情況。細胞傳代：待細胞生長密度達到80%～90%時取出培養(yǎng)皿，PBS液清洗，加入胰酶，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中觀察細胞消化狀態(tài)，見細胞浮立時吸除多余胰酶，加入細胞培養(yǎng)液，離心制成細胞懸液分裝至3個培養(yǎng)皿，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱恒溫培養(yǎng)；后行細胞凍存處理，待進行后續(xù)實驗。

1.2.2 引物設計、siRNA序列合成及轉染 引物設計：通過美國國立生物信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)數據庫檢索HOTAIR核酸序列。利用引物設計軟件Primer5，根據siRNA設計原則進行HOTAIR及內參β-actin的核酸引物序列設計，由GenePharma公司合成，于-20 ℃保存。核酸引物序列如下(表1)。

表1 HOTAIR及內參β-actin核酸引物序列

siRNA序列合成：由GenePharma公司設計、合成3條 HOTAIR-siRNA干擾序列 和1條陰性對照NC-siRNA序列。實驗分組：實驗組(轉染HOTAIR-siRNA)，陰性對照組(轉染NC-siRNA)及空白對照組(無siRNA轉染即without-siRNA)。HOTAIR-siRNA和NC-siRNA核酸序列如下(表2)。

表2 HOTAIR-siRNA和NC-siRNA核酸序列

細胞轉染：選用6孔板于轉染前一天接種適量待轉染細胞，無抗生素培養(yǎng)基培養(yǎng)，顯微鏡下觀察細胞密度達到60%～70%時進行轉染。50 μl無血清Opti-MEM培養(yǎng)基加入20 pmol siRNA混勻；1 μl Lipo2000 轉染試劑稀釋于50 μl無血清Opti-MEM培養(yǎng)基中室溫靜置5 min；稀釋后的Lipo2000和siRNA試劑室溫靜置20 min形成復合物，加入含有細胞培養(yǎng)基的培養(yǎng)孔板中，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱孵育6 h，除去復合物，更換含1%青鏈霉素和10%FBS完全培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)48 h。

1.2.3 qRT-PCR反應 取對數生長期細胞，采用Trizol 法逐步獲取細胞總RNA。采用紫外分光光度計于260 nm 和280 nm處檢測總RNA吸光度值OD260、OD280，吸光度值介于1.8～2.0間說明RNA質量及純度良好。按照逆轉錄試劑盒說明書配置10 μl PCR逆轉錄反應體系反應得到cDNA，并檢測其濃度。利用熒光定量反應試劑盒說明書配置qRT-PCR反應體系及反應條件，將逆轉錄所得cDNA根據反應條件進行PCR擴增，反應條件：預變性(95 ℃，60 s，35個循環(huán))，退火(60 ℃，60 s，35個循環(huán))，延伸(70 ℃，5 min)，實驗重復3次，4 ℃保存。繪制溶解曲線，采用2-ΔΔCt法定量分析各細胞中HOTAIR相對表達量，篩選干擾效率最佳的一組HOTAIR-siRNA序列進行后續(xù)實驗。

1.2.4 CCK-8法檢測細胞增殖能力 于96孔板接種待測細胞懸液，每孔 5×103個，次日分組轉染HOTAIR-siRNA及NC-siRNA，每組設3個復孔、5個平行孔，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)24 h；采用移液槍向每孔加入CCK-8溶液約10 μl，培育箱繼續(xù)孵育1 h；于轉染后6、12、24、48、72 h采用酶標儀測量各組450 nm處吸光度值。實驗重復3次取平均值。

1.2.5 Transwell實驗檢測細胞侵襲及遷移能力 細胞侵襲：無血清RPMI1640培養(yǎng)基重懸各細胞，饑餓24 h，調整濃度為1×105個/孔，取200 μl細胞懸液接種于Transwell小室上室無血清培養(yǎng)基中；Transwell小室下室加入含20%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基，37 ℃恒溫孵育48 h；取出Transwell小室，PBS液沖洗，95%乙醇固定，結晶紫染色；顯微鏡下隨機選取5個視野觀察拍照計數，實驗重復3次取平均值。細胞遷移：試驗中調整細胞濃度為5×104個/孔加入Transwell小室上室無血清培養(yǎng)基中，其他方法基本同侵襲檢測。

1.2.6 Western blot 檢測下調HOTAIR表達后Wnt/β-catenin信號通路相關蛋白表達 使用PMSF蛋白裂解液提取各轉染組細胞總蛋白，后采用BCA法于562 nm處檢測吸光度值計算樣品蛋白濃度。取50 μg蛋白樣品，根據Bio-Rad Bis-Tris凝膠系統(tǒng)說明書配制10%SDS-PAGE凝膠體系，于電泳槽內加入電泳緩沖液，將蛋白和蛋白樣品預染Marker上樣至加樣孔進行蛋白電泳，電泳條件濃縮膠(80 V，30 min)，分離膠(100 V)，待溴酚蘭到達凝膠底部時結束電泳。將分離蛋白印跡轉至PVDF膜，5%脫脂牛奶中室溫封閉1 h，TBST洗膜3次。TBST液稀釋抗體，加入一抗4 ℃孵育過夜。TBST洗膜3次，加入PVDF膜與辣根過氧化物酶偶連的二抗室溫共孵育1 h，進行抗體標記。采用Bio-Rad ChemiDocTMXRS system凝膠成像系統(tǒng)及Image LabTM軟件進行光學信號檢測，分析目的條帶的相對光密度值。

