張亮亮，張 禾，徐 曼，胡新宇，劉義穩(wěn)

(1.中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院 林產(chǎn)化學(xué)工業(yè)研究所；生物質(zhì)化學(xué)利用國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室;國(guó)家林業(yè)和草原局林產(chǎn)化學(xué)工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；江蘇省生物質(zhì)能源與材料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；江蘇省林業(yè)資源高效加工利用協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 南京 210042;2.五峰赤誠(chéng)生物科技股份有限公司，國(guó)家林業(yè)和草原局五倍子高效培育與精深加工工程技術(shù)研究中心，湖北 宜昌 443413)

單寧酸又稱鞣酸，屬于水解類(lèi)單寧，其水解產(chǎn)物為棓酸和葡萄糖，是最早進(jìn)行研究及開(kāi)發(fā)利用的單寧之一，具有很強(qiáng)的生物和藥理活性，在醫(yī)藥、食品、日化等方面具有廣泛的應(yīng)用[1]。單寧酸主要存在于中國(guó)五倍子、土耳其倍子、塔拉果莢、石榴、漆樹(shù)葉等植物中[2]，其所具有的一系列獨(dú)特的性質(zhì)引起了國(guó)內(nèi)外學(xué)者廣泛關(guān)注。其中五倍子是中國(guó)的林特產(chǎn)品，是用來(lái)生產(chǎn)單寧酸的主要原料。單寧酸組分復(fù)雜，由不同聚體的棓酸組成，其中五聚體1,2,3,4,6-O-五沒(méi)食子酰葡萄糖(PGG)是由5個(gè)沒(méi)食子酸與一個(gè)葡萄糖通過(guò)酯鍵結(jié)合而成。酚類(lèi)物質(zhì)具有能夠和金屬離子絡(luò)合的共性，多酚羥基一般是以氧負(fù)離子的形式與金屬離子絡(luò)合。未電離的酚羥基雖然也可以參加配位，但其絡(luò)合的穩(wěn)定性比離解的氧負(fù)離子差很多。因此單寧與金屬離子絡(luò)合由兩部分反應(yīng)組成，首先是酚羥基離解，然后氧負(fù)離子(R—O-)作為配體與金屬離子進(jìn)行配位絡(luò)合[1]。單寧表現(xiàn)為弱酸性，單寧-金屬離子絡(luò)合反應(yīng)過(guò)程可以看成是溶液中質(zhì)子與金屬離子同酚羥基上帶負(fù)電荷的氧離子相互競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合的過(guò)程[3-5]。然而由于單寧酸組成成分復(fù)雜，化學(xué)結(jié)構(gòu)中含有多個(gè)棓酰基，在溶液中的解離過(guò)程及平衡十分復(fù)雜，因此對(duì)溶液中酸解離常數(shù)的測(cè)定及其相關(guān)溶液配位化學(xué)作用的研究較為困難。本實(shí)驗(yàn)利用一種單寧酸五聚體PGG及其組成單體化合物沒(méi)食子酸甲酯(MeG)作為模型化合物，采用pH電位滴定法及分光光度法研究其酚羥基去質(zhì)子化過(guò)程并測(cè)定其離解常數(shù)，得到了PGG的各級(jí)解離常數(shù)及其溶液中的化合物分布，為進(jìn)一步深入開(kāi)展單寧酸與溶液中金屬離子的相互作用機(jī)理研究提供了基礎(chǔ)。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 儀器與試劑

Agilent Cary 8454紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)，美國(guó)安捷倫公司；FE20型pH計(jì)，瑞士梅特勒-托利多公司。PGG(純度>99%)購(gòu)自成都普瑞法科技開(kāi)發(fā)有限公司；MeG(純度>99%)購(gòu)自北京綠源伯德生物科技有限公司，用50%甲醇溶液配成濃度為1 mmol/L的PGG、MeG反應(yīng)溶液，溶液中PGG、MeG準(zhǔn)確濃度經(jīng)吸光系數(shù)進(jìn)行校正。甲醇、鹽酸、氫氧化鈉均為分析純；試驗(yàn)用水為去離子水。PGG、MeG化學(xué)結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖1。

