李環(huán)亭，劉 黎，喬海清，王 婷，李建兵*，王曉濱，何培迎

（1.青島市產(chǎn)品質量監(jiān)督檢驗研究院，山東青島 266101；2.國家海洋精細化工及其生物制品質量監(jiān)督檢驗中心，山東青島 266101；3.青島市黃島區(qū)檢驗檢測中心，山東青島 266555；4.江蘇藍豐生物化工股份有限公司，江蘇新沂221400）

農(nóng)藥是人類生活中不可或缺的重要物資。近年來，隨著人們環(huán)保意識的增強和對食品安全與健康的日益重視，農(nóng)藥生產(chǎn)不斷發(fā)展和進步，農(nóng)藥在人類社會經(jīng)濟活動中發(fā)揮著越來越重要的作用[1]，農(nóng)藥質量也成為人們關注的焦點。農(nóng)業(yè)農(nóng)村部2018年農(nóng)藥監(jiān)督抽查結果表明，有效成分不符合要求是農(nóng)藥質量不合格的主要問題之一，有效成分實際含量高于標簽標示值[2]。農(nóng)藥有效成分含量的增加不僅會造成農(nóng)產(chǎn)品中農(nóng)藥殘留超標，危害人體健康，也會對生態(tài)環(huán)境造成一定的威脅，因此農(nóng)藥有效成分含量是監(jiān)管的重點。

根據(jù)農(nóng)藥的物理化學及生物特性，農(nóng)藥產(chǎn)品的檢測方法主要有氣相色譜法、液相色譜法、色譜質譜聯(lián)用法、光譜法等[3]。目前吡蟲啉有效成分含量測定的國家標準方法主要有GB 28126—2011《吡蟲啉原藥》、GB 28142—2011《吡蟲啉可濕性粉劑》、GB 28143—2011《吡蟲啉乳油》、GB 28141—2011《吡蟲啉可溶液劑》、GB 28132—2011《吡蟲啉微乳劑》，均采用單點校正法定量高效液相色譜法測定。單點校正法是通過已知濃度的標準樣品與坐標原點做直線，對未知濃度待測組分進行測定，當待測組分的線性方程與坐標原點有較大差別時，單點校正法會出現(xiàn)較大的誤差，而且單點校正法對標樣稱取、溶液配制、標樣是否均勻的偶然誤差無法分析，因此單點校正法對其給出的結果無法放進行判斷[4]。標準曲線法通過配制標準工作曲線，定量時可以直接從標準曲線上讀出含量，適合于大量樣品分析，但如果用純?nèi)軇┡渲脴藴嗜芤簛矶糠治瞿繕宋铮捎诨|效應會造成檢測結果與實際值之間會有偏差[5]，標準曲線法無法消除基質效應影響。標準加入法可以避免基質干擾，但操作比較復雜，對樣品需求量較大[6]。

本文選取吡蟲啉農(nóng)藥產(chǎn)品為研究對象，采用HPLC測定，采用單點校正法、標準曲線法和標準加入法3種方法定量，比較了不同定量方法對測定結果的影響。

1 材料和方法

1.1 儀器與試劑

儀器：Agilent1200高效液相色譜儀（配紫外檢測器），安捷倫科技有限公司；ML204T/02電子天平，瑞士梅特勒-托利多集團。

試劑：甲醇（色譜純），上海安譜實驗科技股份有限公司。

標準物質：吡蟲啉，德國Dr.Ehrenstorfer公司。

1.2 液相色譜條件

Thermo Hypersil Gold C18柱（250 mm×4.6 mm，粒徑5 μm），流動相甲醇∶水=40∶60，流速0.8 mL/min，進樣體積10 μL，紫外檢測器，檢測波長260 nm。

