馬運(yùn)濤 祁樂(lè)

(1天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，天津 300381；2天津中醫(yī)藥大學(xué))

糖尿病周圍神經(jīng)病變(DPN)是糖尿病常見(jiàn)的慢性并發(fā)癥，也是糖尿病患者致殘的主要原因之一。其中約1/3的患者會(huì)發(fā)生痛性DPN(PDPN)〔1〕，以肢體遠(yuǎn)端受累為主，可有針扎樣、燒灼樣、撕裂樣、觸碰敏感性疼痛等多種臨床表現(xiàn)，疼痛常在夜間加重。PDPN屬于神經(jīng)病理性疼痛，其神經(jīng)痛主要原因在于外周神經(jīng)受損〔2〕，其發(fā)病機(jī)制除受自身遺傳因素影響外，還可通過(guò)氧化應(yīng)激損傷、血管損害、代謝紊亂等影響患者的血管及神經(jīng)，造成神經(jīng)變性壞死，嚴(yán)重影響神經(jīng)的傳導(dǎo)速度與敏感性。而且近年來(lái)亦有國(guó)內(nèi)外諸多研究證實(shí)PDPN發(fā)生與電壓門控鉀離子通道(KCNQ)功能障礙相關(guān)。鉀離子通道廣泛分布于各組織細(xì)胞表面，尤其對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的膜電位和興奮性起重要作用，其中KCNQ2/5蛋白表達(dá)和活性水平下調(diào)，在PDPN發(fā)病機(jī)制中起到關(guān)鍵性作用〔3〕。有研究證實(shí)烏頭湯對(duì)急慢性疼痛有鎮(zhèn)痛作用，也具有抗炎、抗氧化和免疫調(diào)節(jié)的生物活性的作用〔4〕。臨床以烏頭湯辨證加減治療PDPN，根據(jù)患者臨床表現(xiàn)酌情增加川烏劑量，可顯著改善患者肢體疼痛、麻木的癥狀，并可獲得持續(xù)性療效〔5〕。本研究通過(guò)觀察烏頭湯對(duì)PDPN大鼠痛覺(jué)行為指標(biāo)及KCNQ2/5通道蛋白表達(dá)的影響，探討烏頭湯治療PDPN的內(nèi)在作用機(jī)制，為臨床治療PDPN提供依據(jù)和方法。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)健康雄性Wistar大鼠150只，體重(200±20)g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)SCXK(京)2016-0011。適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w后隨機(jī)分為正常組30只，造模組120只。

1.2實(shí)驗(yàn)藥物 鏈脲佐菌素(STZ，100 mg，sigama，產(chǎn)品批號(hào)：s0130)；烏頭湯中藥配方顆粒由四川新綠色藥業(yè)科技發(fā)展有限公司提供。制川烏(產(chǎn)品批號(hào)：18110132)、麻黃(產(chǎn)品批號(hào)：18100067)、黃芪(產(chǎn)品批號(hào)：19090015)、白芍(產(chǎn)品批號(hào)：19080023)、甘草(產(chǎn)品批號(hào)：19100006)。

1.3模型制備與分組 正常組普通飼料喂養(yǎng)，造模組高脂飼料喂養(yǎng)8 w后，造模組大鼠尾靜脈注射2%鏈脲佐菌素-檸檬酸鈉混合溶液(25 mg/kg)，正常組大鼠尾靜脈注射同等劑量(25 mg/kg)檸檬酸鈉緩沖液，1 w后造模組大鼠血糖大于16.7 mmol/L則為糖尿病模型大鼠。普通飼料喂養(yǎng)4 w后測(cè)量糖尿病大鼠熱痛覺(jué)及機(jī)械性痛覺(jué)篩選出PDPN大鼠模型。成功造模112只，隨機(jī)分為模型組28只，烏頭湯低、中、高劑量組各28只。

1.4干預(yù)方法 烏頭湯低、中、高劑量組分別予以烏頭湯中藥配方顆粒4.5 g/(kg·d)、 9.0 g/(kg·d)、18.0 g/(kg·d)，用生理鹽水配成混懸液，按10 ml/kg容積灌胃；正常組與模型組分別灌胃予以同等容積的生理鹽水，每日1次，連續(xù)12 w。

1.5檢測(cè)指標(biāo)與方法

1.5.1大鼠一般狀況及體重 觀察大鼠精神狀態(tài)，反應(yīng)情況，活動(dòng)情況，進(jìn)食、飲水、排尿、排便情況，毛發(fā)光澤度，尾靜脈注射處有無(wú)感染、壞死等一般情況。給藥前及給藥過(guò)程中每4 w測(cè)量一次體重，做好記錄。