1.3 統(tǒng)計學處理

2 結果

2.1 不同NSCLC細胞系中LncRNA HOTAIR相對表達情況

為明確NSCLC細胞中LncRNA HOTAIR是否差異表達，采用qRT-PCR法對不同NSCLC細胞系中HOTAIR水平進行檢測，并以正常肺組織細胞HBE作為對照。結果顯示：與正常HBE細胞對照比較，NSCLC細胞系A549、H1650、H460中HOTAIR均高表達，組間差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，見圖1。

注：與HBE細胞相比，**為P<0.01，***為P<0.001。圖1 各NSCLC細胞系中HOTAIR相對表達

2.2 敲降LncRNA HOTAIR的效果

將GenePharma公司設計合成的3條不同HOTAIR-siRNA干擾序列分別轉染至A549、H1650、H460細胞系中敲降HOTAIR表達(即實驗1、2、3組)，以轉染NC-siRNA作為陰性對照。經轉染72 h后，采用qRT-PCR法對NSCLC各細胞系中HOTAIR表達量進行檢測，結果顯示：A549、H1650、H460細胞系經轉染3條不同HOTAIR-siRNA序列后HOTAIR相對表達均較陰性對照組相比呈現(xiàn)不同程度敲降效果(P<0.01)；對比三組細胞系的各組敲降效率，HOTAIR-siRNA3敲降效果均為最佳，選擇其進行后續(xù)實驗。見圖2。

2.3 敲降LncRNA HOTAIR基因后各組肺癌細胞系中HOTAIR表達

NSCLC細胞系A549、H1650、H460分別轉染HOTAIR-siRNA，敲降HOTAIR基因表達。經轉染48 h后取對數生長期各細胞系分別進行qRT-PCR分析，結果顯示：敲降HOTAIR基因表達后，3組細胞系中HOTAIR相對表達水平均較陰性對照組及空白對照組明顯降低，組間差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖3。

2.4 敲降LncRNA HOTAIR表達對各肺癌細胞增殖能力的影響

采用CCK-8法分別于轉染6 h、12 h、24 h、48 h、72 h檢測各組細胞OD值并繪制增殖曲線，結果顯示：敲降HOTAIR表達，A549、H1650、H460細胞在各轉染時間點的增殖能力較陰性對照組和空白對照組相比均受到不同程度抑制，組間差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖4。

注：與空白對照組和NC-siRNA組比較，**為P<0.01，***為P<0.001。圖4 敲降HOTAIR后各細胞增殖能力

2.5 敲降LncRNA HOTAIR表達對各肺癌細胞侵襲/遷移能力的影響

采用Transwell實驗檢測各組細胞侵襲/遷移能力，結果顯示：敲降HOTAIR表達后，A549、H1650、H460細胞的相對侵襲率/遷移率較陰性對照組均明顯降低，組間差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，見圖5。

注：與NC-siRNA組比較，*為P<0.05，** 為P<0.01，***為P<0.001。圖5 敲降HOTAIR后各細胞遷移/侵襲能力

2.6 HOTAIR對Wnt/β-Catenin信號通路的影響

為明確HOTAIR是否通過誘導Wnt/β-Catenin信號轉導通路參與NSCLC的發(fā)生，本研究采用Western blot法對Wnt/β-Catenin信號通路的重要蛋白β-catenin、c-Myc水平進行檢測，探究了敲降HOTAIR基因表達對各NSCLC細胞系中β-catenin、c-Myc表達水平的影響，并根據蛋白條帶強度進行量化分析。結果顯示：與陰性對照組及空白對照組相比，敲降HOTAIR基因表達后，A549、H1650、H460細胞系的β-catenin、c-Myc表達水平均明顯減弱(P<0.05)。敲降細胞內HOTAIR表達可抑制β-catenin、c-Myc表達，HOTAIR表達水平能夠調控Wnt/β-Catenin信號通路的活性。見圖6。

注：與NC-siRNA組比較，** 為P<0.01。圖6 敲低HOTAIR表達對Wnt/β-Catenin信號通路中相關蛋白的影響

3 討論

肺癌作為最常見的惡性腫瘤，其發(fā)病是多因素共同導致的結果，包括原癌基因、癌基因突變、LncRNA表達失調及DNA甲基化狀態(tài)改變等。近年來，隨著基因測序技術的發(fā)展及人類基因庫數據的不斷完善，基因測序顯示人類基因組中僅有<3%的基因可編碼為蛋白，其余均轉錄為非編碼RNA(ncRNA )。研究指出[7]，ncRNA中長鏈非編碼RNA(LncRNA)積極參與各細胞中信號轉導通路的傳遞，是調節(jié)多種細胞進程的重要因子。據有關報道[8]，LncRNA的異常表達或失調會導致腫瘤的發(fā)生發(fā)展，在腫瘤中發(fā)揮促癌或抑癌作用，可在轉錄水平、轉錄后水平及表觀遺傳學水平等多方面對腫瘤進行調控[9]，為腫瘤的預防及治療提供了新的研究方向及治療靶點。

