王慧 陳靈芝 許劍蘭 鄭成芳

(海南西部中心醫(yī)院感染科，海南 儋州 571700)

自身免疫性肝病(AILD)是機(jī)體過(guò)度免疫，免疫系統(tǒng)攻擊自身的肝組織所造成的一種肝臟的炎癥性疾病。其性別、年齡分布與紅斑狼瘡相似，且常伴有肝外癥狀，甚至可見(jiàn)“紅斑狼瘡”癥狀，包括自身免疫性肝炎(AIH)、原發(fā)性膽汁性肝管炎(PBC)和原發(fā)性硬化性膽管炎(PSC)〔1～3〕。肝組織內(nèi)T淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)是AILD的特征之一，因此T淋巴亞群可能與該病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。研究表明CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)在控制自身免疫反應(yīng)及維持免疫耐受方面起著關(guān)鍵作用〔4～6〕。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn)CD4+CD25+Treg異?？梢詫?dǎo)致自身免疫性疾病〔7〕。但有關(guān)CD4+CD25+Treg在AILD中表達(dá)情況及與疾病活動(dòng)性關(guān)系國(guó)內(nèi)研究較少。因此本研究采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)AILD活動(dòng)期、緩解期及體檢健康者患者外周血CD4+CD25+Treg比例，觀察CD4+CD25+Treg比例與疾病活動(dòng)性的關(guān)系及CD4+CD25+Treg比例與肝功能、細(xì)胞因子之間關(guān)系。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2015年2月至2019年4月海南西部中心醫(yī)院感染科老年AILD患者129例，其中AIH 43例，PBC 42例，PSC 44例。AILD患者均符合AILD描述性診斷標(biāo)準(zhǔn)〔8〕。將入選病例根據(jù)疾病活動(dòng)期不同分為疾病活動(dòng)期(活動(dòng)期組)70例，自身抗體陽(yáng)性，肝功能異常；男31例，女39例；年齡60～77歲，平均年齡(65.26±6.81)歲。緩解期59例(緩解期組)，激素治療后患者血清轉(zhuǎn)氨酶和膽紅素水平正常且維持6個(gè)月以上者；男27例，女32例；年齡60～80歲，平均年齡(65.61±9.13)歲。另選取體檢健康者65例(健康對(duì)照組)，其中男31例，女34例；年齡61～80歲，平均年齡(66.38±9.74)歲。三組患者性別、年齡、類型比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。本研究經(jīng)過(guò)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者知情并簽署知情同意書(shū)。

1.2血標(biāo)本采集 抽取所有受試者清晨空腹外周靜脈血5 ml，置入真空采血管當(dāng)中，以3 000 r/min 離心20 min后吸取上層血清待檢。

1.3流式細(xì)胞儀檢測(cè) 取各組血標(biāo)本100 μl置于流式管中，加入全血標(biāo)本 100 μl，健康對(duì)照組組樣本內(nèi)加藻紅蛋白(PE)/異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記的鼠抗人IgG-1 抗體各 20 μl，緩解期組和活動(dòng)期組樣本加PE標(biāo)記的鼠抗人CD4抗體，F(xiàn)ITC標(biāo)記的鼠抗人 CD25 抗體各20 μl，渦旋振蕩器混勻，于室溫下避光反應(yīng)15 min，加入溶血素1 ml，室溫避光20 min，加入磷酸鹽緩沖液(PBS) 2 ml，離心，棄上清，加入1%多聚甲醛 500 μl 重懸細(xì)胞，上機(jī)檢測(cè)CD4+CD25+Treg比例。上機(jī)前常規(guī)對(duì)流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)，控制儀器各項(xiàng)指標(biāo)在質(zhì)控允許值內(nèi)。上機(jī)檢測(cè)時(shí)首先按照前向散射(FSC)和側(cè)向角散射(SSC)光信號(hào)予淋巴細(xì)胞群設(shè)門(mén)，每份檢測(cè)標(biāo)本獲取設(shè)門(mén)內(nèi)10 000個(gè)細(xì)胞，檢測(cè)后所得數(shù)據(jù)以Listmode文件形式保存。

