張雅卿，葉書建，周 睿，張 晶，劉雙平

（江南大學食品學院，江蘇無錫 214000）

不同發(fā)酵食品有不同風味，如奶制品的酸甜、醬油的鮮美、白酒的辛辣等等，這是不同的原輔料、發(fā)酵工藝、優(yōu)勢菌種及主要風味物質造成的。但是它們的發(fā)酵過程從微觀角度上看卻是相通的，即風味物質的生成本質是一樣的。

目前已經有諸多研究者利用GC-MS等技術檢測出了多種典型發(fā)酵食品所含的風味物質，進一步揭開了風味來源的本質，為風味的調控奠定了基礎；隨著分子技術的廣泛應用，人們通過PCR-DGGE 和高通量測序等技術分析發(fā)酵中微生物的群落結構；隨后，主成分分析（Principal Component Analysis,PCA）和聚類分析（Cluster analysis,CA）等方法將風味物質與微生物聯系在一起；因此，我們能夠更加詳細地知道風味/異味物質是哪些、源自何處，以及如何調節(jié)。

1 傳統(tǒng)發(fā)酵食品的特征風味物質研究進展

典型的傳統(tǒng)發(fā)酵食品有食醋、黃酒、腐乳、干酪等，大多采用開放的發(fā)酵系統(tǒng)，其發(fā)酵過程中涉及復雜的微生物系統(tǒng)，會產生許多對人體有益的活性物質，同時使整體風味提高，但也會產生生物胺等有害物質。為揭示食品發(fā)酵過程中的機理，國內學者主要采用頂空固相微萃取-氣相色譜-質譜(Headspace solid phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry，HS-SPME-GC-MS)聯用技術、宏基因組測序等技術對發(fā)酵食品的特征風味物質和微生物群落的多樣性進行了研究。通過分析不同發(fā)酵食品風味物質的多樣性、群落結構以及演替規(guī)律，有助于揭示其微生物群落的功能和風味物質形成的機理，改善產品品質，為發(fā)酵食品的標準化和工業(yè)化生產奠定基礎。

1.1 傳統(tǒng)發(fā)酵糧食產品

1.1.1 食醋

食醋是人們日常生活必備的酸味調味品，主要風味物質為乙酸、醛酮和高級醇類等。不同的特征風味物質糅合在一起，賦予了食醋特定的風味和香氣，不同的食醋風味也各不相同，山西老陳醋以色、香、醇、濃、酸五大特點享譽“天下第一醋”；恒順香醋酸而不澀；北京米醋酸中帶柔、香氣濃郁，研究食醋不同的風味物質對食醋口感的提升有巨大作用。鄭宇等[1]采用HS-SPME-GC-MS 對6 個品牌的山西老陳醋進行了分析，結果發(fā)現含量較高的成分為糠醛、乙酸乙酯、2,3-丁二酮；采用HPLC 法檢測出7 種有機酸，乙酸和乳酸為山西老陳醋的主要酸類。余鳴春等[2]通過GC-MS 測定了5 種恒順香醋中的揮發(fā)性風味物質，結果發(fā)現共有成分含量較高的依次為糠醛、乙酸、乙偶姻、乙酸乙酯、四甲基吡嗪、5-甲基糠醛、異戊酸。其中糠醛含量高達23.52 %，對恒順香醋風味貢獻顯著，賦予了其木香、焦糖香和烘烤食品的氣味[3]。Zhang 等[4]通過HS-SPME-GC-MS 對北京米醋不同發(fā)酵階段的揮發(fā)性香氣成分進行了測定，結果表明，在米醋不同的發(fā)酵階段香氣成分不同。酸和醇為主要香氣成分，乙醇、3-甲基丁醇和苯乙醇是酒精化階段潛在的香氣標志物，乙醇含量最高為70%；乙酸和3-羥基-2-丁酮是醋化階段的代表化合物，乙酸的含量達90%以上。

1.1.2 酒類飲料

傳統(tǒng)發(fā)酵酒類主要為黃酒、白酒、啤酒等酒種，由于不同的發(fā)酵工藝、環(huán)境、氣候等，不同的酒體的風味也各有不同，傳統(tǒng)發(fā)酵酒的主要成分為氨基酸、醇類、酸類、酯類、酚類等，對風味物質的研究對提升酒體風味具有重要意義。Chen 等[5]通過氣相色譜-嗅覺法（GC-O）和氣相色譜-質譜法（GCMS）對黃酒的揮發(fā)性風味物質進行鑒定，結果發(fā)現，乙酸、3-甲基丁酸、丁酸為主要酸類，賦予了酒體奶酪香味，起到降低刺激等作用；乙酸乙酯為主要酯類物質，賦予了酒體蜜糖甜味；3-甲基丁醇和β-苯乙醇為主要醇類；另外苯甲醛、香蘭素、土臭素和γ-壬內酯也對黃酒的獨特風味的形成有重要貢獻。孫其然等[6]采用GC-MS 對貴州茅臺酒進行了測定，結果發(fā)現，主要酸類為丙酸；主要酯類為辛酸乙酯、亞油酸乙酯、庚酸乙酯，其中辛酸乙酯貢獻尤為突出，賦予了酒體菠蘿、蘋果香氣樣的香韻；主要醇類為2-丁醇和糠醇，2-丁醇有類似葡萄酒的氣味。馮紅艷等[7]采用靜態(tài)頂空-氣相色譜法對啤酒的主要風味物質進行了測定，研究發(fā)現，啤酒的主要特征風味物質為乙醛、乙酸乙酯、正丙醇、異丁醇、異戊酯、異戊醇等，其中乙醛對啤酒風味的影響很大，賦予了啤酒生青味，異戊醇是構成啤酒酒體最重要物質，濃度高達126.05 mg/L。齊曉茹等[8]采用HS-SPME-GC-MS 對6 種不同酒齡的紅葡萄酒的風味物質進行了測定，結果發(fā)現共有風味物質中，主要醇類為苯乙醇，賦予酒體清甜的玫瑰樣花香；主要酸類為己酸，帶有類似羊的氣味；酯類含量較高的為癸酸乙酯、辛酸乙酯、己酸乙酯、乳酸乙酯、月桂酸乙酯，特別是癸酸乙酯含量很高，賦予了酒梨味果香。