1.5.2大鼠血糖監(jiān)測(cè) 給藥前及給藥過(guò)程中每4 w通過(guò)大鼠目?jī)?nèi)眥取血，測(cè)量各組大鼠空腹血糖。

1.5.3大鼠50%縮足反應(yīng)閾值監(jiān)測(cè) 采用弗萊毛(von Frey hair，North Coast，美國(guó))細(xì)絲測(cè)定大鼠神經(jīng)50%縮足反應(yīng)閾值。將大鼠置于高架金屬網(wǎng)格內(nèi)，適應(yīng)15 min 后，用不同力度的 von Frey 細(xì)絲刺激大鼠右后足底中部皮膚，觀察其有無(wú)縮足或舔足反應(yīng)。從有陽(yáng)性反應(yīng)起連續(xù)測(cè)量5次，記錄相應(yīng)的細(xì)絲力度(f)，通過(guò)公式計(jì)算其50%縮足反應(yīng)閾值。

1.5.4大鼠甩尾時(shí)間監(jiān)測(cè) 將大鼠尾部下1/3浸入溫度設(shè)置為(52.5±0.5)℃水浴鍋中，儀器自動(dòng)記錄鼠尾從浸入水面到甩離水面的時(shí)間，剔除時(shí)間小于0.1 s及大于20 s的數(shù)值。

1.5.5大鼠坐骨神經(jīng)電鏡觀察 給藥12 w結(jié)束后，腹腔注射10%水合氯醛麻醉后處死，取雙側(cè)坐骨神經(jīng)約1 cm，置于4%多聚甲醛中固定24 h后，充分流水沖洗，乙醇梯度脫水，二甲苯透明石蠟包埋，厚度2 μm連續(xù)病理切片，分別進(jìn)行蘇木素染色、伊紅染色后，進(jìn)行脫水封片，在電鏡下觀察超微結(jié)構(gòu)。

1.5.6大鼠L4～6背根神經(jīng)節(jié)及脊髓KCNQ2/5通道蛋白表達(dá) 給藥12 w結(jié)束后，腹腔注射10%水合氯醛麻醉后處死，取L4～6背根神經(jīng)節(jié)和脊髓組織，4℃生理鹽水沖洗后，放入凍存管中，-80℃冰箱保存。取相應(yīng)組織稱重，進(jìn)行總蛋白提取，測(cè)定蛋白含量及蛋白變性后，在電泳槽內(nèi)上樣電泳及轉(zhuǎn)膜，將轉(zhuǎn)膜后的聚偏氟乙烯(PVDF)膜放入封閉液中，室溫?fù)u床緩慢封閉2 h，分別加入兔抗KCNQ2/5多克隆抗體，4℃冰箱孵育過(guò)夜，TBST溶液快速漂洗，滴加二抗孵育，顯影后進(jìn)行Western印跡曝光成像拍照分析，應(yīng)用Image J分析目的蛋白條帶的灰度值與β-actin內(nèi)參條帶的灰度值，計(jì)算蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.6統(tǒng)計(jì)方法 采用SPSS17.0軟件進(jìn)行配對(duì)t檢驗(yàn)(方差不齊時(shí)采用t′檢驗(yàn))、單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1大鼠一般情況 正常組大鼠精神狀態(tài)良好，毛發(fā)潔凈純白有光澤，反應(yīng)敏捷，飲食水及尿量正常；模型組大鼠精神萎靡，毛色枯黃少光澤，行動(dòng)遲緩，出現(xiàn)“三多一少”的典型癥狀，飲食水及尿量均明顯增加；烏頭湯治療組大鼠與模型組比較精神狀態(tài)稍好，行動(dòng)較活躍，但飲食水及尿量情況無(wú)明顯變化。

2.2各組不同時(shí)間點(diǎn)體重比較 給藥前模型組及烏頭湯各劑量組體重較正常組明顯升高(P<0.01)，模型組與烏頭湯組體重?zé)o顯著性差異(P>0.05)；給藥4 w時(shí)，模型組體重較正常組明顯升高(P<0.01)，烏頭湯低、中劑量組體重較模型組明顯降低(P<0.01)，烏頭湯高劑量組體重與模型組無(wú)顯著性差異(P>0.05)；給藥8 w時(shí)，正常組、模型組及烏頭湯高劑量組體重?zé)o顯著性差異(P>0.05)，烏頭湯低、中劑量組體重較模型組降低(P<0.05)；給藥12 w時(shí)，正常組較模型組體重明顯升高(P<0.01)，烏頭湯低、中劑量組體重較模型組降低(P<0.05)，烏頭湯高劑量組體重與模型組無(wú)顯著性差異(P>0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組不同時(shí)間點(diǎn)體重及血糖比較

