陶正貴，杜靜虎，田葵，王東華，龔偉，陳滿宇*

1湖北文理學(xué)院附屬醫(yī)院/襄陽(yáng)市中心醫(yī)院普外科，湖北襄陽(yáng) 441000；2湖北文理學(xué)院附屬醫(yī)院/襄陽(yáng)市中心醫(yī)院腫瘤科，湖北襄陽(yáng) 441000

胃癌是一種起源于胃黏膜上皮的常見(jiàn)惡性腫瘤，是全球第二大致死性腫瘤，其發(fā)病率呈逐漸增高趨勢(shì)，僅我國(guó)每年就有超過(guò)60萬(wàn)新發(fā)病例[1]。盡管外科手術(shù)、放射療法和化學(xué)療法等胃癌治療方法有所進(jìn)步，但由于多數(shù)患者確診時(shí)已處于中晚期，導(dǎo)致其預(yù)后較差，目前的遠(yuǎn)期生存率仍低于30%[2]。因此，探索胃癌診斷的新的標(biāo)志物及治療靶標(biāo)非常重要[3]。軸突導(dǎo)向蛋白4D (semaphorin 4D，Sema4D)又稱CD100，是Semaphorin家族成員之一，屬于免疫系統(tǒng)的一種跨膜型的同源二聚體糖蛋白[4]。Sema4D在多種腫瘤的增殖、血管生成及轉(zhuǎn)移等過(guò)程中發(fā)揮重要作用，其表達(dá)與腫瘤的進(jìn)展呈正相關(guān)[5-6]。已有研究發(fā)現(xiàn)，Sema4D在胃癌中呈高表達(dá)，可通過(guò)促進(jìn)腫瘤血管新生而加速胃癌細(xì)胞的浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移[7-8]，可作為判定胃癌患者預(yù)后的參考。但Sema4D在胃癌中的具體作用機(jī)制尚不明確。本研究探討了沉默Sema4D對(duì)胃癌細(xì)胞SGC-7901生長(zhǎng)、自噬及上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響，以期為胃癌的防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器 RPMI 1640培養(yǎng)基(61870-127)、胎牛血清(26400-036)、青鏈霉素(15140-122)、胰蛋白酶(25200-056)購(gòu)自美國(guó)Gibco公司(Grand Island，NY)；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(P0012S)、LipoRNAiTM轉(zhuǎn)染試劑(C0535)、Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(C1062S)、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG (A0208)購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)研究所；兔抗Ki-67 (ab15580)、增殖細(xì)胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA) (ab18197)、Bax (ab53154)、Bcl-2 (ab196495)、caspase-3 (ab13847)、cleaved caspase-3 (ab2302)、Beclin1 (ab62557)、p62 (ab56416)、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ (ab128025)、E-cadherin (ab15148)、N-cadherin (ab18203)、波形蛋白(ab137321)、GAPDH (ab9485)單克隆抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam公司(Cambridge，MA)。Nano-Drop分光光度計(jì)購(gòu)自賽默飛世爾科技公司；FACSCalibur流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)BD公司；FluorChem HD2凝膠成像系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)ProteinSimple公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 人胃腺癌細(xì)胞SGC-7901來(lái)源于美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(Manassas，Virginia，USA)。將SGC-7901細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清和1%青鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基中，置于37 ℃、含5% CO2的培養(yǎng)箱，每24 h更換新鮮培養(yǎng)基，1:2傳代。

1.3 細(xì)胞處理及分組 為了防止脫靶效應(yīng)，共設(shè)計(jì)3對(duì)shRNA序列及1對(duì)shRNA-NC序列干擾Sema4D的表達(dá)。通過(guò)RT-PCR檢測(cè)選擇效果最好的Sema4D-shRNA進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，構(gòu)建shRNA Sema4D載體，采用LipoRNAiTM轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染SGC-7901細(xì)胞，將細(xì)胞隨機(jī)分為對(duì)照組、shRNA-NC組、Sema4D-shRNA1組、Sema4DshRNA2組與Sema4D-shRNA3組。對(duì)照組不做處理，shRNA-NC組轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照shRNA-NC載體，Sema4D-shRNA組轉(zhuǎn)染shRNA Sema4D載體。引物序列如表1所示。

1.4 RT-PCR檢測(cè)Sema4D mRNA表達(dá)水平 采用Trizol法提取SGC-7901細(xì)胞總RNA，用Nanodrop分光光度計(jì)測(cè)定吸光度(A260/A280)，計(jì)算RNA濃度。按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行cDNA合成和PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件為94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，擴(kuò)增35個(gè)循環(huán)，72 ℃延長(zhǎng)10 min，存儲(chǔ)在4 ℃條件下。反應(yīng)產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳分離，用2-ΔΔCt法計(jì)算各目的基因的相對(duì)表達(dá)量。

表1 RT-PCR引物序列Tab.1 Primer sequences of RT-PCR

1.5 克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖情況 在培養(yǎng)皿中培養(yǎng)各組細(xì)胞至融合度為30%，繼續(xù)培養(yǎng)4 d，吹散為單個(gè)細(xì)胞，用6孔板培養(yǎng)，每孔約500個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)14 d，棄去培養(yǎng)基，用乙醇固定30 min，0.5%結(jié)晶紫染色，去離子水漂洗晾干，拍照后用Image-Pro Plus計(jì)算每孔中細(xì)胞克隆形成的數(shù)目。