1.2 傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品

傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品種類繁多，典型代表有酸奶和奶酪等。最原始的發(fā)酵乳制品是利用乳酸菌以乳糖為原料進行生長代謝，產生各種酶催化乳糖產生各種風味物質，具有營養(yǎng)豐富、易消化、便于儲藏等特點。以奶酪為代表，其具有悠久的歷史，隨著制作過程、配方、熟成程度等因素不同，而擁有豐富多變的口感，通過研究奶酪的風味物質對調控產品品質有巨大作用。

1.2.1 酸奶

劉東等[9]采用HS-SPME-GC-MS 對3 份不同地區(qū)的傳統(tǒng)發(fā)酵白牦牛酸奶和1 份普通酸奶的特征風味物質進行了檢測，并測定了揮發(fā)性風味物質ROAV 值，結果發(fā)現白牦牛酸奶和普通酸奶的風味物質相差較大，乙酸乙酯、2-甲基丁醛、異戊醛為白牦牛酸奶中的主要風味物質，而乙酸乙酯（7.59%～12.59%）為白牦牛酸奶關鍵性風味物質，賦予了酸奶果酒香味；而乙醛、雙乙酰、乙偶姻為普通酸奶的主要風味物質，賦予了酸奶奶油香味。成堃等[10]采用SPME-GC-MS 對藍莓味酸奶的特征風味物質進行了檢測，結果發(fā)現風味物質主要為2,3-丁二酮、己酸、乙酸，而2,3-丁二酮（60.90 %）對酸奶貢獻比較大，賦予了酸奶奶油香味，且隨著發(fā)酵時間延長而增長。

1.2.2 奶酪

羅天淇等[11]采用SPME-GC-MS 對宮廷奶酪的特征風味物質進行了檢測，結果共發(fā)現酸類物質含量最高，占總量的55.7%～64.84%；采用香氣活力值（OAV），確定了26種特征風味物質的OVA值，辛醛對奶酪風味和香氣的貢獻最大，其OVA 值為4.87。馬艷麗等[12]采用SPME-GC-MS 對西方奶酪的風味物質進行了測量，結果發(fā)現切達奶酪中含有20 種揮發(fā)性化合物，脂肪酸類化合物含量最高，占總含量的25.04%，丁酸（9.1%）和乙酸（3.08%）為主要酸類，賦予了奶酪酸臭味和刺鼻性氣味。

1.3 傳統(tǒng)發(fā)酵蔬菜

發(fā)酵蔬菜是以新鮮蔬菜為原料，經過乳酸菌、醋酸菌等混合微生物發(fā)酵而成的食品，其中含有大量的氨基酸、維生素C 和膳食纖維等營養(yǎng)物質，具有抗肥胖、凈腸等功能。張華芳等[13]利用GC-MS對不同發(fā)酵時期的芫根泡菜的風味物質進行了檢測，結果發(fā)現主要醇類物質為乙醇和芳樟醇，乙醇在發(fā)酵21 d 時含量達到最高為21.14 %；主要烴類物質為d-檸檬烯，賦予了泡菜新鮮橙子的香氣；二烯丙基二硫醚對泡菜的風味貢獻尤為突出，在14 d時含量達到了24.65 %，賦予了其大蒜味口感。周相玲等[14]對人工接種和自然接種的發(fā)酵蔬菜進行了風味物質的檢測與對比分析，研究發(fā)現兩者的主要氨基酸都為蘇氨酸，賦予了泡菜鮮甜的口感；乳酸都為主要有機酸，賦予了泡菜澀感；主要呈味物質都為二烯丙基硫醚，賦予了泡菜大蒜味。