1.4相關(guān)指標(biāo)檢測(cè) 運(yùn)用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)肝功能指標(biāo)總膽紅素(TBIL)、直接膽紅素(DBIL)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、堿性磷酸酶(ALP)、γ谷氨轉(zhuǎn)肽酶(γ-GT)。

采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)血清細(xì)胞因子白細(xì)胞介素(IL)-2、干擾素(IFN)-γ、IL-4、IL-10、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)-β1。試劑盒均購(gòu)自武漢明德生物科技股份有限公司。檢測(cè)過(guò)程嚴(yán)格按照試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、方差分析、Pearson相關(guān)分析；繪制受試者工作特征(ROC)曲線。

2 結(jié) 果

2.1三組外周血CD4+CD25+Treg檢測(cè)結(jié)果比較 活動(dòng)期組、緩解期組、健康對(duì)照組CD4+CD25+Treg比例分別為(1.61±0.51)%、(3.53±0.63)%、(3.62±0.71)%，與健康對(duì)照組相比，活動(dòng)期組外周血CD4+CD25+Treg比例顯著降低(P<0.05)，而緩解期組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)圖1。

2.2三組肝功能指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果比較 與健康對(duì)照組相比，緩解期組肝功能指標(biāo)差異不顯著(P>0.05)，活動(dòng)期組肝功能指標(biāo)均顯著升高(P<0.05)；與緩解期組相比，活動(dòng)期組肝功能指標(biāo)均顯著升高(P<0.05)。見(jiàn)表1。

2.3三組血清細(xì)胞因子比較 活動(dòng)期組血清中IL-4、IL-10水平較健康對(duì)照組及緩解期組顯著降低(P<0.05)，而血清中IL-2、IFN-γ、TGF-β1則顯著升高(P<0.05)；緩解期組上述指標(biāo)與健康對(duì)照組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表2。

圖1 CD4+ CD25+ Treg檢測(cè)結(jié)果

表1 三組肝功能指標(biāo)比較

表2 三組血清細(xì)胞因子比較

2.4相關(guān)性分析 CD4+CD25+Treg比例與肝功能指標(biāo)TBIL、ALT、AST、ALP呈負(fù)相關(guān)(r=-0.612、-0.597、-0.519、-0.635；P<0.05)，與DBIL、γ-GT無(wú)明顯相關(guān)性(r=0.113、0.254；P>0.05)；與細(xì)胞因子水平IL-2、INF-γ、TGF-β1呈負(fù)相關(guān)(r=-0.561、-0.579、-0.581；P<0.05)，與IL-4、IL-10呈正相關(guān)(r=0.712、0.653；P<0.05)。

2.5ROC曲線分析 以AILD疾病活動(dòng)性為二分類結(jié)局，繪制CD4+CD25+Treg的ROC曲線，CD4+CD25+Treg曲線下面積為0.809，截?cái)嘀禐?.12%，敏感度為73.1%，特異性為82.8%。見(jiàn)圖2。

圖2 CD4+ CD25+ Treg ROC曲線

3 討 論

正常情況下，人體對(duì)自身組織蛋白具有明顯耐受性，一旦失去這種耐受性，體內(nèi)淋巴系統(tǒng)不識(shí)別而攻擊組織蛋白，從而產(chǎn)生抗體，后者攻擊自身的靶組織細(xì)胞，使這類組織細(xì)胞受損而引起病理改變,出現(xiàn)功能障礙〔9～11〕。AIH主要表現(xiàn)為肝臟炎癥，PBC與PSC主要是膽道受損〔12〕。AILD的危害在于它的發(fā)生發(fā)展多較隱蔽，等到有明顯癥狀時(shí)往往就到了中晚期〔13〕。及時(shí)有效治療可以延緩這種疾病的進(jìn)程，因此，發(fā)現(xiàn)得越早越好。病因尚未明了，一般認(rèn)為免疫系統(tǒng)針對(duì)自身抗原的靶向錯(cuò)亂是機(jī)體自身免疫性疾病的主要原因，肝組織內(nèi)T淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)是AILD的特征之一〔14〕，因此T淋巴亞群可能與該病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。許多研究表明CD4+CD25+Treg在控制自身免疫反應(yīng)及維持免疫耐受方面起著關(guān)鍵作用〔15〕。