HOTAIR是HOX的轉錄反義RNA，是第一個被識別具有反式轉錄調控作用，且與惡性腫瘤相關的 lncRNA，位于基因組 12q13上HOXC 基因位點[10]。研究表明[11]，HOTAIR主要與多梳蛋白抑制復合物2(polycomb repressive complex 2，PRC2)相互作用，調節(jié)染色體重排，進而促進腫瘤的發(fā)生。Li等發(fā)現(xiàn)[12]，HOTAIR在肝癌組織中高表達，通過抑制抑癌基因表達促進肝癌發(fā)生；反之下調HOTAIR表達則可抑制肝癌細胞的生長遷移。Pan等發(fā)現(xiàn)[13]，胃癌組織中HOTAIR過表達，對胃癌淋巴結轉移、EMT進展及血管侵犯具有促進作用，HOTAIR過表達是造成胃癌患者預后不良的主要標志物。Zhang等研究報道[14]，人神經膠質瘤中，HOTAIR可通過互補序列下調miR-126，影響神經膠質瘤的進展。此外，除發(fā)揮促癌/抑癌作用外，HOTAIR也參與腫瘤治療后順鉑耐藥；沉默HOTAIR表達可增加惡性腫瘤細胞對化療藥物的敏感性，改善患者預后，并指出HOTAIR具有預測腫瘤化療耐藥的特質[15]。因此本研究就LncRNA HOTAIR對NSCLC細胞生物學行為及其可能作用機制進行了探究，結果發(fā)現(xiàn)NSCLC細胞系中 HOTAIR異常高表達；轉染敲降HOTAIR表達后NSCLC細胞增殖、遷移及侵襲能力均受到顯著抑制。提示HOTAIR 具有類癌基因的作用，可促進癌細胞的增殖、遷移及侵襲。

基因參與調控腫瘤的發(fā)生發(fā)展通過細胞信號通路進行信息傳導，進而影響細胞生物學功能，而LncRNA主要通過：①作為信號傳導分子參與信號通路傳導，調控下游基因轉錄；②直接與蛋白結合阻斷分子作用和信號通路，調控下游基因；③與蛋白結合，將復合物定位至特定DNA序列；④直接或間接結合多個相關轉錄因子，實現(xiàn)多種信號通路間信息整合等機制調節(jié)細胞功能[16]。研究發(fā)現(xiàn)[17]，Wnt信號傳導通路是肺癌細胞中唯一保持高活性的信號通路，腫瘤的發(fā)生發(fā)展與Wnt通路密切相關；經典Wnt/β-Catenin 信號通路異常激活，誘導轉錄因子的表達，是導致腫瘤發(fā)生的主要驅動力。此外，Wnt信號通路是1個復雜的調控空網絡，其關鍵蛋白發(fā)生突變，導致信號異?；罨軌蛘T導腫瘤的發(fā)生[18]。Ding等[19]研究發(fā)現(xiàn)，肺癌組織中Wnt1蛋白含量上調，Wnt1高表達與異常高表達的c-Myc、β-Catenin等癌基因相關，Wnt1高表達肺癌細胞呈現(xiàn)較強的增殖、遷移、侵襲能力和抗腫瘤細胞凋亡。Wang等[20]發(fā)現(xiàn)，抑制癌細胞中β-Catenin轉錄活性，阻礙Wnt/β-Catenin通路，進而可抑制c-Myc等癌基因表達及細胞增殖。同時Fu等也研究發(fā)現(xiàn)[21]，HOTAIR與PRC2聯(lián)合調控H3K27三甲基化，改變下游PTEN、WIF1等基因表達，對Wnt、AKt等信號通路發(fā)揮作用，參與調控腫瘤的生長、凋亡等過程。因此深入探究Wnt/β-Catenin信號通路與LncRNA HOTAIR間的潛在調控關系及機制，可提供新的肺癌治療靶點。本研究探究發(fā)現(xiàn)敲降HOTAIR表達后，各NSCLC細胞系中Wnt通路相關蛋白β-catenin、c-Myc表達水平明顯減弱，提示敲降HOTAIR表達可抑制Wnt/β-Catenin信號通路相關蛋白的表達，抑制Wnt/β-Catenin信號通路的活性，進而抑制NSCLC的發(fā)生。

綜上，LncRNA HOTAIR在NSCLC細胞系中高表達，敲降細胞內HOTAIR表達可抑制NSCLC細胞增殖、遷移及侵襲，其機制可能與Wnt/β-Catenin信號通路活性受抑制有關。