1.4 傳統(tǒng)發(fā)酵豆制品

發(fā)酵豆制品是利用大豆發(fā)酵的食品，主要包括腐乳、豆豉和醬油等，其中富含醇、酯、有機酸、氨基酸等有益物質，具有改善腸道機能，預防心血管病等功效，不同的發(fā)酵豆制品風味物質差異也很大。劉娜等[15]采用HS-SPME-GC-MS 對3 種紅腐乳的特征揮發(fā)性風味物質進行了研究，結果發(fā)現，共有的揮發(fā)性風味物質為23 種，醇類和酯類含量都很高，賦予了腐乳醇香、果香、甜香等口感。其中乙醇、辛酸乙酯、丁酸乙酯、乙酸乙酯、α-水芹烯、茴香腦和2-戊基呋喃在3 種腐乳中含量比較高，為腐乳的主要風味物質。謝蘭心等[16]采用SPME-GCMS對黑豆和黃豆發(fā)酵的豆豉的揮發(fā)性風味物質進行了研究，結果發(fā)現2 種樣品共有的風味物質為10種，其中苯甲醛和苯乙醛含量比較高，賦予了腐乳苦杏仁味和玫瑰花香味，為豆豉的主要風味物質。王棟等[17]采用SPME-GC-MS 對海天醬油的揮發(fā)性風味物質進行了檢測，結果發(fā)現，其中苯乙醛（11.21 %）為核心揮發(fā)性風味物質，賦予了醬油風信子的香味，其次十四烷、月桂酸、十八醛、十六烷、云杉苷含量比較高，組成了醬油的主要揮發(fā)性風味物質。

2 傳統(tǒng)發(fā)酵食品微生物組成研究進展

2.1 傳統(tǒng)發(fā)酵糧食產品

2.1.1 食醋

在市面上有很多發(fā)酵醋類產品，由于微生物群落結構的差異，風味也大不相同，對其微生物群落結構的研究可以更好的了解發(fā)酵機制，獲得優(yōu)勢菌種，對醋產品的工業(yè)化和標準化提供理論基礎。Wang 等[18]通過宏基因組學確定了鎮(zhèn)江香醋的醋酸發(fā)酵過程中微生物群的結構，優(yōu)勢細菌和真菌分別為醋酸桿菌、乳酸桿菌、曲霉和鏈霉菌，發(fā)現細菌比真菌對風味形成的貢獻更大，并將醋酸桿菌屬、乳酸桿菌屬、脫水桿菌屬、乳球菌屬、葡萄糖醋酸桿菌屬、芽孢桿菌屬、葡萄球菌屬等7 個屬確定為鎮(zhèn)江香醋功能性核心菌群。張嬌嬌等[19]利用高通量測序對紅曲米醋制曲微生物組成進行了分析，研究獲得32 個菌株，主要真菌為酵母屬、紅曲霉屬和曲霉屬，且隨時間延長，曲中的優(yōu)勢真菌逐漸由酵母屬、紅曲霉屬變?yōu)榍箤?。細菌?yōu)勢菌為乳酸菌。

2.1.2 酒類飲料

傳統(tǒng)發(fā)酵酒類主要以淀粉為原料，經過淀粉糖化和酒精發(fā)酵兩個過程發(fā)酵而成。由于系統(tǒng)相對開放，多種微生物共同參與其中，在淀粉酶、酒化酶等作用下產生酒精。而好酒窖經過時間的積累，有益微生物不斷富集純化，釀出的酒體風味香濃。為了更好的了解其發(fā)酵機理和產香機制，做到對發(fā)酵酒類的品質把控，對釀酒微生物群落的研究尤為重要。Huang等[20]通過高通量測序技術對傳統(tǒng)武夷紅曲糯米酒的核心功能菌群進行了研究，結果表明乳酸桿菌、芽孢桿菌、亮葡菌、乳球菌、拉烏爾氏菌、葡萄球菌、足球菌、魏斯氏菌、酵母菌等是傳統(tǒng)發(fā)酵過程中的核心菌種。且細菌和真菌群落在不同的發(fā)酵階段均存在顯著差異，在最初的釀造階段為芽孢桿菌屬、葡萄球菌屬等，但其種群隨著發(fā)酵的進行而減少，在發(fā)酵結束（46 d）時乳酸桿菌屬、葡萄糖桿菌等演替為優(yōu)勢菌種。李路等[21]研究了黃酒發(fā)酵劑-紅曲和白曲的微生物群落組成，紅曲的優(yōu)勢菌種為魏斯氏菌屬、芽孢桿菌屬、黃曲霉和紫紅曲霉等，而白曲中的優(yōu)勢菌種為腸桿菌屬、泛生菌屬、魏斯氏菌屬、少根根霉、印度毛霉和釀酒酵母等。孫利林等[22]采用高通量測序技術對醬香型白酒釀造過程中的真菌多樣性進行了研究，結果表明，酒曲中的優(yōu)勢菌種主要為曲霉屬（64.43%）和嗜熱子囊菌屬（27.79 %），為后續(xù)的堆積糖化發(fā)酵發(fā)揮著重要的作用；窖內發(fā)酵酒醅的微生物多樣性最高，優(yōu)勢菌種為曲霉菌屬（52.89 %）和嗜熱子囊菌屬（19.49%），與醬香風味產生有密切關系。

2.2 傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品

發(fā)酵乳制品以乳類為原料，經過乳酸菌、酵母菌等發(fā)酵制成，以奶酪、酸奶等最具代表性。在發(fā)酵過程中微生物相互作用，將原料分解成人體易于吸收的小分子，提高了其營養(yǎng)價值。

