賈欽堯 陳紹平 宋珊 韓美玲 李新勝

(川北醫(yī)學(xué)院 1藥學(xué)院，四川 南充 637000；2附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科；3武漢市肺科醫(yī)院；4安康市人民醫(yī)院)

慢性阻塞性肺疾病(COPD)是臨床常見的以持續(xù)性氣流受限為主要特征的慢性炎癥性疾病，患者存在不同程度的進行性肺功能降低及異常的對氣體和有毒顆粒的炎癥反應(yīng)，具有較高的發(fā)病率〔1〕。COPD的影響因素眾多，包括天氣、吸煙、感染、物理因素、化學(xué)因素等，其與機體免疫系統(tǒng)互相作用會誘發(fā)氣道慢性持續(xù)炎癥，導(dǎo)致氣道不完全阻塞和狹窄，支氣管軟骨受到破壞，肺組織彈性降低等，最終導(dǎo)致通氣功能下降。慢性氣道炎癥反應(yīng)被認為在COPD發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著核心作用。核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白(NLRP)3是參與炎癥反應(yīng)的重要蛋白，研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)COPD患者中NLRP3表達異常，其可能在COPD發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用〔2〕。王蕾等〔3〕研究發(fā)現(xiàn)NLRP3的表達與COPD疾病的嚴重程度密切相關(guān)。基因多態(tài)性是指存在兩種或多種不連續(xù)的變異型、基因型或等位基因，NLRP3基因的多態(tài)性與多種炎性疾病有關(guān)，包括類風濕關(guān)節(jié)炎、阿司匹林誘發(fā)哮喘等，但目前有關(guān)NLRP3基因與COPD之間的關(guān)系還未見研究報道〔4，5〕。本研究分析了4個近年來NLRP3基因和疾病相關(guān)研究的熱點區(qū)域，包括rs10754558、rs3806265、rs4612666和rs35829419，應(yīng)用TaqMan探針檢測法檢測這4個位點的單核苷酸多態(tài)性，分析NLRP3基因的多態(tài)性與COPD的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1一般資料 隨機選擇2017年10月至2018年10月在川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院確診的COPD患者共200例作為研究組，年齡52～73歲，平均(64.78±4.03)歲，選擇同期健康者60例作為對照組，年齡55～74歲，平均(65.28±3.99)歲，兩組的一般資料差異無統(tǒng)計學(xué)意義。本研究已經(jīng)獲得倫理委員會批準。

1.2納入和排除標準 納入標準：(1)年齡18～75歲；(2)符合COPD的診斷標準〔1〕；(3)資料完整；(4)簽署知情同意書。排除標準：(1)合并肺結(jié)核、哮喘、支氣管擴張等疾?。?2)合并其他部位感染；(3)合并惡性腫瘤。

1.3研究指標 患者在門診接受問卷調(diào)查，收集患者一般資料，其中吸煙定義為每日吸煙量>10支，吸煙時間>10年；飲酒定義為飲酒量為4個標準杯(56°白酒100 ml)，每周飲酒超過5次，飲酒時間超過5年。抽取患者外周靜脈血共10 ml，通過PCR-RFLP 技術(shù)檢測NLRP3基因的rs10754558、rs3806265、rs4612666和rs35829419 4個位點的單核苷酸多態(tài)性。使用酚-氯仿法從外周血淋巴細胞中提取所有參與者的基因組DNA。通過NanoDrop-2000c(Thermo Scientific，USA)檢測提取的DNA的濃度。使用0.2 μl光學(xué)96孔反應(yīng)板(ABI 7300，Biosystems，USA)進行NLRP3(rs10754558，rs3806265，rs4612666和rs35829419)基因分型。每個微孔中的總體積為20 μl，由10 μl的MasterMix(ABI 7300，Biosystems，USA)，0.5 μl AssayMix(ABI)，4.5 μl去離子水和5 μl DNA樣品(20 ng/ml)組成。制備含有1 000 MasterMix(2×)，50 μl AssayMix(4×)和450 μl去離子水的混合物，將15 μl混合物和5 μl DNA樣品加入每個微孔中。 PCR條件如下：95℃、10 min，40個循環(huán)，95℃、15 s，60℃、1 min，使用等位基因辨別程序確定結(jié)果。

1.4統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS19.0軟件進行t檢驗、F檢驗、χ2檢驗、Logistic回歸分析、Hardy-Weinberg平衡檢驗。

2 結(jié) 果

2.1兩組基本資料比較 研究組吸煙比例顯著高于對照組(P<0.05)，其他指標無顯著差異(P>0.05)，見表1。

2.2兩組NLRP3基因多態(tài)性分布比較 研究組NLRP3基因rs3806265位點的等位基因T的頻率顯著高于對照組(P<0.001)，研究組NLRP3基因rs3806265位點TT的基因型顯著高于對照組(P<0.001)，CT基因型顯著低于對照組(P<0.001)，其他點位基因多態(tài)性無顯著差異，見表2。

表1 兩組基本資料比較

表2 兩組NLRP3基因多態(tài)性分布比較〔n(%)〕

2.3COPD危險因素 Logistic 回歸分析 Logistic 回歸分析結(jié)果顯示吸煙〔OR=3.056,95%CI(1.956～6.757);P=0.011〕和rs3806265位點TT基因型〔OR=2.341,95%CI(1.194～4.689);P=0.023〕是COPD的危險因素(P<0.05)。