圖1 1,2,3,4,6-O-五沒(méi)食子酰葡萄糖(PGG)及沒(méi)食子酸甲酯(MeG)的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.1 Chemical structures of PGG and MeG

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1pH滴定試驗(yàn) 在比色皿中加入980 μL甲醇和1 μL濃度為1 mol/L的鹽酸溶液，充分混合后；再加入20 μL濃度為1 mmol/L的PGG或MeG溶液，充分混合后，用微量加樣器逐次向混合溶液中加入濃度為10 mmol/L的NaOH溶液，每次10 μL，共加入NaOH溶液總體積為320 μL；每次滴加后充分混合，并靜置1 min使其充分反應(yīng)。用分光光度計(jì)記錄混合溶液在200～600 nm處的吸光度，制作吸光度曲線，同時(shí)用pH計(jì)測(cè)定混合溶液的pH值。滴定試驗(yàn)重復(fù)3次，PGG溶液及NaOH溶液均需當(dāng)日配制使用。

1.2.2數(shù)據(jù)處理 化學(xué)計(jì)量學(xué)軟件Reactlab Equilibrium[6]是一款由澳大利亞紐卡斯?fàn)柎髮W(xué)化學(xué)專(zhuān)家研發(fā)，用于多組分體系配合物穩(wěn)定常數(shù)精確計(jì)算的優(yōu)秀的化學(xué)計(jì)量學(xué)分析軟件。該軟件主要用于有機(jī)化合物與金屬離子絡(luò)合反應(yīng)結(jié)合常數(shù)及化學(xué)計(jì)量比的計(jì)算，以及處理由酸堿電位滴定法得到的多組分配合物系統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，既適合解離常數(shù)的計(jì)算，又能用于各種類(lèi)型的配合物穩(wěn)定常數(shù)的計(jì)算，并通過(guò)對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行模擬計(jì)算得到不同pH值時(shí)體系中各組分的分布圖。本研究所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用Reactlab Equilibrium軟件程序在計(jì)算機(jī)(Windows 7操作系統(tǒng)，預(yù)裝Microsoft Office Professional 2010)上處理。

2 結(jié)果與討論

2.1 單寧酸(PGG)離解常數(shù)的測(cè)定

實(shí)驗(yàn)運(yùn)用pH電位滴定法結(jié)合光譜學(xué)技術(shù)，用10 mmol/L的NaOH溶液對(duì)1.0 mL濃度為0.02 mmol/L的PGG(預(yù)加鹽酸溶液)溶液進(jìn)行滴定，重復(fù)3次，得到滴定光譜(圖2)，溶液的吸光度值隨pH值的變化見(jiàn)圖3。

圖2 NaOH滴定PGG溶液吸收光譜變化Fig.2 Spectral changes of PGG titrated with NaOH

圖3 不同pH值下溶液的吸光度值變化Fig.3 The absorbance of solution at different pH value

由圖2可見(jiàn)，PGG溶液的特征吸收峰出現(xiàn)在220和280 nm處，與文獻(xiàn)[7]報(bào)道的結(jié)果一致。隨著溶液中pH值的升高，其在280 nm處的特征吸收波長(zhǎng)表現(xiàn)出向326 nm處紅移，表明PGG結(jié)構(gòu)中的棓?；鶊F(tuán)上的酚羥基發(fā)生了去質(zhì)子化反應(yīng)。單寧酸結(jié)構(gòu)中的酚羥基去質(zhì)子化會(huì)引起芳香環(huán)上電子分布的改變，從而導(dǎo)致單寧酸光譜特征吸收波長(zhǎng)出現(xiàn)紅移現(xiàn)象[8]。隨著混合溶液pH值的升高，溶液在326 nm處的吸光度值呈“S”型變化趨勢(shì)(圖3)，隨著pH值的升高PGG結(jié)構(gòu)中的酚羥基開(kāi)始離解并失去質(zhì)子，當(dāng)pH>11后PGG分子達(dá)到完全去質(zhì)子化狀態(tài)。