2.2.1 酸奶

瑪依樂·艾海提等[23]采用高通量測序對傳統(tǒng)發(fā)酵酸奶微生物群落組成進行了檢測，結果發(fā)現，乳桿菌屬和鏈球菌屬為主要的優(yōu)勢細菌，酵母菌屬和克魯維酵母屬為主要的優(yōu)勢真菌。張敏等[24]采用高通量測序對酸牛奶、酸駝奶和酸馬奶中微生物群落組成進行了檢測，結果發(fā)現，酸牛奶的優(yōu)勢菌屬為乳桿菌屬和鏈球菌屬；酸駝奶的優(yōu)勢菌屬為乳桿菌屬和乳球菌屬；酸馬奶的優(yōu)勢菌屬為乳桿菌屬、乳球菌屬和醋桿菌屬。乳桿菌屬為3 種酸奶中共有的優(yōu)勢菌屬，但所占比例各不相同。

2.2.2 奶酪

Zheng 等[25]對哈薩克手工奶酪的微生物群落進行了分析，研究發(fā)現乳酸菌、鏈球菌、克魯維酵母菌和飽圓酵母菌是奶酪的主要菌種，且細菌比真菌對風味形成的貢獻更大；并基于其主要風味物質的產生和微生物群落的功能，確定了8 個細菌屬和7 個真菌屬作為風味生產的功能性核心菌群。王春艷等[26]采用高通量測序技術研究了新疆伊犁牧區(qū)傳統(tǒng)手工奶酪，研究發(fā)現奶酪中存在493 種細菌屬和780種細菌種，優(yōu)勢細菌屬為雷爾氏菌屬，優(yōu)勢乳酸菌屬為乳桿菌屬，瑞士乳桿菌為奶酪中的優(yōu)勢乳酸菌種。

2.3 傳統(tǒng)發(fā)酵蔬菜

菌種對發(fā)酵蔬菜的風味起到了至關重要的作用，發(fā)酵群落結構不同，發(fā)酵蔬菜口味也大不相同，其風味物質的變化與微生物的代謝密切相關，因此對發(fā)酵蔬菜的微生物群落結構進行研究，能更好的提高產品品質。Peng 等[27]采用高通量測序來描述海南省發(fā)酵蔬菜微生物群的多樣性，研究發(fā)現其核心菌群為發(fā)酵乳桿菌，戊糖乳桿菌和魏氏桿菌。燕平梅等[28]采用PCR-DGGE 指紋圖譜技術研究了9種市售發(fā)酵蔬菜，發(fā)現植物乳桿菌廣泛存在于所有的發(fā)酵蔬菜中，消化乳桿菌和短乳桿菌為酸菜的優(yōu)勢菌群，彎曲乳桿菌和短乳桿菌為泡菜的優(yōu)勢菌群，食用糖乳桿菌為醬菜的優(yōu)勢菌群，彎曲乳桿菌為浙江榨菜優(yōu)勢菌群。

2.4 傳統(tǒng)發(fā)酵豆制品

大豆中含有難以被人體吸收的植酸、抗原蛋白等抗營養(yǎng)因子[29]，而豆制品發(fā)酵過程中通過微生物的相互作用，可以將難以吸收的大分子物質分解，從而增加其營養(yǎng)價值，而通過對發(fā)酵微生物群落的研究能更好改善其營養(yǎng)價值，保證產品品質的穩(wěn)定。劉亞棟等[30]利用高通量測序描述了22 個腐乳的微生物多樣性，研究發(fā)現棒狀桿菌屬、鞘氨醇桿菌、Wautersiella、Rummelii bacillus、鹽厭氧菌屬、四聯球菌屬、不動桿菌屬和假單胞菌屬為腐乳的優(yōu)勢菌群。李曉然等[31]利用高通量測序檢測了云南豆豉中微生物群落多樣性，研究發(fā)現乳酸桿菌屬(總序列的72%)和芽孢桿菌屬（總序列的8%）為優(yōu)勢菌群。耿予歡等[32]采用PCR-DGGE 指紋圖譜技術對醬油中微生物多樣性進行了研究，優(yōu)勢菌群為魏斯菌屬、類腸膜魏斯菌、費氏檸檬酸桿菌、腸桿菌屬、產氣腸桿菌、嗜鹽四聯球菌和非培養(yǎng)的腸桿菌屬。

3 風味物質與微生物的相關性數據分析方法

傳統(tǒng)發(fā)酵食品中微生物的種類豐富，各種微生物代謝產生的風味物質也數目繁多，因此研究風味物質與微生物的相關性對傳統(tǒng)發(fā)酵食品的發(fā)展有著重大的意義。目前在分析風味物質與微生物的相關性常用的方法有：主成分分析法（Principal Component Analysis,PCA），聚類分析（Cluster analysis,CA）和偏最小二乘法回歸分析（Partial least squares regression,PLS），嶺回歸分析（Ridge Regression），正交偏最小二回歸乘法回歸分析（OPLS）[33]等。

