張亮亮，張 禾，徐 曼，胡新宇，劉義穩(wěn)

(1.中國林業(yè)科學研究院 林產(chǎn)化學工業(yè)研究所；生物質(zhì)化學利用國家工程實驗室;國家林業(yè)和草原局林產(chǎn)化學工程重點實驗室；江蘇省生物質(zhì)能源與材料重點實驗室；江蘇省林業(yè)資源高效加工利用協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 南京 210042;2.五峰赤誠生物科技股份有限公司，國家林業(yè)和草原局五倍子高效培育與精深加工工程技術研究中心，湖北 宜昌 443413)

單寧酸又稱鞣酸，屬于水解類單寧，其水解產(chǎn)物為棓酸和葡萄糖，是最早進行研究及開發(fā)利用的單寧之一，具有很強的生物和藥理活性，在醫(yī)藥、食品、日化等方面具有廣泛的應用[1]。單寧酸主要存在于中國五倍子、土耳其倍子、塔拉果莢、石榴、漆樹葉等植物中[2]，其所具有的一系列獨特的性質(zhì)引起了國內(nèi)外學者廣泛關注。其中五倍子是中國的林特產(chǎn)品，是用來生產(chǎn)單寧酸的主要原料。單寧酸組分復雜，由不同聚體的棓酸組成，其中五聚體1,2,3,4,6-O-五沒食子酰葡萄糖(PGG)是由5個沒食子酸與一個葡萄糖通過酯鍵結合而成。酚類物質(zhì)具有能夠和金屬離子絡合的共性，多酚羥基一般是以氧負離子的形式與金屬離子絡合。未電離的酚羥基雖然也可以參加配位，但其絡合的穩(wěn)定性比離解的氧負離子差很多。因此單寧與金屬離子絡合由兩部分反應組成，首先是酚羥基離解，然后氧負離子(R—O-)作為配體與金屬離子進行配位絡合[1]。單寧表現(xiàn)為弱酸性，單寧-金屬離子絡合反應過程可以看成是溶液中質(zhì)子與金屬離子同酚羥基上帶負電荷的氧離子相互競爭結合的過程[3-5]。然而由于單寧酸組成成分復雜，化學結構中含有多個棓?；?，在溶液中的解離過程及平衡十分復雜，因此對溶液中酸解離常數(shù)的測定及其相關溶液配位化學作用的研究較為困難。本實驗利用一種單寧酸五聚體PGG及其組成單體化合物沒食子酸甲酯(MeG)作為模型化合物，采用pH電位滴定法及分光光度法研究其酚羥基去質(zhì)子化過程并測定其離解常數(shù)，得到了PGG的各級解離常數(shù)及其溶液中的化合物分布，為進一步深入開展單寧酸與溶液中金屬離子的相互作用機理研究提供了基礎。

1 實 驗

1.1 儀器與試劑

Agilent Cary 8454紫外-可見分光光度計，美國安捷倫公司；FE20型pH計，瑞士梅特勒-托利多公司。PGG(純度>99%)購自成都普瑞法科技開發(fā)有限公司；MeG(純度>99%)購自北京綠源伯德生物科技有限公司，用50%甲醇溶液配成濃度為1 mmol/L的PGG、MeG反應溶液，溶液中PGG、MeG準確濃度經(jīng)吸光系數(shù)進行校正。甲醇、鹽酸、氫氧化鈉均為分析純；試驗用水為去離子水。PGG、MeG化學結構見圖1。

圖1 1,2,3,4,6-O-五沒食子酰葡萄糖(PGG)及沒食子酸甲酯(MeG)的化學結構Fig.1 Chemical structures of PGG and MeG

1.2 實驗方法

1.2.1pH滴定試驗 在比色皿中加入980 μL甲醇和1 μL濃度為1 mol/L的鹽酸溶液，充分混合后；再加入20 μL濃度為1 mmol/L的PGG或MeG溶液，充分混合后，用微量加樣器逐次向混合溶液中加入濃度為10 mmol/L的NaOH溶液，每次10 μL，共加入NaOH溶液總體積為320 μL；每次滴加后充分混合，并靜置1 min使其充分反應。用分光光度計記錄混合溶液在200～600 nm處的吸光度，制作吸光度曲線，同時用pH計測定混合溶液的pH值。滴定試驗重復3次，PGG溶液及NaOH溶液均需當日配制使用。