2.3各組不同時(shí)間點(diǎn)血糖比較 同一時(shí)間點(diǎn)，模型組較正常組血糖明顯升高(P<0.01)；給藥前，模型組與烏頭湯各劑量組血糖無(wú)顯著性差異(P>0.05)；給藥4 w時(shí)，烏頭湯低、中、高劑量組較模型組血糖明顯降低(P<0.01)；給藥8 w時(shí)，烏頭湯低、高劑量組較模型組血糖降低(P<0.05)，烏頭湯中劑量組與模型組血糖無(wú)顯著性差異(P>0.05)；給藥12 w時(shí)，烏頭湯低、中、高劑量組與模型組血糖無(wú)顯著性差異(P>0.05)。見(jiàn)表1。

2.4各組不同時(shí)間點(diǎn)50%縮足反應(yīng)閾值比較 給藥前，模型組及烏頭湯各劑量組50%縮足反應(yīng)閾值較正常組明顯升高(P<0.01)，模型組與烏頭湯各劑量組50%縮足反應(yīng)閾值無(wú)顯著性差異(P>0.05)；給藥4 w時(shí)，模型組50%縮足反應(yīng)閾值較正常組明顯升高(P<0.01)，烏頭湯中、高劑量組50%縮足反應(yīng)閾值較模型組明顯降低(P<0.01)，烏頭湯低劑量組較模型組50%縮足反應(yīng)閾值無(wú)顯著性差異(P>0.05)；給藥8 w及12 w時(shí)，模型組50%縮足反應(yīng)閾值較正常組明顯升高(P<0.01)，烏頭湯低、中、高劑量組50%縮足反應(yīng)閾值較模型組明顯降低(P<0.01)。見(jiàn)表2。

表2 各組不同時(shí)間點(diǎn)50%縮足反應(yīng)閾值比較

2.5各組不同時(shí)間點(diǎn)甩尾時(shí)間 給藥前，模型組及烏頭湯各劑量組甩尾時(shí)間較正常組明顯延長(zhǎng)(P<0.01)，模型組與烏頭湯各劑量組甩尾時(shí)間無(wú)顯著性差異(P>0.05)；給藥4 w時(shí)，各組甩尾時(shí)間無(wú)顯著性差異(P>0.05)；給藥8 w時(shí)，模型組甩尾時(shí)間與正常組及烏頭湯高劑量組無(wú)顯著性差異(P>0.05)，烏頭湯低、中劑量組甩尾時(shí)間較模型組顯著縮短(P<0.01，P<0.05)；給藥12 w時(shí)，模型組甩尾時(shí)間較正常組明顯延長(zhǎng)(P<0.01)，烏頭湯低、中、高劑量組甩尾時(shí)間較模型組明顯縮短(P<0.01)。見(jiàn)表3。

表3 各組不同時(shí)間點(diǎn)甩尾時(shí)間比較

2.6坐骨神經(jīng)病理學(xué)觀察 正常組坐骨神經(jīng)排列緊密、結(jié)構(gòu)整齊有序，神經(jīng)纖維髓鞘致密、均勻，排列規(guī)則且層次分明，其間散見(jiàn)雪旺細(xì)胞。模型組坐骨神經(jīng)排列混亂，結(jié)構(gòu)疏松無(wú)序，神經(jīng)纖維髓鞘明顯增寬，分布不均勻，板層結(jié)構(gòu)紊亂，有的出現(xiàn)節(jié)段性脫髓鞘，軸索萎縮，部分雪旺細(xì)胞變性壞死，上述病理改變提示PDPN模型造模成功。烏頭湯低、中、高劑量組坐骨神經(jīng)病理?yè)p傷與模型組相比，均有不同程度的改善，神經(jīng)排列相對(duì)緊密，結(jié)構(gòu)相對(duì)整齊有序，髓鞘分布相對(duì)均勻。見(jiàn)圖1。

2.7L4-6背根神經(jīng)節(jié)KCNQ2、KCNQ5蛋白相對(duì)表達(dá)量 與正常組相比，模型組KCNQ2、KCNQ5蛋白相對(duì)表達(dá)量均明顯降低(P<0.01)；與模型組相比，烏頭湯低、中、高劑量組KCNQ2、KCNQ5蛋白相對(duì)表達(dá)量均明顯升高(P<0.01)。與正常組相比，烏頭湯高劑量組KCNQ5蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯升高(P<0.01)，烏頭湯中、高劑量組KCNQ2蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯升高(P<0.01)，見(jiàn)表4、圖2。