3.1 主成分分析

主成分分析的應用十分廣泛，其主要目的是對高維數據進行降維處理[34]，它將原來互相具有相關性的眾多數據，重新組合為不具相關性的一組綜合指標。其處理方法是將原來的P 個指標進行線性組合，作為新的一個綜合指標，通常選取一個線性指標F1，以其方差Var(F1)表示，若第一主成分不足以表示原來所有指標所蘊含的信息量，則再選取第二主成分（F2），此時需要Cov(F1，F2)=0，依次類推至第P 個主成分（Fp）[35]。在研究發(fā)酵食品風味物質與微生物相關性時，在將所有的指標標準化之后，選取少量主成分，進行主成分分析，通過各主成分的貢獻率，從而分析出微生物與風味物質之間的相關性。該方法目前被廣泛運用于傳統(tǒng)發(fā)酵食品的品質分類以及風味分析等方面[36]。

3.2 聚類分析

聚類分析是一種簡化數據的方法，其實質是將物理的或者抽象的對象，在相似的基礎上進行分組，從而分成由相似對象組成的多個類的過程，同類中的對象應該具有很大的相似性，而不同類的對象應該有很大的相異性。聚類與直接分類的區(qū)別在于聚類所要求劃分的類是未知的，因此聚類分析是一種探索性的分析，使得聚類分析可以從樣本數據本身的變化規(guī)律出發(fā)，根據研究對象的特征進行自動分類。如姜元華等[37]在研究酵母品種與披薩面胚品質的相關性時，通過聚類分析將5 種酵母分為了4 類。趙加茜、朱衛(wèi)豐等[38]在研究發(fā)酵蟲草菌粉氨基酸含量差異時，通過聚類分析將16 種氨基酸聚為5 類，隨機選擇其中的5 個變量能夠準確反映發(fā)酵蟲草菌粉氨基酸的質量，能夠有效區(qū)別不同發(fā)酵蟲草菌粉類產品，結合主成分分析和聚類分析能夠客觀評價發(fā)酵蟲草菌粉類產品的質量。

3.3 偏最小二乘法回歸分析

偏最小二乘法是主成分分析法所產生的衍生物，故PLS 集主成分分析、相關性分析以及回歸建模3 種分析方法為一體，是一種十分便利的多元數據分析方法[39]。偏最小二回歸乘法是一種多因變量（Y）對多自變量（X）的回歸建模方法，相比較于普通多元線性回歸方法，PLS 能更大限度的利用全部數據信息，其在完成回歸建模的同時還完成了對數據結構的簡化[40]。在傳統(tǒng)發(fā)酵食品中，由于微生物菌群數量繁多，各種微生物合成代謝機制復雜，一般的回歸分析方法很難分析出風味物質與微生物之間的相關性。在現代分子測序技術的快速發(fā)展下，人們才得以通過PLS 等方法對此進行研究。如Liu 等[41]在焦磷酸測序技術的基礎上結合偏最小二乘回歸分析法，證明了黃酒的發(fā)酵過程是一個與十多個屬相關的多菌株共發(fā)酵過程，Liu等人在發(fā)酵過程中共鑒定出64 種揮發(fā)性化合物。王洪偉等[42]通過GC-MS 法結合PLS 法，在煙熏臘肉中共鑒定出6 種愈創(chuàng)木酚類和6 種烷基酚類，確定了酚類化合物是煙熏臘肉的關鍵性風味物質。肖作兵等[43]研究甜橙油中風味物質相關性時，通過GC-MS 法及感官評價，結合PLS 法得出檸檬烯、己醛等15 種物質是甜橙油中的主要風味物質。

3.4 嶺回歸分析

嶺回歸分析的實質是偏最小二乘法的改良方法，主要用于處理共線性的數據分析處理，嶺回歸方法舍棄了偏最小二乘法所具備的無偏性特征，通過對部分病態(tài)數據的舍去，使得到的回歸數據更加偏向實際，但同時其精度也有所降低。在數據中含有較多病態(tài)數據或存在共線性問題時，嶺回歸方法通過舍棄無偏性，使得回歸分析結果具有較大的實用價值[44]。鄭蓉建等[45]通過嶺回歸方法檢測谷氨酸發(fā)酵產物濃度，在保證模型精度的前提下優(yōu)化了模型結構，降低了模型復雜度。

3.5 正交偏最小二回歸乘法

正交偏最小二回歸乘法是為了解決PLS 方法中提取的成分解釋能力不均勻的問題而產生的，通過先用正交信號修正法將數據中的正交分量進行過濾后，再運用PLS 法進行建模，使得模型具有更好的解釋能力及預測能力，提高了模型的解釋度以及透明度[46]。在研究風味物質與微生物相關性時，可通過O2PLS 模型對微生物相對豐度及風味物質含量進行相關性分析，可得出二者之間的相關性的重要性指標(VIP(pred))，選擇VIP(pred)含量較高的微生物與風味物質進行相關性分析，從而得出微生物與風味物質之間的相關性。

4 傳統(tǒng)發(fā)酵食品中主要的異味物質及產異味微生物

傳統(tǒng)發(fā)酵食品一直因為其獨特的風味而深受全世界各國消費者的喜愛，發(fā)酵食品的產味物質有醇、酯、醛、酮、酸、硫化物、呋喃、酚等各類化合物，這些化合物構成了發(fā)酵食品獨特的風味[50]。然而，在發(fā)酵過程中還會產生一些不良風味，當其中的某些具有不良風味的物質超過一定劑量時，便會產生異味。目前傳統(tǒng)發(fā)酵食品中主要的異味物質有醇類、硫化物、醛類、多肽和氨基酸（表1）。