1.2.2數(shù)據(jù)處理 化學計量學軟件Reactlab Equilibrium[6]是一款由澳大利亞紐卡斯爾大學化學專家研發(fā)，用于多組分體系配合物穩(wěn)定常數(shù)精確計算的優(yōu)秀的化學計量學分析軟件。該軟件主要用于有機化合物與金屬離子絡合反應結合常數(shù)及化學計量比的計算，以及處理由酸堿電位滴定法得到的多組分配合物系統(tǒng)的實驗數(shù)據(jù)，既適合解離常數(shù)的計算，又能用于各種類型的配合物穩(wěn)定常數(shù)的計算，并通過對實驗數(shù)據(jù)進行模擬計算得到不同pH值時體系中各組分的分布圖。本研究所有實驗數(shù)據(jù)均采用Reactlab Equilibrium軟件程序在計算機(Windows 7操作系統(tǒng)，預裝Microsoft Office Professional 2010)上處理。

2 結果與討論

2.1 單寧酸(PGG)離解常數(shù)的測定

實驗運用pH電位滴定法結合光譜學技術，用10 mmol/L的NaOH溶液對1.0 mL濃度為0.02 mmol/L的PGG(預加鹽酸溶液)溶液進行滴定，重復3次，得到滴定光譜(圖2)，溶液的吸光度值隨pH值的變化見圖3。

圖2 NaOH滴定PGG溶液吸收光譜變化Fig.2 Spectral changes of PGG titrated with NaOH

圖3 不同pH值下溶液的吸光度值變化Fig.3 The absorbance of solution at different pH value

由圖2可見，PGG溶液的特征吸收峰出現(xiàn)在220和280 nm處，與文獻[7]報道的結果一致。隨著溶液中pH值的升高，其在280 nm處的特征吸收波長表現(xiàn)出向326 nm處紅移，表明PGG結構中的棓?；鶊F上的酚羥基發(fā)生了去質(zhì)子化反應。單寧酸結構中的酚羥基去質(zhì)子化會引起芳香環(huán)上電子分布的改變，從而導致單寧酸光譜特征吸收波長出現(xiàn)紅移現(xiàn)象[8]。隨著混合溶液pH值的升高，溶液在326 nm處的吸光度值呈“S”型變化趨勢(圖3)，隨著pH值的升高PGG結構中的酚羥基開始離解并失去質(zhì)子，當pH>11后PGG分子達到完全去質(zhì)子化狀態(tài)。

運用化學計量學軟件對電位滴定實驗數(shù)據(jù)進行分析計算得到隨著溶液pH值的升高，PGG分子在溶液中共存在兩種去質(zhì)子化狀態(tài)，分別為PGG-D1和PGG-D2(見圖4(a))，并計算得到兩個離解常數(shù)分別為pKa1=10.84±0.03和pKa2=10.62±0.02。對照實驗光譜數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)PGG-D1和PGG-D2狀態(tài)下的pH值分別為10.69和11.55(見圖4(b))。

a.計算值calculated value；b.實驗值experimental value圖4 質(zhì)子化的PGG及其兩種去質(zhì)子化狀態(tài)(PGG-D1和PGG-D2)光譜圖Fig.4 The computed spectra of the fully protonated PGG and its two deprotonated forms

從實驗光譜與化學計量學軟件計算得到的模擬光譜對比來看，計算結果與實驗光譜特征吸收峰吻合很好，所得離解常數(shù)的誤差也很小，因此，Reactlab Equilibrium軟件的計算結果是較為合理可靠的。

2.2 沒食子酸甲酯(MeG)離解常數(shù)的測定

水解類單寧化學結構中的沒食子酸酰基結構是水解類單寧結構中主要的活性基團，是單寧酸與金屬離子進行配位絡合的功能基團[9-10]。作為單寧酸的功能活性基團，雖然沒食子酸是水解類單寧降解后的主要產(chǎn)物，但由于沒食子酸化學結構中羧基的存在會對研究酚羥基離解產(chǎn)生一定的干擾，而沒食子酸甲酯(MeG)更適合作為單寧酸中酚羥基去質(zhì)子化研究，及其與金屬離子配位反應研究的模型化合物，故本研究考察了MeG的去質(zhì)子化過程。實驗運用pH電位滴定法結合光譜學技術研究了MeG的去質(zhì)子化過程。隨著溶液中pH值的升高，MeG溶液吸光度曲線表現(xiàn)出與PGG相似的變化趨勢(見圖5(a))，其特征吸收峰從270 nm逐漸紅移至320 nm處，同時溶液在320 nm處的吸光度值同樣呈“S”型變化趨勢(圖3)。隨著pH值的升高MeG結構中的酚羥基團開始離解并失去質(zhì)子，當pH>10后MeG達到完全去質(zhì)子化狀態(tài)。運用化學計量學軟件計算得到其離解常數(shù)為pKa=9.68±0.02，并且隨著溶液pH值的升高，MeG分子在溶液中只有一種去質(zhì)子化狀態(tài)(MeG-D1，見圖5(b))，即苯環(huán)上只有一個酚羥基失去一個氫原子形成氧負離子。相比于其衍生物PGG，MeG具有更小的離解常數(shù)，即更容易發(fā)生離解反應及與金屬離子進行配位反應。

