佘巍巍 孫天壽 吳娟 蒙建鳳 唐海麗 宋文娟 李華

(1廣西南溪山醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，廣西 桂林 541001；2桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科)

支氣管哮喘(以下簡稱哮喘)是由多種炎性介質(zhì)、細(xì)胞組分及基因等參與的一種常見的慢性氣道炎癥性疾病，其發(fā)病率及死亡率近期在全球內(nèi)劇增，嚴(yán)重危害到廣大人民的健康。慢性氣道炎癥引起的損傷和修復(fù)的頻繁發(fā)生會導(dǎo)致氣道結(jié)構(gòu)的改變，統(tǒng)稱氣道重塑〔1〕。氣道重塑的特點是氣道壁增厚、上皮纖維化、氣道平滑肌增厚、血管生成和黏液腺體分泌增加〔2〕。一般來說，氣道重塑既往被認(rèn)為有助于氣道高反應(yīng)性和不可逆的氣流限制的形成。嚴(yán)重的哮喘具有明顯的病理生理學(xué)特征如氣道重塑，故會降低藥物標(biāo)準(zhǔn)化治療的有效性〔3〕。當(dāng)前哮喘氣道重塑的治療方法主要為支氣管擴(kuò)張劑和糖皮質(zhì)激素。糖皮質(zhì)激素是一種目前治療哮喘的最為有效的治療藥物，其能夠緩解出現(xiàn)支氣管哮喘的臨床癥狀、減輕哮喘的氣道炎癥反應(yīng)，但是對于早已經(jīng)形成的氣道結(jié)構(gòu)改變?nèi)鐨獾乐厮軈s是較難有效〔4〕。目前相關(guān)研究報道認(rèn)為，肺神經(jīng)生長因子(NGF)能增強(qiáng)氣道壁的氣道重塑及高反應(yīng)性，抗NGF可以抑制氣道高反應(yīng)性、抑制氣道重塑，并能減少哮喘的氣道重塑相關(guān)炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生〔5〕。然而，肺內(nèi)吸入抗NGF后在氣道重塑中的主要病理變化、作用機(jī)制及療效目前尚不清楚。本研究旨在探討肺內(nèi)靶向吸入NGF抗體抑制哮喘氣道重塑小鼠體內(nèi)NGF及轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β1的作用機(jī)制。

1 資料與方法

1.1實驗動物 體健BALB/c雌性小鼠的8～10周齡18只，隨機(jī)分為對照組、支氣管哮喘組、靶向吸入抗NGF組，由桂林醫(yī)學(xué)院動物實驗中心管理并喂養(yǎng)。所有的小鼠處于一個恒溫(22～24℃)恒濕(50%～55%)的環(huán)境中，房間內(nèi)進(jìn)行晝夜交替控制。

1.2主要試劑及器材 雞蛋卵蛋白(grade V，A5503；Sigma，St.louis，MO，USA)；SABC法試劑盒；氫氧化鋁；生理鹽水；鼠多克隆TGF-β1抗體(Abcam co.，Cambridge，UK)；β-actin抗體(1∶1000，IHC，F(xiàn)remont，CA)；TGF-β1試劑盒；漂烘片機(jī)；顯微鏡(日本奧林巴斯學(xué)工業(yè)株式會社生產(chǎn))；高速離心機(jī)；凝膠掃描成像系統(tǒng)。