4.1 醇類

醇類是糖、氨基酸等成分在霉菌、酵母菌、細菌等微生物的作用下生成的。在食品發(fā)酵過程中，由氨基酸分解所產生的各種醇類物質如正丙醇、正丁醇、異丁醇、異戊醇等，都會使食品呈現出苦味，正丁醇苦味較小，正丙醇苦味較重，還會產生具有刺激性的青草味和辣味，異丁醇苦味極重。此外，由酵母代謝產生的酪醇，在其含量較低時會帶來柔和的香氣，但其含量升高時會帶來重而長的苦味[56]。

4.2 硫化物

食品中的硫化物主要是由于微生物的次級代謝反應產生的，如在酒發(fā)酵過程中的硫化氫是由酵母的硫代謝反應產生的，二甲基硫是通過酵母還原二甲基亞砜產生的。此外光化學反應、熱化學反應也會導致硫化物的生成。揮發(fā)性硫化物是十分重要的一類呈味物質，但其在食品中的閾值一般較低，不同的硫化物在食品中呈現出不同的氣味特征，硫化物能產生如香草味、果味等有益的風味，但也會產生很多異味，如硫化氫呈臭雞蛋味，硫醇呈辣蘿卜味[57]。此外還有一些硫化物如二甲基硫在含量較低時可增強口感，但其含量超過閾值時呈腐爛蔬菜味。

4.3 醛類

乙醛是酒類中主要的醛類，也是酸奶中主要的香氣物質，但其含量過高時，會產生辛辣的青草氣味，乙醛是酵母把糖轉化為乙醇時產生的中間產物，在乳酸菌產乳酸過程中，乙醛也可由核酸、氨基酸、丙酮酸代謝產生[58]。除乙醛外，丙烯醛具有辛辣的臭氣，且對人體健康有嚴重損傷，丙烯醛是最簡單的不飽和醛，可通過多不飽和脂肪酸氧化，氨基酸降解等途徑產生，丙烯醛在面包、奶酪及酒精飲料等發(fā)酵食品中含量高于一般食品[59]。

表1 傳統(tǒng)發(fā)酵食品的主要異味物質

4.4 多肽

發(fā)酵食品的原料往往都含有大量的蛋白質，因此在發(fā)酵過程中不可避免的有肽的產生，尤其是由糧食谷物釀造而成的酒類，其中含有大量的肽，而大部分的肽都是苦味肽。如在奶酪發(fā)酵過程中會有一些不良風味物質的產生，主要便是由苦味肽引起的，在蛋白質水解后，肽鏈中的苦味氨基酸或短肽便暴露出來，接觸味蕾從而產生苦味[60]。

4.5 產異味微生物

在發(fā)酵體系中，產異味的物質可能有酵母菌、乳酸菌、醋酸菌、霉菌或其他雜菌等。如酵母代謝途徑中，酪氨酸產生的酪醇，產生了重而久的苦味；酵母在合成纈氨酸途徑中，由于一部分ɑ-乙酰乳酸瀉出酵母外，進行氧化脫羧反應產生的雙乙酰，在啤酒中視為生青味的主要呈味物質[61]。在葡萄酒發(fā)酵過程中，乳酸菌對氨基酸的脫羧作用，會產生如組胺、腐胺和尸胺之類的生物胺，從而產生一種“鼠臭味”[54]；在發(fā)酵乳中，由乳糖經過糖酵解途徑產生的丙酮酸是重要的中間產物，丙酮酸可以在丙酮酸脫羧酶的作用下生成乙醛，從而產生辛辣的青草氣息。醋酸菌是公認的葡萄酒腐敗微生物，它能將乙醇氧化為乙酸從而產生具有刺激性的酸味[62]；此外醋酸菌在缺少糖原的情況時，會將乙醇氧化成乙醛，從而產生異味。霉菌是發(fā)酵食品產生霉味的主要原因。發(fā)酵時若感染雜菌，導致發(fā)酵異常時，會產生丙烯醛，呈現出刺辣味，且?guī)в袧庵氐某掷m(xù)性苦味。

5 傳統(tǒng)發(fā)酵食品風味物質的調控方法

傳統(tǒng)發(fā)酵食品的原料大多富含蛋白質、脂肪等營養(yǎng)物質。這些物質本身，或經特殊加工如熱處理等后本就會呈現部分風味[63]；而食品的發(fā)酵環(huán)境大都富含多種微生物，因此，發(fā)酵體系中存在由各類微生物產生的復雜酶系，這些酶會將營養(yǎng)物質分解轉化為風味前體物質；再結合微生物本身的其他代謝產物，后期發(fā)酵中，所有物質之間錯綜反應，產物復雜，呈現特別的風味。

5.1 酒精飲品

酒類飲品的風味決定于醇、醛、酸、酯等物質。這些物質的含量比或濃度高低決定了酒體的風味，甚至決定該產品是否無毒害。由于生化反應的復雜多變，各物質相互牽制，含量變化息息相關，因此通過探究整個風味物質的代謝途徑可以從根本上指導風味物質的調控。