圖5 不同pH下MeG溶液的光譜(a)及其模擬計算得到的質(zhì)子化MeG/去質(zhì)子化(MeG-D1)光譜(b)Fig.5 Spectral of MeG at different pH(a) and the computed spectra of the fully protonated MeG/deprotonated MeG(MeG-D1) by Reactlab Equilibrium software(b)

多酚化合物因其結構中存在大量的鄰苯二酚基團，具有眾多可以與金屬離子進行絡合的結合位點。PGG分子中由5個沒食子酸圍繞中心一個葡萄糖核通過酯鍵連接而成，即每個PGG分子中存在5個棓酰基結構[11]。文獻研究發(fā)現(xiàn)，每個棓酰基可以結合一個金屬離子[12-14]，因此理論上每個PGG分子最大應該可以結合5個金屬離子，但目前有關1個多酚化合物分子可以結合超過3個金屬離子的情況鮮見報道。作者課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，每個單寧酸(PGG)分子最多可以結合2個Fe3+或Al3+離子[13,15]。這可從PGG的空間結構進行解釋，F(xiàn)eldman等[16]研究發(fā)現(xiàn)，PGG結構中的5個棓酰基像5條“手臂”一樣圍繞著葡萄糖核，并非自由地分布在同一個平面上，事實上5條“手臂”中的3條分布于葡萄糖核的一側，而剩下2條則分布于葡萄糖核的另一側，形成兩束具有眾多羥基的空間上相互分開的“尾巴”，每束這樣的“尾巴”只能夠結合一個Fe3+或Al3+離子。

綜上可知，每個PGG分子最多只能發(fā)生去質(zhì)子化失去兩個質(zhì)子，而每個棓酰基團上只有一個酚羥基會發(fā)生離解失去質(zhì)子，即每個PGG分子中最多有兩個棓?；鶊F發(fā)生了去質(zhì)子化形成氧負離子形式，從而進一步可以與金屬離子發(fā)生配位反應，形成PGG-2Fe或PGG-2Al絡合物。根據(jù)以上研究結果，可以使得單寧酸在溶液中的去質(zhì)子化過程及其與金屬離子的絡合反應機制更加清晰(見圖6)。隨著溶液pH值的升高(pH>4)，PGG結構中的酚羥基開始離解并失去質(zhì)子，去質(zhì)子化的PGG可以與金屬離子進一步發(fā)生配位反應生成金屬離子配合物；當pH>11后PGG分子達到完全去質(zhì)子化狀態(tài)，該狀態(tài)在溶液中極不穩(wěn)定，很快轉化為氧化狀態(tài)。

圖6 單寧酸在溶液中的去質(zhì)子化過程及其與金屬離子的絡合反應機制Fig.6 Proposed mechanism of deprotonation and metal ion complexing reaction of PGG

3 結 論

3.1采用pH電位滴定法結合光譜學方法揭示了單寧酸化合物PGG的去質(zhì)子化特性，結果顯示：隨著溶液pH值的逐漸升高，單寧酸化合物PGG分子中共有兩個酚羥基依次發(fā)生了去質(zhì)子化，其離解常數(shù)分別為pKa1=10.84±0.03和pKa2=10.62±0.02。MeG分子只有一個酚羥基會發(fā)生質(zhì)子化反應，其離解常數(shù)pKa=9.68±0.02。

3.2揭示了單寧酸在溶液中的去質(zhì)子化過程，并進一步闡明了單寧酸與金屬離子的絡合反應機制。隨著pH值的升高(pH>4)，PGG結構中的酚羥基開始離解并失去質(zhì)子生成氧負離子，并進一步與金屬離子發(fā)生配位反應生成金屬離子配合物。