運(yùn)用化學(xué)計(jì)量學(xué)軟件對(duì)電位滴定實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析計(jì)算得到隨著溶液pH值的升高，PGG分子在溶液中共存在兩種去質(zhì)子化狀態(tài)，分別為PGG-D1和PGG-D2(見(jiàn)圖4(a))，并計(jì)算得到兩個(gè)離解常數(shù)分別為pKa1=10.84±0.03和pKa2=10.62±0.02。對(duì)照實(shí)驗(yàn)光譜數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)PGG-D1和PGG-D2狀態(tài)下的pH值分別為10.69和11.55(見(jiàn)圖4(b))。

a.計(jì)算值calculated value；b.實(shí)驗(yàn)值experimental value圖4 質(zhì)子化的PGG及其兩種去質(zhì)子化狀態(tài)(PGG-D1和PGG-D2)光譜圖Fig.4 The computed spectra of the fully protonated PGG and its two deprotonated forms

從實(shí)驗(yàn)光譜與化學(xué)計(jì)量學(xué)軟件計(jì)算得到的模擬光譜對(duì)比來(lái)看，計(jì)算結(jié)果與實(shí)驗(yàn)光譜特征吸收峰吻合很好，所得離解常數(shù)的誤差也很小，因此，Reactlab Equilibrium軟件的計(jì)算結(jié)果是較為合理可靠的。

2.2 沒(méi)食子酸甲酯(MeG)離解常數(shù)的測(cè)定

水解類(lèi)單寧化學(xué)結(jié)構(gòu)中的沒(méi)食子酸?；Y(jié)構(gòu)是水解類(lèi)單寧結(jié)構(gòu)中主要的活性基團(tuán)，是單寧酸與金屬離子進(jìn)行配位絡(luò)合的功能基團(tuán)[9-10]。作為單寧酸的功能活性基團(tuán)，雖然沒(méi)食子酸是水解類(lèi)單寧降解后的主要產(chǎn)物，但由于沒(méi)食子酸化學(xué)結(jié)構(gòu)中羧基的存在會(huì)對(duì)研究酚羥基離解產(chǎn)生一定的干擾，而沒(méi)食子酸甲酯(MeG)更適合作為單寧酸中酚羥基去質(zhì)子化研究，及其與金屬離子配位反應(yīng)研究的模型化合物，故本研究考察了MeG的去質(zhì)子化過(guò)程。實(shí)驗(yàn)運(yùn)用pH電位滴定法結(jié)合光譜學(xué)技術(shù)研究了MeG的去質(zhì)子化過(guò)程。隨著溶液中pH值的升高，MeG溶液吸光度曲線表現(xiàn)出與PGG相似的變化趨勢(shì)(見(jiàn)圖5(a))，其特征吸收峰從270 nm逐漸紅移至320 nm處，同時(shí)溶液在320 nm處的吸光度值同樣呈“S”型變化趨勢(shì)(圖3)。隨著pH值的升高M(jìn)eG結(jié)構(gòu)中的酚羥基團(tuán)開(kāi)始離解并失去質(zhì)子，當(dāng)pH>10后MeG達(dá)到完全去質(zhì)子化狀態(tài)。運(yùn)用化學(xué)計(jì)量學(xué)軟件計(jì)算得到其離解常數(shù)為pKa=9.68±0.02，并且隨著溶液pH值的升高，MeG分子在溶液中只有一種去質(zhì)子化狀態(tài)(MeG-D1，見(jiàn)圖5(b))，即苯環(huán)上只有一個(gè)酚羥基失去一個(gè)氫原子形成氧負(fù)離子。相比于其衍生物PGG，MeG具有更小的離解常數(shù)，即更容易發(fā)生離解反應(yīng)及與金屬離子進(jìn)行配位反應(yīng)。

圖5 不同pH下MeG溶液的光譜(a)及其模擬計(jì)算得到的質(zhì)子化MeG/去質(zhì)子化(MeG-D1)光譜(b)Fig.5 Spectral of MeG at different pH(a) and the computed spectra of the fully protonated MeG/deprotonated MeG(MeG-D1) by Reactlab Equilibrium software(b)