1.3操作方法

1.3.1哮喘氣道重塑 動物模型參考Li等〔6〕及Vanacker等〔7〕的方案并做適當(dāng)改進(jìn)，由卵清蛋白(OVA)及氫氧化鋁凝膠制成的混合溶液(包括200 mg氫氧化鋁凝膠+OVA 10 mg并且采用經(jīng)腹腔內(nèi)注射在第1天和第7天)進(jìn)行致敏，對照組的小鼠給予同等劑量的無菌磷酸鹽進(jìn)行干預(yù)，該步驟將導(dǎo)致氣道高反應(yīng)性增加、氣道炎癥及Th2細(xì)胞因子的產(chǎn)生，達(dá)到急性期的目的。小鼠置于霧化箱里，反復(fù)將OVA液霧化吸入(5% OVA液進(jìn)行霧化30 min，3次/w)第35～71天時把小鼠進(jìn)行處死后，通過激發(fā)和誘導(dǎo)的方法而創(chuàng)建哮喘小鼠動物模型。靶向吸入抗NGF組將抗NGF液進(jìn)行肺內(nèi)霧化干預(yù)，每天1次，每次40 min(于第14～71天操作)，于每次哮喘小鼠吸入OVA液操作激發(fā)之前半小時再行抗NGF液的靶向吸入干預(yù)。將100 μg/ml抗NGF應(yīng)用于小鼠模型。抗NGF組管理的抗NGF抗體(4 ml/kg)在無菌1∶1 000磷酸鹽緩沖液(PBS)稀釋，上述操作都在哮喘小鼠進(jìn)行OVA液霧化激發(fā)前3 h。在使用OVA液操作激發(fā)前約3 h，哮喘小鼠模型使用4 ml/kg的PBS溶液預(yù)處理。小鼠的干預(yù)試驗的流程圖、干預(yù)時機(jī)和抗NGF液及濃度劑量均參考既往的試驗研究〔8〕。對照組將采用類似的實驗步驟進(jìn)行并給予無菌PBS液進(jìn)行對比。將各組小鼠的肺給予原位分子雜交的方法進(jìn)行檢測。

1.3.2肺組織病理標(biāo)本制作 取水合氯醛，行腹腔內(nèi)注射進(jìn)行麻醉以后，打開胸腔，先經(jīng)左心室而插管到達(dá)小鼠的升主動脈，然后用生理鹽水沖洗后采用多聚甲醛灌注而固定。迅速取出其肺部組織進(jìn)行標(biāo)本的制作，將肺組織先放置在多聚甲醛溶液中進(jìn)行固定，然后進(jìn)行石蠟包埋及切片，由病理醫(yī)師進(jìn)行觀察。

1.3.3免疫組織化學(xué)實驗 病理切片經(jīng)過石蠟包埋處理之后，現(xiàn)行滴加了山羊血清在室溫下封閉20 min，按照親和素生物素-過氧化物酶復(fù)合物方行免疫組化實驗，然后依次進(jìn)行孵育操作：①兔TGF-β1抗體及抗NGF的稀釋溶液中，保持在4℃的環(huán)境中給予過夜；②給予生物素標(biāo)記羊抗兔IgG抗體浸泡，放置在室溫條件下約2 h；③并行鏈霉親和素-生物素-過氧化物酶復(fù)合物在室溫下放置1 h。給予PBS液進(jìn)行漂洗5 min，然后再漂洗3次。接下來用二氨基聯(lián)苯胺予顯色的工作，然后對其給予蘇木素復(fù)染。最后將標(biāo)本予以脫水、透明并行中性樹膠予以封固，做成切片采用光鏡進(jìn)行觀察。陰性對照組的相關(guān)試驗采用PBS代替上述的抗體而進(jìn)行實驗。

1.3.4進(jìn)行原位分子雜交檢測 原位分子雜交檢測的方法為Arrigucci等〔9〕中采用的方法進(jìn)行操作。對肺TGF-β1和NGF及各自的mRNA的基因表達(dá)水平差異性進(jìn)行比較分析。其各自核苷酸的探針序列為：5′-CCACACGCTGACACTGTCACACACCGAG AA-3′，5′-GCTGTGATCAGAGTGTAGAACAACATGGAC-3′，5′-TATCCGGATAAACCGCCAGGCAGCCTGCTT-3′?；蚍治龅姆椒ㄓ璋闯Ｒ?guī)操作方法和步驟進(jìn)行，設(shè)置陰性對照的切片進(jìn)行對比分析。常規(guī)處理上述切片后，滴入稀釋的胃蛋白酶和枸櫞酸，在溫度37℃條件下消化20 min，采用專用的原位雜交PBS液里進(jìn)行洗滌5 min，反復(fù)重復(fù)3次。在42℃的溫度情況下的濕盒中再次滴加預(yù)雜交液并孵育4 h后，進(jìn)而滴加已準(zhǔn)備好的雜交液，在同樣42℃的溫盒內(nèi)完成雜交過程并且過夜，采用在37℃溫度條件下由標(biāo)準(zhǔn)的枸櫞酸鹽溶液進(jìn)行洗滌3次共5 min，在0.5×SSC培養(yǎng)基溶液中洗滌1次約15 min，在0.2×SSC培養(yǎng)基溶液中洗滌1次約15 min，然后再滴加封閉液，靜置30 min后，然后把鼠抗地高辛液滴入其中并靜置60 min，然后在PBS溶液中洗滌5 min共4次，再滴加到鏈霉親和素-生物素復(fù)合物(SABC)液中，然后給予滴加生物素化過氧化物酶，在37℃的溫度下靜置40 min，在PBS溶液中洗滌4次共 5 min。采用DAB正常程序脫水，并透明，平行DPX的方法封口，然后在光鏡條件下觀察。其中對照組采用PBS溶液代替以上的抗體來做對比試驗。