乙酸是酒類重要的呈味物質，而一些高級醇和乙醛在含量過高時有害人體健康，有研究通過強化乙酸的合成或外加乙酸從整體上達到調控醇、醛、酸、酯等風味物質生成的目的，適當增加了乙酸的含量，減少了釀酒酵母高級醇及乙醛等微量風味物質的生成[64]。在針對櫻桃酒酒品優(yōu)化的研究中，證明發(fā)酵工藝條件中的溫度、pH值、SO2及酵母添加量等分別與不同特征風味物質含量成正（負）相關[65]。

因此，通過改變發(fā)酵條件或外加某種化合物均可影響到整體風味物質的代謝途徑，進一步達到控制風味物質含量的目的。

5.2 乳制品類發(fā)酵食品

微生物菌群及其代謝途徑是發(fā)酵工藝的核心，除了原料乳質量和發(fā)酵工藝條件的控制，掌握發(fā)酵過程中微生物的代謝途徑對風味控制具有重要作用。以酸奶為例，其主要風味物質如乙醛、雙乙酰等是由乳酸菌的糖酵解產物乳酸通過進一步的代謝反應生成的。有研究詳細論述了雙乙酰、乙醛的生成途徑及調控方法，并簡述了通過此種調控方式改變這兩種風味物質的產量從而達到改善乳品風味的目的[66-67]。

上述調控部分風味物質的方式有一定效果，但若根據需要任意改變風味則會受到限制。為了確定各風味物質的代謝途徑，最根本的方式是清楚它們的基因及表達。然而由于發(fā)酵中微生物種類的復雜多樣，是無法得知每種微生物的代謝途徑并將它們聯系在一起的。利用宏基因組學的技術便能夠簡化這個問題。改變環(huán)境條件以控制基因的表達即可達到調控風味物質含量的目的。有研究[68]將基因表達、風味物質代謝以及優(yōu)勢菌群密切結合，全面論述了多組學技術聯用在乳品風味代謝調控中的應用。一項關于瑞士奶酪風味調控的研究中，利用宏基因組學技術證明溫度的高低及催熟的時長能夠影響相關基因的表達，從而改變該種奶酪的風味[69]。

針對傳統(tǒng)發(fā)酵乳品的調控，將更大程度傾向確定微生物功能基因表達與風味物質代謝途徑間的聯系，這也同樣適用于其他發(fā)酵食品。

5.3 豆制品類發(fā)酵食品

豆制發(fā)酵食品的風味亦取決于微生物的代謝活動以及酶催化的反應。以傳統(tǒng)發(fā)酵豆醬為例，其風味物質形成主要受到原料、發(fā)酵菌種、制曲酶系等內部因素，以及紫外線照射、pH 值和溫度等外界條件的影響。這些因素與微生物代謝和酶反應聯系密切，因此可利用其進行風味調控。原料中加入有益發(fā)酵的輔料如小麥，小麥麩皮中富含的亞油酸[70]等物質可參與酯類物質形成，能夠強化后期小分子風味物質的生成，從而達到風味優(yōu)化的目的。

發(fā)酵豆醬的風味物質中，通常酯類物質最為豐富，所以酯類物質對最終風味的影響十分重要。劉超蘭等[71]在關于豆瓣醬的研究中使耐鹽性乳酸菌與酵母菌協(xié)同作用，發(fā)現隨著陳釀進行，耐鹽性乳酸菌成為優(yōu)勢菌，且其代謝產物和來自于酵母菌的乙醇能夠抑制雜菌、促進酯化、形成更多呈味氨基酸。

5.4 調味品類發(fā)酵食品

調味品的種類最為繁雜，包括食鹽、醬油、食醋、蠔油等等，且大多數豆制品如豆豉、豆瓣醬等也都屬于調味品。醬油和食醋可以歸為典型的發(fā)酵型調味品。

醬油由豆類發(fā)酵而成，氨基酸是其重要的營養(yǎng)及風味物質。除上述針對豆制品的風味調控方法外，還可以利用生物、化學甚至物理手段來提高發(fā)酵中的酶活或者減少一些揮發(fā)性風味物質的損失。添加一些酶制劑如γ-谷氨酰轉肽酶，能夠促進相關反應（γ-谷氨酰化合物水解等）進行，以提升醬油的鮮味；或者加入甜味劑等可以滿足人們感官需求的香辛料[72]。有研究表明，在醬油發(fā)酵過程中進行超高壓處理可以提高醬曲蛋白酶的活性，從而有益于呈味氨基酸的形成[73]。

Wang 等[18]利用宏基因組學技術，篩得到鎮(zhèn)江香醋中與風味物質密切相關的核心菌群；Jiang等[74]找出了紅曲霉醋中重要呈味物質與優(yōu)勢菌群之間的相關性，有了這些關系網絡，對于風味的調控也就有了進一步的方向。由于調味品原料來源的多樣性，針對其風味調控的方法也更為豐富，但始終不能夠脫離對于微生物代謝途徑及風味物質基因表達的研究。將基因表達這種微觀表征與發(fā)酵工藝等宏觀條件越是和諧的聯用在一起，效果則越好。

5.5 泡菜類發(fā)酵食品

泡菜因其口感獨特，深受消費者喜愛。它是以蔬菜為原料經由密閉發(fā)酵而制成的發(fā)酵食品。這類食品發(fā)酵過程常常出現在家庭當中，發(fā)酵的衛(wèi)生條件對發(fā)酵結果的影響較大，因此需要格外注意控制。