Andaloussi等〔16〕將CD4+CD25+Treg缺陷的小鼠的T細(xì)胞轉(zhuǎn)移到裸鼠中會(huì)導(dǎo)致多種自身免疫性疾病，而預(yù)先輸入CD4+CD25+Treg可預(yù)防這類疾病的發(fā)生；將正常小鼠脾臟的CD4+T細(xì)胞去除CD25+細(xì)胞后轉(zhuǎn)移給同基因型T細(xì)胞缺陷小鼠將導(dǎo)致各種器官特異性自身免疫性疾病和系統(tǒng)性消耗疾病，而注射CD4+CD25+細(xì)胞群可以抑制這些自身免疫疾病的發(fā)生，從而最早證明了該群細(xì)胞具備免疫調(diào)節(jié)能力。徐安琪等〔17〕在研究系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者外周血本研究中CD4+CD25+Treg中，CD4+CD25+Treg在活動(dòng)期AILD活動(dòng)期顯著降低。系統(tǒng)性紅斑狼瘡亦屬于自身免疫性疾病，對(duì)本研究存在一定借鑒意義。本研究結(jié)果表明CD4+CD25+Treg與疾病活動(dòng)性密切相關(guān)，而體檢健康者與疾病緩解期相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可能因?yàn)榫徑馄诨颊咦陨砻庖吖δ苴呌谡Ｋ健reg被認(rèn)為是一種獨(dú)立的CD4+T細(xì)胞亞群，主要功能是抑制其他T細(xì)胞的活化，以調(diào)節(jié)自身反應(yīng)性T細(xì)胞為主，維持自身免疫耐受性，阻止針對(duì)自身抗原的炎癥反應(yīng)，限制自身免疫病的發(fā)展〔18〕。Treg 細(xì)胞可分泌細(xì)胞因子IL-10和 TGF-β1，其中IL-10具有明顯的抑制效應(yīng)T細(xì)胞的功能，可直接抑制IL-2的產(chǎn)生，從而抑制自身免疫性疾病的炎癥反應(yīng)，TGF-β1可促進(jìn)CD4+CD25-Treg向CD4+CD25+Treg轉(zhuǎn)化〔19〕。CD4+CD25+Treg細(xì)胞亦可分泌Th2型細(xì)胞因子IL-4，抑制自身免疫性反應(yīng)〔20〕。Th1細(xì)胞主要分泌IFN-γ和IL-2，IL-4、IL-10 的分泌代表了Th2 細(xì)胞亞群的活化水平，Th1/Th2 比例失調(diào)，出現(xiàn)“Th1優(yōu)勢(shì)”反應(yīng)是造成系統(tǒng)性自身免疫性疾病發(fā)病的原因之一〔18〕。本研究觀察到活動(dòng)期患者血清IL-4、IL-10 低于緩解期患者與體檢健康者，其中IL-10降低較為顯著，而IL-2、IFN-γ、TGF-β1水平則相反，因此出現(xiàn)“Th1 優(yōu)勢(shì)”。Pearson相關(guān)性分析顯示，CD4+CD25+Treg比例與肝功能指標(biāo)TBIL、ALT、AST、ALP、γ-GT呈負(fù)相關(guān)，與細(xì)胞因子水平IL-2、IFN-γ呈負(fù)相關(guān)，與IL-4、IL-10、TGF-β1呈正相關(guān)，其原因可能為CD4+CD25+Treg比例下降，IL-10和IL-4分泌量減少，不能維持免疫耐受，導(dǎo)致免疫系統(tǒng)攻擊自身的肝組織細(xì)胞，使肝組織細(xì)胞受損，出現(xiàn)肝功能障礙。

綜上所述，CD4+CD25+Treg與AILD疾病活動(dòng)性密切相關(guān)，與肝功能指標(biāo)、細(xì)胞因子密切相關(guān)，可能是導(dǎo)致疾病發(fā)生和病情發(fā)展的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一。免疫系統(tǒng)除CD4+CD25+Treg外，還有CD8+Treg以及效應(yīng)T細(xì)胞，多亞群在AILD疾病活動(dòng)性中作用有待進(jìn)一步研究。