1.3.5影像分析方法及研判 測量每6個視野的陽性系數(shù)及灰度值并進(jìn)行分析，采用axioplan2的圖像處理系統(tǒng)來對原位雜交切片進(jìn)行處理以利于進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理。根據(jù)邢傳平等〔10〕所描述的計算方法進(jìn)行陽性系數(shù)的計算。TGF-β1、NGF和mRNA的陽性細(xì)胞經(jīng)過細(xì)胞染色成為陽性顆粒主要表現(xiàn)為棕色或棕黃色。

1.4統(tǒng)計學(xué)分析和處理方法 采用SPSS19.0軟件進(jìn)行LSD-t檢驗、方差分析、Mann WhiteneyU法、Kruskal-WallisH檢驗。

2 結(jié) 果

2.1各組NGF蛋白和NGF mRNA在肺組織中的表達(dá)情況比較 支氣管哮喘組NGF蛋白及mRNA平均陽性系數(shù)明顯高于對照組、靶向吸入抗NGF組(t=4.58、4.28、4.19、4.36，均P<0.01)。支氣管哮喘組NGF蛋白及mRNA灰度值明顯低于靶向吸入抗NGF組、對照組(t=25.9、20.1、49.8、16.8，均P<0.01)。見表1。

2.2TGF-β1蛋白及mRNA的表達(dá) 支氣管哮喘組TGF-β1 mRNA及蛋白平均陽性系數(shù)明顯高于靶向吸入抗NGF組、對照組(t=3.98、4.22、4.26、4.21，均P<0.01)，平均灰度值明顯低于靶向吸入抗NGF組、對照組(t=31.16、21.56、42.06、15.36，均P<0.01)，見表2。支氣管哮喘組的肺內(nèi)氣道上皮及周圍部分有較多的以TGF-β1蛋白為主的陽性細(xì)胞存在，但是靶向吸入抗NGF組則明顯弱表達(dá)(TGF-β1蛋白為主的陽性細(xì)胞則明顯減少)，對照組則僅見少量陽性細(xì)胞。