1.3 標準溶液配置

1.3.1 單標儲備液

稱取0.1 g（精確至0.0001 g）吡蟲啉標準物質于100 mL容量瓶中，加入甲醇溶解，并定容至刻度線，配制成1 mg/mL的單標儲備液。

1.3.2 標準使用液

準確移取5.0 mL 1.3.1標準儲備液于50 mL容量瓶中，加入甲醇定容至刻度線，配制成0.1 mg/mL的標準使用液。

1.3.3 標準曲線法標準工作液

取1.3.1單標儲備液和1.3.2標準使用液用甲醇逐級稀釋成0.02～0.8 mg/L的標準工作液。

1.4 樣品前處理

共選取7個不同廠家吡蟲啉農(nóng)藥產(chǎn)品，包括10%可濕性粉劑4個，25%可濕性粉劑1個，5%乳油1個，10%乳油1個。

1.4.1 單點校正法前處理

分別稱取2.0 g（標準質量分數(shù)5%）、1.0 g（標準質量分數(shù)10%）和0.4 g（標準質量分數(shù)25%）樣品于100 mL容量瓶中，加入甲醇溶解并定容至刻度線，然后準確移取5.0 mL于50 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度線，稀釋10倍，過濾待測。取1.3.2標準使用液，按照標樣溶液、樣品溶液、樣品溶液、標樣溶液的順序進行測定。

1.4.2 標準曲線法前處理

分別稱取1.0、2.0、3.0 g（標準質量分數(shù)5%）；0.5、1.0、2.0 g（標準質量分數(shù)10%）；0.2、0.4、0.6g（標準質量分數(shù)25%）樣品于50 mL容量瓶中，然后準確移取5.0 mL于50 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度線，稀釋10倍，過濾待測。

1.4.3 標準加入法前處理

分別稱取1.0、2.0 g（標準質量分數(shù)5%）；0.5、1.0 g（標準質量分數(shù)10%）；0.2、0.4 g（標準質量分數(shù)25%）各3組樣品于50 mL容量瓶中，加入甲醇溶解定容至刻度線。準確移取5.0 mL于50 mL容量瓶中，第2和3組樣品再分別準確加入0.1 mg/mL標準使用液（1.3.2）2.5、5.0 mL，用甲醇定容至刻度線，過濾待測。

2 結果和討論

2.1 方法重復性標準偏差

標準曲線法配制0.02～0.8 mg/L的標準曲線，以峰面積為縱坐標，濃度為橫坐標進行線性回歸分析，線性回歸方程為y=46466.76x＋296.01，線性相關系數(shù)R2大于0.99。結果表明，在所測定濃度范圍內(nèi)，標準曲線線性良好。取10%吡蟲啉乳油樣品連續(xù)測定10次，結果見表1。單點校正法、標準曲線法和標準加入法重復性標準偏差分別為0.092、0.087和0.307，表明3種方法都適用于吡蟲啉含量測定。

表1 單點校正法、標準曲線法和標準加入法重復性標準偏差

對表1中的數(shù)據(jù)進行單因素方差分析（F檢驗），F(xiàn)值為35.1，顯著大于臨界值（F(2,27)=3.35），表明3種定量方法間存在顯著差異。采用F檢驗對上述3種方法的檢測重復性標準偏差進行兩兩比較，結果發(fā)現(xiàn)標準加入法與單點校正法（p<0.001）和標準曲線法（p<0.001）有顯著差異，單點校正法和標準曲線法兩者間無顯著差異（p=0.440＞0.05）。對任意2種不同定量方法測試結果的一致性采用t檢驗方法進行比較。有顯著差異的2種定量方法，采用異方差假設的t檢驗方式；無顯著差異的定量方法，采用等方差假設的t檢驗方式。檢驗結果表明，單點校正法與標準曲線法、標準加入法檢測結果間存在顯著差異（顯著性水平α=0.05），標準曲線法和標準加入法之間無顯著差異（顯著性水平α=0.05）。

2.2 基質效應

基質效應是指樣品中的其他成分對待測組分的影響。本文通過單點校正法、標準曲線法和標準加入法標準曲線來考察7種吡蟲啉產(chǎn)品的基質效應，并對可濕性粉劑和乳油2種劑型不同的產(chǎn)品進行分析。采用t檢驗分析不同劑型的3種定量方法斜率的一致性，標準加入法、單點校正法與標準曲線法斜率比較的t值根據(jù)式（1）計算。結果表明，可濕性粉劑標準加入法、單點校正法與標準曲線法斜率統(tǒng)計量t值分別為4.36（＞t（25）0.05臨界值=2.06）、13.49（＞t（16）0.05臨界值=2.12）；乳油標準加入法、單點校正法與標準曲線法斜率統(tǒng)計量t值分別為1.01（＜t（17）0.05臨界值=2.11）、17.18（＞t（15）0.05臨界值=2.13）。標準加入法與單點校正法的斜率利用F檢驗和t檢驗進行分析（表2和表3）。結果表明，可濕性粉劑和乳油的p值均小于0.01。