多酚化合物因其結(jié)構(gòu)中存在大量的鄰苯二酚基團(tuán)，具有眾多可以與金屬離子進(jìn)行絡(luò)合的結(jié)合位點(diǎn)。PGG分子中由5個(gè)沒(méi)食子酸圍繞中心一個(gè)葡萄糖核通過(guò)酯鍵連接而成，即每個(gè)PGG分子中存在5個(gè)棓?；Y(jié)構(gòu)[11]。文獻(xiàn)研究發(fā)現(xiàn)，每個(gè)棓酰基可以結(jié)合一個(gè)金屬離子[12-14]，因此理論上每個(gè)PGG分子最大應(yīng)該可以結(jié)合5個(gè)金屬離子，但目前有關(guān)1個(gè)多酚化合物分子可以結(jié)合超過(guò)3個(gè)金屬離子的情況鮮見(jiàn)報(bào)道。作者課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，每個(gè)單寧酸(PGG)分子最多可以結(jié)合2個(gè)Fe3+或Al3+離子[13,15]。這可從PGG的空間結(jié)構(gòu)進(jìn)行解釋?zhuān)現(xiàn)eldman等[16]研究發(fā)現(xiàn)，PGG結(jié)構(gòu)中的5個(gè)棓?；?條“手臂”一樣圍繞著葡萄糖核，并非自由地分布在同一個(gè)平面上，事實(shí)上5條“手臂”中的3條分布于葡萄糖核的一側(cè)，而剩下2條則分布于葡萄糖核的另一側(cè)，形成兩束具有眾多羥基的空間上相互分開(kāi)的“尾巴”，每束這樣的“尾巴”只能夠結(jié)合一個(gè)Fe3+或Al3+離子。

綜上可知，每個(gè)PGG分子最多只能發(fā)生去質(zhì)子化失去兩個(gè)質(zhì)子，而每個(gè)棓?；鶊F(tuán)上只有一個(gè)酚羥基會(huì)發(fā)生離解失去質(zhì)子，即每個(gè)PGG分子中最多有兩個(gè)棓酰基團(tuán)發(fā)生了去質(zhì)子化形成氧負(fù)離子形式，從而進(jìn)一步可以與金屬離子發(fā)生配位反應(yīng)，形成PGG-2Fe或PGG-2Al絡(luò)合物。根據(jù)以上研究結(jié)果，可以使得單寧酸在溶液中的去質(zhì)子化過(guò)程及其與金屬離子的絡(luò)合反應(yīng)機(jī)制更加清晰(見(jiàn)圖6)。隨著溶液pH值的升高(pH>4)，PGG結(jié)構(gòu)中的酚羥基開(kāi)始離解并失去質(zhì)子，去質(zhì)子化的PGG可以與金屬離子進(jìn)一步發(fā)生配位反應(yīng)生成金屬離子配合物；當(dāng)pH>11后PGG分子達(dá)到完全去質(zhì)子化狀態(tài)，該狀態(tài)在溶液中極不穩(wěn)定，很快轉(zhuǎn)化為氧化狀態(tài)。

圖6 單寧酸在溶液中的去質(zhì)子化過(guò)程及其與金屬離子的絡(luò)合反應(yīng)機(jī)制Fig.6 Proposed mechanism of deprotonation and metal ion complexing reaction of PGG

3 結(jié) 論

3.1采用pH電位滴定法結(jié)合光譜學(xué)方法揭示了單寧酸化合物PGG的去質(zhì)子化特性，結(jié)果顯示：隨著溶液pH值的逐漸升高，單寧酸化合物PGG分子中共有兩個(gè)酚羥基依次發(fā)生了去質(zhì)子化，其離解常數(shù)分別為pKa1=10.84±0.03和pKa2=10.62±0.02。MeG分子只有一個(gè)酚羥基會(huì)發(fā)生質(zhì)子化反應(yīng)，其離解常數(shù)pKa=9.68±0.02。

3.2揭示了單寧酸在溶液中的去質(zhì)子化過(guò)程，并進(jìn)一步闡明了單寧酸與金屬離子的絡(luò)合反應(yīng)機(jī)制。隨著pH值的升高(pH>4)，PGG結(jié)構(gòu)中的酚羥基開(kāi)始離解并失去質(zhì)子生成氧負(fù)離子，并進(jìn)一步與金屬離子發(fā)生配位反應(yīng)生成金屬離子配合物。