表1 各組肺組織NGF mRNA及蛋白的平均灰度值和均平陽性系數(shù)比較

表2 各組TGF-β1蛋白和TGF-β1 mRNA平均陽性系數(shù)及平均灰度值比較

3 討 論

支氣管哮喘為常見的慢性氣道過敏性和氣道炎癥性疾病，哮喘的氣道炎癥的發(fā)生、調(diào)控和氣道的神經(jīng)系統(tǒng)相互之間有著非常復(fù)雜的關(guān)系。已有研究提示哮喘的NGF和受體酪氨酸激酶(Trk)A抗體比正常組顯著增高〔11〕。哮喘組其血清及肺泡灌洗液檢驗結(jié)果均比NGF組有明顯增加〔12〕。近期多位學(xué)者和研究〔13，14〕都表明TGF-β1可以明顯促進(jìn)哮喘氣道炎癥發(fā)展，并且發(fā)現(xiàn)哮喘組小鼠血清及支氣管肺泡灌洗液(BALF)中TGF-β1濃度顯著高于對照組。其是通過趨化激活中性粒細(xì)胞等炎性細(xì)胞共同參與哮喘氣道炎癥的產(chǎn)生，并在氣道炎癥的持續(xù)及放大中起到非常重要擴(kuò)增作用，這提示TGF-β1在支氣管哮喘氣道炎癥的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮著非常關(guān)鍵的作用〔15〕。根據(jù)本研究推斷哮喘小鼠發(fā)作時可能是由于肺組織TGF-β1 mRNA的表達(dá)增多和TGF-β1的產(chǎn)生增加所導(dǎo)致的。通過靶向吸入抗NGF液后可以顯著的降低支氣管哮喘小鼠模型肺內(nèi)TGF-β1-mRNA的表達(dá)水平，提示靶向吸入抗NGF可能是通過降低TGF-β1的表達(dá)水平這一信號通路而參與到支氣管哮喘發(fā)病機(jī)制中去的。反之，NGF可能是通過增加了哮喘小鼠肺組織內(nèi)的TGF-β1-mRNA其肺內(nèi)的表達(dá)量進(jìn)而調(diào)控和參與到支氣管哮喘的發(fā)病機(jī)制中去的。從研究中我們發(fā)現(xiàn)，和對照組小鼠來相比較，哮喘組小鼠的肺組織(大多為免疫性炎性細(xì)胞和氣道的結(jié)構(gòu)細(xì)胞)，其肺內(nèi)NGF蛋白及NGF mRNA的表達(dá)水平較對照組小鼠有顯著增加，其NGF蛋白及NGF mRNA的表達(dá)水平增高的主要原因可能是由支氣管肺組織炎癥細(xì)胞合成增加而引起的。同時，靶向干預(yù)性吸入抗NGF抗體，抗體均勻分布在受損的氣管黏膜的表面，可以達(dá)到抑制NGF的生物活性和NGF mRNA的生物活性作用，從而達(dá)到促進(jìn)受損黏膜修復(fù)的目的，進(jìn)而能有效地抑制TGF-β1在肺內(nèi)的分泌及合成。因此，就哮喘的神經(jīng)源性氣道炎癥發(fā)病機(jī)制本研究推測其可能是由惡性循環(huán)鏈所推動進(jìn)行的：可能是由于支氣管哮喘小鼠的氣道上皮細(xì)胞和肺組織內(nèi)的炎癥因子(如嗜酸性粒細(xì)胞和肥大細(xì)胞等)其自身合成的NGF成分明顯升高，同時剛剛合成的NGF的又過來刺激炎性因子生長TGF-β1等明顯增多，TGF-β1將又作用于氣道的效應(yīng)細(xì)胞(如氣道平滑肌細(xì)胞、上皮細(xì)胞等)，導(dǎo)致激發(fā)哮喘的神經(jīng)源性氣道炎癥。與此相反的是由于氣道神經(jīng)源性炎癥反應(yīng)加重又明顯調(diào)高肺內(nèi)NGF的表達(dá)水平，正是因為這些循環(huán)的反應(yīng)導(dǎo)致哮喘惡性循環(huán)。本文通過靶向吸入抗NGF干預(yù)進(jìn)而作用氣道內(nèi)上皮細(xì)胞等效應(yīng)器官抑制NGF的相應(yīng)生物活性，又進(jìn)而抑制肺內(nèi)TGF-β1的合成和分泌，因此可以減少支氣管哮喘的氣道高反應(yīng)性和氣道炎癥反應(yīng)等。最近的一項研究中，Schuliga等〔16〕報道哮喘急性加重期的肺內(nèi)TGF-β1蛋白含量明顯高于臨床緩解期和正常組，與此同時，嚴(yán)重哮喘和哮喘持續(xù)狀態(tài)下的肺內(nèi)血清TGF-β1的濃度則更高，與之相反的是，如果哮喘患者的病情如相對越輕，則其發(fā)作的持續(xù)時間則相對越短，其TGF-β1濃度則相對越低。國外學(xué)者在研究中發(fā)現(xiàn)，NGF在哮喘這類慢性過敏性呼吸道疾病的高水平，NGF既可以增加氣道過敏性炎癥，同時又觸發(fā)氣道高反應(yīng)性，而且在肺部病理組織中有膠原蛋白顯著高表達(dá)的特點〔17〕。同時也通過TGF-β1/smad的獨立信號通路進(jìn)行信號通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)，哮喘小鼠的肺組織內(nèi)的NGF水平明顯增高，且在過敏性哮喘小鼠的肺組織內(nèi)NGF水平明顯比非過敏性哮喘小鼠高。對哮喘模型鼠進(jìn)行抗NGF干預(yù)，結(jié)論提示其不僅可能顯著減輕氣道高反應(yīng)性，以上文獻(xiàn)調(diào)研結(jié)果都與本研究結(jié)果一致。為何會出現(xiàn)上述結(jié)果，本研究推測靶向吸入抗NGF的主要優(yōu)勢在于，在支氣管哮喘的氣道炎癥發(fā)生發(fā)展過程中，暴露于受損氣道內(nèi)皮層的神經(jīng)末梢的相對生長能被靶向吸入抗NGF而直接抑制，靶向吸入抗NGF主要抑制了氣道表面及肺內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)的生成，眾所周知，神經(jīng)遞質(zhì)多由肺內(nèi)的神經(jīng)元經(jīng)受刺激而誘發(fā)的神經(jīng)反射而釋放。因而靶向吸入抗NGF可以減少神經(jīng)反射受刺激而誘發(fā)感覺神經(jīng)元生成各種的具有生物活性的神經(jīng)遞質(zhì)，進(jìn)而減輕了外源性刺激哮喘小鼠的氣道及其周圍的靶細(xì)胞(比如氣道炎性細(xì)胞和氣道結(jié)構(gòu)細(xì)胞)的作用效果，達(dá)到減輕氣道炎性介質(zhì)的生成和氣道高反應(yīng)性的形成，減緩氣道重塑的發(fā)展。NGF作為TGF-β1的上游炎癥因子，可以調(diào)控TGF-β1的產(chǎn)生和釋放。TGF-β1刺激氣道平滑肌細(xì)胞分化為更多的肥厚和收縮性功能的表型〔18〕。TGF-β1信號受到激活以后可以導(dǎo)致氣道成纖維細(xì)胞增多及平滑肌細(xì)胞的增生。