3 討 論

COPD在臨床上常表現(xiàn)為咳嗽咳痰、氣喘、呼吸困難，COPD患者若得不到有效的救治會誘發(fā)嚴重炎癥反應(yīng)及肺的纖維化，甚至導(dǎo)致呼吸衰竭，嚴重危害患者的生命健康。我國是COPD高發(fā)國家，COPD在40歲以上人群發(fā)病率高達8.2%，并且隨著空氣環(huán)境污染等原因，COPD的發(fā)病率有上升趨勢〔6〕。但是目前關(guān)于COPD的發(fā)病機制尚不明確，基因多態(tài)性可能是引起COPD的因素之一。

NLRP3是NLRPs蛋白家族中的典型成員，組成包括C-端亮氨酸重復(fù)序列、N-端PYD結(jié)構(gòu)域和中間的NACHT結(jié)構(gòu)域。經(jīng)C-端亮氨酸重復(fù)序列，NLRP3可識別三磷酸腺苷(ATP)、胞壁酰二肽(MDP)、內(nèi)毒素、尿酸、細胞裂解產(chǎn)物等配體，使其被激活并進一步導(dǎo)致其構(gòu)象發(fā)生變化，通過其PYD結(jié)構(gòu)域這一效應(yīng)結(jié)構(gòu)域其可募集帶有天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase)募集結(jié)構(gòu)域(CARD)的Caspase-1和凋亡相關(guān)的斑點樣蛋白(ASC)，形成NLRP3炎性體這一復(fù)雜的復(fù)合物。研究發(fā)現(xiàn)，NLRP3參與膿毒癥等炎性疾病的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)〔7〕。NLRP3可激活Caspase-1，激活的Caspase-1會進一步激活白細胞介素(IL)-1β和IL-18，導(dǎo)致促炎反應(yīng)，氧化應(yīng)激反應(yīng)、炎性因子會激活NLRP3，最終引起各種免疫炎癥反應(yīng)〔8〕。目前，NLRP3在慢性炎癥反應(yīng)、無菌性炎癥反應(yīng)和自身免疫性疾病等病理過程中的意義和作用備受關(guān)注，很多感染性疾病和自身免疫性疾病都涉及到NLRP3炎性體-Caspase-1-IL18/IL-1β軸的激活。

NLRP3基因的多態(tài)性參與多種炎性疾病的發(fā)生，研究發(fā)現(xiàn)rs10754558 隱性模型是哈薩克族老年原發(fā)性高血壓高危因素〔9〕。李賽等〔10〕研究認為山東漢族人群NLRP3基因rs2027432位點多態(tài)性與子癇前期的發(fā)生有關(guān)。國外也有研究顯示NLRP3基因rs4612666多態(tài)性與大動脈粥樣硬化性缺血性腦卒中和微栓子信號的發(fā)生有關(guān)〔11〕。Zhou等〔12〕研究認為NLRP3 rs10754558多態(tài)性與中國漢族人群冠狀動脈病變的發(fā)生及預(yù)后相關(guān)。已經(jīng)有研究證實NLRP3參與COPD的發(fā)生和COPD急性加重期的發(fā)生〔13〕，但是關(guān)于NLRP3基因多態(tài)性與COPD的研究極少。為了進一步探討NLRP3基因多態(tài)性與COPD的關(guān)系，本次研究共分析了NLRP3基因的rs10754558、rs3806265、rs4612666和rs35829419 4個對中國漢族人群重要的單核苷酸多態(tài)性(SNPs)位點的單核苷酸多態(tài)性，其中rs10754558被指出與人類免疫缺陷病毒(HIV)感染易感性有關(guān)，rs3806265被認為與葡萄膜炎的發(fā)病有關(guān)，rs4612666和rs35829419則被指出與骨髓增生異常綜合征、痛風等的易感性有關(guān)。Yu等〔14〕研究發(fā)現(xiàn)NLRP3基因rs3806265位點的多態(tài)性與銀屑病的發(fā)生有關(guān)。Bidoki等〔15〕的研究也發(fā)現(xiàn)復(fù)發(fā)性口瘡性口炎患者NLRP3 rs3806265 TT基因型的高頻率與其易感性有關(guān)。本研究提示rs3806265位點TT基因型是可能COPD的危險因素。這一結(jié)果證實，rs3806265 SNP位點的遺傳多態(tài)性可能會增加COPD的風險，TT基因型是COPD發(fā)病的危險因素。過往已經(jīng)有研究顯示吸煙是引起COPD的危險因素〔16〕。研究顯示吸煙是激活NLRP3炎性小體的因素之一〔17〕。Han等〔18〕研究顯示香煙煙霧提取物通過增加泛素介導(dǎo)的蛋白酶體加工調(diào)節(jié)NLRP3蛋白豐度，這提示吸煙與NLRP3和COPD的發(fā)生有關(guān)，因此，推測分析NLRP3基因的多態(tài)性可能是連接吸煙和COPD的中間環(huán)節(jié)。