圖1 各組坐骨神經(jīng)病理學(xué)觀察(×400)

表4 各組KCNQ2、KCNQ5蛋白表達(dá)比較

1～5：正常組、模型組、烏頭湯低劑量組、烏頭湯中劑量組、烏頭湯高劑量組圖2 Western 印跡檢測(cè)KCNQ2、KCNQ5蛋白表達(dá)

3 討 論

PDPN是因糖尿病導(dǎo)致周圍神經(jīng)結(jié)構(gòu)和功能改變而誘發(fā)的慢性神經(jīng)病理性疼痛。PDPN患者的感覺(jué)障礙比較明顯，除病變處的麻木感、震動(dòng)感及患者的感覺(jué)減退、喪失外，更多表現(xiàn)為自發(fā)性疼痛〔6〕。隨著對(duì)糖尿病并發(fā)癥的深入研究，PDPN的發(fā)病機(jī)制也有著廣泛的探討，主要包括：代謝紊亂、血管損害、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子、氧化應(yīng)激的損傷、炎癥反應(yīng)、自身免疫的損傷、遺傳因素、神經(jīng)元細(xì)胞膜離子通道功能障礙、蛋白激酶(PK)C、致痛因子等〔7〕。雖然其具體的發(fā)病機(jī)制尚不明確，但由于胰島素分泌不足及外周血管功能不全所導(dǎo)致的神經(jīng)損傷這一病理因素已得到共識(shí)。

鉀離子通道是選擇性鉀離子通道，廣泛分布于骨骼肌、神經(jīng)、血管、胃腸道及腺體細(xì)胞中，在調(diào)節(jié)神經(jīng)細(xì)胞興奮性及膜電位中起重要作用。電壓門控鉀離子通道KCNQ屬于延遲整流型鉀離子通道，其中KCNQ2/5通道參與構(gòu)成M電流，M電流是一種具有電壓依賴性、慢激活、非失活、慢去活的外向鉀電流，對(duì)于維持和穩(wěn)定神經(jīng)元的興奮性發(fā)揮著重要作用〔8〕。Everill等〔9〕研究證實(shí)，神經(jīng)元損傷后M電流減少，可致神經(jīng)興奮性升高，從而出現(xiàn)痛覺(jué)過(guò)敏。亦有學(xué)者報(bào)道KCNQ2/5開(kāi)放劑瑞替加濱可有效治療神經(jīng)結(jié)扎模型所產(chǎn)生的神經(jīng)病理性疼痛〔10〕。所以KCNQ2/5通道電流在神經(jīng)病理性疼痛中發(fā)揮關(guān)鍵作用，從而上調(diào)KCNQ2/5蛋白表達(dá)，增強(qiáng)KCNQ2/5通道的開(kāi)放可作為疼痛治療的思路。

本研究提示PDPN大鼠的神經(jīng)損傷得到一定程度的修復(fù)。經(jīng)烏頭湯治療后PDPN大鼠機(jī)械痛覺(jué)及熱痛覺(jué)敏感性均較模型組增強(qiáng)，也證實(shí)其神經(jīng)傳導(dǎo)速度的提高。說(shuō)明烏頭湯具有改善PDPN大鼠對(duì)于機(jī)械痛覺(jué)及熱痛覺(jué)的敏感程度，修復(fù)受損神經(jīng)、改善神經(jīng)傳導(dǎo)功能，從而起到緩解PDPN疼痛的作用。模型組PDPN大鼠KCNQ2/5蛋白表達(dá)較正常組均明顯下降，從而導(dǎo)致M電流減弱，神經(jīng)元興奮性增加，產(chǎn)生神經(jīng)病理性疼痛。經(jīng)烏頭湯低、中、高劑量灌胃治療后大鼠KCNQ2/5蛋白表達(dá)較模型組均明顯升高；與正常組相比，烏頭湯中、高劑量組KCNQ2/5蛋白表達(dá)亦有不同程度升高，證實(shí)烏頭湯可上調(diào)KCNQ2/5通道的表達(dá)，增強(qiáng)M電流，使神經(jīng)元維持正常的興奮狀態(tài)，從而減輕疼痛，且其療效與藥劑量呈正相關(guān)性。綜上，烏頭湯可修復(fù)PDPN大鼠受損神經(jīng)，提高神經(jīng)傳導(dǎo)功能，改善對(duì)于機(jī)械痛覺(jué)及熱痛覺(jué)的敏感程度，同時(shí)可修正KCNQ2/5通道的表達(dá)和活性，從而減輕PDPN所引起神經(jīng)性疼痛癥狀，為其進(jìn)一步臨床應(yīng)用奠定了理論基礎(chǔ)。