式中：t為標準加入法或單點校正法與標準曲線法斜率的統(tǒng)計量；為標準加入法或單點校正法斜率平均值；μ為標準曲線法斜率；σX為標準加入法或單點校正法斜率標準差；n為標準加入法或單點校正法斜率測定次數(shù)。

表2 標準加入法和單點校正法斜率F 檢驗

統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，對于可濕性粉劑，標準加入法的斜率與標準曲線法、單點校正法的斜率有顯著差異（置信水平α=0.05），說明可濕性粉劑的基質效應對定量結果的影響不可忽略，標準加入法定量可濕性粉劑的檢測結果更可靠；對于乳油，單點校正法與其他兩種方法的斜率有顯著性差異（置信水平α=0.05），這可能是由于單點校正法在測量過程中根據(jù)產(chǎn)品標簽確定稱樣量，但樣品標稱含量與實際含量是有差別的，實際測量過程中待測組分與標準樣品的響應值不可能完全一致，采用單點校正法會產(chǎn)生較大誤差[4]。標準加入法的斜率與標準曲線法的斜率沒有顯著差異（置信水平α=0.05），說明本文檢測的乳油基質效應對測定結果的影響不顯著，但標準加入法操作過程較為復雜，樣品需要量大，在處理大量樣品或者對農(nóng)藥產(chǎn)品進行監(jiān)督抽查時，會影響檢測效率，同時需要大量的標準品，可采用標準曲線法定量更快速準確。

2.3 3種定量方法測定結果t檢驗

為了研究3種定量分析方法在檢測不同產(chǎn)品時的差異，本文對7個不同廠家的產(chǎn)品分別用單點校正法、標準曲線法和標準加入法進行了檢測，檢測結果采用成對二樣本平均值的t檢驗兩兩進行顯著性檢驗。結果表明，在顯著性水平α=0.05時，可濕性粉劑產(chǎn)品3種方法定量結果都有顯著性差異（p＜0.05）（表4）；乳油產(chǎn)品標準曲線法和標準加入法定量結果沒有顯著差異（p=0.95＞0.05），但單點校正法與另外2種方法測試結果都存在顯著差異（p＜0.01）（表5）；這可能是單點校正法會受到標樣稱取、配置等操作引起的偶然誤差，部分產(chǎn)品還會受到組成、待測成分等因素導致相應信號與其量的線性關系與標物響應與標物量的線性關系偏離；標準曲線法受環(huán)境影響較大，其截距偏離較大時會與單點校正法有顯著差異，標準加入法解決了樣品組分、基質等因素的影響[4]。

表4 吡蟲啉可濕性粉劑3 種定量方法測定結果t 檢驗

表5 吡蟲啉乳油3 種定量方法測定結果t 檢驗

3 結 論

本文利用HPLC法對不同劑型不同含量的吡蟲啉農(nóng)藥產(chǎn)品進行測定，通過單點校正法、標準曲線法和標準加入法進行定量分析，對3種方法的標準偏差、基質效應和測定結果進行了F檢驗和t檢驗。結果表明，對吡蟲啉可濕性粉劑產(chǎn)品，標準加入法曲線斜率與單點校正法和標準曲線法具有顯著性差異，為消除基質效應對檢測結果準確性的影響，建議選擇標準加入法進行定量分析；對吡蟲啉乳油產(chǎn)品，由于單點校正法與標準曲線法和標準加入法的標準偏差具有顯著性差異，單點校正法只有在標準曲線截距較小時才可使用，應用受限，且標準加入法操作較為復雜，因此選擇標準曲線法進行定量分析，以節(jié)省時間，同時滿足各類檢測要求。不同定量分析方法對農(nóng)藥制劑產(chǎn)品有害成分的檢測有影響，相關農(nóng)藥產(chǎn)品的國家、行業(yè)標準在制定過程中需要考慮不同定量分析方法對測定的影響，以確保農(nóng)藥有效成分檢測的準確性。