在哮喘的神經(jīng)免疫性炎癥發(fā)病機(jī)制的NGF發(fā)揮的作用可能如下：在支氣管哮喘的氣道炎癥的發(fā)生過程中，氣道旁及肺內(nèi)的靶細(xì)胞常因氣道炎癥而促進(jìn)了NGF的顯著增強(qiáng)。①NGF可以刺激機(jī)體的免疫細(xì)胞，體內(nèi)免疫功能進(jìn)而出現(xiàn)紊亂。②通過突觸運輸NGF到達(dá)背根神經(jīng)節(jié)細(xì)胞而聚集儲存。神經(jīng)肽類物質(zhì)SP/CG明顯增多，是由于神經(jīng)節(jié)細(xì)胞被刺激而產(chǎn)生的。同時通過氣道的平滑肌細(xì)胞及上皮細(xì)胞等效應(yīng)細(xì)胞進(jìn)而激發(fā)哮喘的神經(jīng)源性炎癥反應(yīng)的發(fā)生，反之，氣道炎癥能通過釋放更多的NGF，故又形成了惡性循環(huán)。綜合上述的文獻(xiàn)及實驗結(jié)果分析，本研究提出NGF可能通過調(diào)控哮喘氣道炎癥細(xì)胞的分泌和合成，進(jìn)而促進(jìn)了TGF-β1的分泌和生成，并參與調(diào)控哮喘的神經(jīng)源性氣道炎癥機(jī)制的發(fā)生和發(fā)展。在本研究中靶向吸入抗NGF的干預(yù)作用下可以下調(diào)了TGF-β1 mRNA表達(dá)和TGF-β1蛋白表達(dá)水平，從而降低哮喘其氣道炎癥；進(jìn)而參與支氣管哮喘的整個病理和生理過程中，總之，本研究提示靶向吸入抗NGF抗體能抑制哮喘的哮喘氣道炎癥過程，故有利于哮喘氣道炎癥的控制和治療，為哮喘防治提供了新的思路。