如果能夠利用測序技術找出其優(yōu)勢菌群[75]，并構建核心微生物菌群代謝的途徑，那么可以借此篩選、培養(yǎng)并利用具有功能優(yōu)勢的菌種。這樣不僅能夠得到更高質量的蔬菜發(fā)酵制品，還能達到抑制不利菌生長的目的；如若篩得新的有益菌種，還可以突破原有風味和口感，創(chuàng)造更多可能性。張先琴等[76]對中國四川地區(qū)的泡菜制品進行了詳細研究，發(fā)現一種植物乳桿菌在該地的泡菜發(fā)酵中起到重要作用，不僅使這種特色泡菜具有更好的色香味，還明顯抑制了其中亞硝酸鹽的生成。

發(fā)酵食品的風味物質調控是通過物理學、化學及生物學等理論知識綜合應用實現的。雖然風味物質生產調控可以在發(fā)酵工藝中的每一步進行，即可通過改善每一步操作實現，但其核心的手段是通過了解微生物菌群狀態(tài)、利用宏基因學技術建立風味物質代謝途徑，從根本上調控以得到更受人們歡迎的風味和口感。

5.6 傳統(tǒng)發(fā)酵食品的異味控制方法

異味并不指某種特定的味道，而是人們品嘗時，所得的與固有的香、味對比之下不協(xié)調的味道。為滿足人們對食品的感官需求，需要找到合適的調節(jié)方式來控制異味的產生。異味產生的原理和香味如出一轍，不同點在于是否受人們歡迎。有產生香味的物質，就有產生異味的物質；且一些呈味物質由于濃度高低可產生不同味道；多種物質之間的配比或復雜的相互作用亦影響著最終味道的呈現。因此產生香味和異味的物質難以徹底區(qū)分。

有研究綜合分析了白酒中可能產生的各類型異味物質（苦味、澀味、糠味、霉味等）及預防措施。該研究表明，酒類飲品的異味控制主要從原輔料合理選擇與配比、發(fā)酵各工藝嚴格控制衛(wèi)生合格、產品創(chuàng)新調配方式等3 個方面控制酒的異味產生以改變酒的品質[77]。白酒發(fā)酵過程中會產生窖泥臭的具體物質為4-甲基苯酚（p-cresol PC），針對此類臭味物質，有專利提出通過生物手段，即控制發(fā)酵菌種（加入功能菌抑制同屬原有菌）來達到控制白酒中最終PC 含量的目的[78]。Park 等[79]以一種發(fā)酵豆醬為原料進行研究。通過對比，發(fā)現發(fā)酵前加入薏苡并與大豆以4∶1 進行配比，能夠使該種豆醬異味降到最低。Jeong 等[80]對韓國一種典型水煮泡菜的整個發(fā)酵過程進行了分析，揭示了整個過程中微生物的群落演替以及代謝產物變化。他們推測一種無糖酵母可能導致該食品產生異味。為解決這類問題，需要掌握微生物的變化，才能夠探明異味物質產生的時間和原因，從而作出相應的措施以抑制或剔除異味物質。

綜上所述，發(fā)酵食品的風味調控和異味調控異曲同工，均源自原輔料、發(fā)酵工藝及環(huán)境、微生物代謝活動、產生的各風味物質之間復雜的反應；相應的解決措施大同小異，通過物理、化學、生物學的手段控制原輔料質量、發(fā)酵菌種種類及數量、發(fā)酵工藝條件，以調配各風味物質濃度及配比，從而得到所需要的風味。

6 總結與展望

目前對傳統(tǒng)發(fā)酵食品的研究比較多，發(fā)酵食品種類繁多，風味物質以醇類、酸類等為主；異味物質以醇類、硫化物、醛類、多肽和氨基酸為主；微生物大多以乳酸菌屬、酵母菌屬、糖多孢菌屬、曲霉菌屬等為主。為更好的研究傳統(tǒng)發(fā)酵食品的產香機制和微生物的相關性，可利用主成分分析（PCA）等技術研究傳統(tǒng)發(fā)酵食品的品質分類以及風味分析，為發(fā)酵食品的標準化和工業(yè)化生產奠定基礎。而對于產品品質的把控，主要以風味物質和異味物質的調控為主，通過控制原輔料質量、發(fā)酵菌種種類及數量、發(fā)酵工藝條件等來達到所需風味。

近年來，隨著高通量測序技術的發(fā)展和多組學技術的廣泛應用，聯合偏最小二回歸乘法回歸分析等分析方法，使得我們可以進一步了解發(fā)酵食品中風味物質與微生物之間的相關性。今后發(fā)酵食品的主要研究應從如下幾個方面著手：（1）應用更加先進的儀器，更科學的分析方法，進一步深入了解發(fā)酵食品中的風味物質與微生物之間的相關性，明確各發(fā)酵食品的主要或特征風味物質成分；（2）深入研究特征風味物質與微生物菌群之間的關系，篩選出主要產香微生物并應用到食品發(fā)酵過程中，使得其風味口感更加優(yōu)良；（3）將純種發(fā)酵劑運用到食品發(fā)酵過程中，盡量避免異味風味物質的產生，提高發(fā)酵食品的風味品質。