1.6 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率 收集各組細(xì)胞，懸浮于10 ml離心管中，調(diào)整細(xì)胞密度為3×106/ml，1000 r/min離心5 min，棄去培養(yǎng)液，用孵育緩沖液洗滌1次，1000 r/min離心5 min，用100 μl標(biāo)記溶液重懸細(xì)胞，室溫下避光孵育15 min，1000 r/min離心5 min，沉淀細(xì)胞用孵育緩沖液洗滌1次，加入SA-FLOUS溶液4 ℃下孵育20 min，按照Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行流式細(xì)胞儀上機(jī)分析。

1.7 上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化形態(tài)學(xué)觀察 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，于倒置顯微鏡下觀察上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化形態(tài)的改變。

1.8 Western blotting檢測(cè)蛋白表達(dá)水平 將各組待測(cè)細(xì)胞用PBS清洗3次，加入含蛋白酶抑制劑的細(xì)胞裂解液提取總蛋白，依據(jù)BCA試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟測(cè)定蛋白質(zhì)含量。提取等量的蛋白質(zhì)樣品(20 mg)，100 ℃變性5 min，然后進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳分離并轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5% BSA室溫封閉1～2 h，加入一抗(1:1000) 4 ℃孵育過(guò)夜；次日，PBS洗滌后加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗(1:3000)，室溫孵育1 h，PBS洗滌。加入發(fā)光液，采用凝膠成像儀曝光拍照，用ImageJ軟件統(tǒng)計(jì)灰度值并計(jì)算Ki-67、PCNA、Bax、Bcl-2、caspase、cleaved caspase-3、Beclin1、p62、LC3Ⅰ、LC3Ⅱ、E-cadherin、N-cadherin、波形蛋白相對(duì)表達(dá)量，以GAPDH作為內(nèi)參。每個(gè)實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。所得數(shù)據(jù)以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD法。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組Sema4D mRNA表達(dá)水平比較 RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，Sema4D-shRNA1組、Sema4D-shRNA2組和Sema4D-shRNA3組Sema4D mRNA相對(duì)表達(dá)水平(分別為0.41±0.04、0.50±0.04、0.16±0.04)均明顯降低(P<0.05)，且Sema4D-shRNA3組明顯低于Sema4D-shRNA1組和Sema4D-shRNA2組(P<0.05，圖1)。選擇shRNA3 Sema4D進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

圖1 各組胃癌細(xì)胞Sema4D mRNA表達(dá)水平比較Fig.1 Comparison of expression levels of Sema4D mRNA in each group of gastric cancer cells

2.2 shRNA Sema4D對(duì)SGC-7901細(xì)胞增殖的影響 克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，Sema4DshRNA3組克隆形成率明顯降低[(58.35±7.01) % vs. (11.43±6.55) %，P<0.05，圖2A、B]；Western blotting檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，Sema4Ds h R N A 3 組K i-6 7、P C N A 蛋白表達(dá)水平明顯降低(0.55±0.05 vs. 0.07±0.01；0.18±0.06 vs. 0.02±0.01，P<0.05，圖2C、D)。

2.3 shRNA Sema4D對(duì)SGC-7901細(xì)胞凋亡的影響 流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，Sema4DshRNA3組細(xì)胞凋亡率明顯升高[(3.1±1.0) % vs. (31.2±5.0) %，P<0.05，圖3A、B]。Western blotting檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，Sema4D-shRNA3組Bax/Bcl-2、cleaved caspase-3/caspase-3比值明顯升高(0.05±0.03 vs. 6.80±0.70；0.006±0.004 vs. 0.210±0.025，P<0.05，圖3C、D)。

2.4 shRNA Sema4D對(duì)SGC-7901細(xì)胞中Beclin1、LC3Ⅱ、LC3Ⅰ、p62蛋白表達(dá)的影響 Western blotting檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，Sema4DshRNA3組Beclin1蛋白的表達(dá)水平和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值明顯升高(0.05±0.03 vs. 0.26±0.05；0.05±0.04 vs. 1.65±0.16，P<0.05)，p62蛋白的表達(dá)水平明顯降低(0.94±0.07 vs. 0.18±0.06，P<0.05，圖4)。

圖2 shRNA Sema4D對(duì)胃癌細(xì)胞SGC-7901細(xì)胞增殖的影響Fig.2 Effect of shRNA Sema4D on proliferation of SGC-7901 cells

圖3 shRNA Sema4D對(duì)胃癌細(xì)胞SGC-7901細(xì)胞凋亡的影響Fig.3 Effect of shRNA Sema4D on apoptosis of SGC-7901 cells

2.5 shRNA Sema4D對(duì)SGC-7901細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化 熒光顯微鏡下觀察可見(jiàn)，對(duì)照組及shRNA-NC組細(xì)胞呈連接松散的類圓或紡錘體樣，細(xì)胞間黏附力降低，細(xì)胞由上皮向間質(zhì)轉(zhuǎn)化，發(fā)生了典型的上皮-間質(zhì)形態(tài)變化；Sema4D-shRNA3組細(xì)胞間排列聚集，細(xì)胞呈圓形、橢圓形(圖5)，表明shRNA Sema4D可抑制SGC-7901細(xì)胞的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化。

圖4 shRNA Sema4D對(duì)胃癌細(xì)胞SGC-7901 Beclin1、p62、LC3Ⅰ、LC3Ⅱ蛋白表達(dá)的影響Fig.4 Effect of shRNA Sema4D on the expression levels of Beclin1, p62, LC3Ⅰ and LC3Ⅱ protein in SGC-7901 cells

圖5 shRNA Sema4D對(duì)胃癌細(xì)胞SGC-7901上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響(×200)Fig.5 Effect of shRNA Sema4D on epithelial-mesenchymal transition of SGC-7901 cells

2.6 shRNA Sema4D對(duì)SGC-7901細(xì)胞E-cadherin、N-cadherin、波形蛋白表達(dá)的影響 Western blotting檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，Sema4D-shRNA3組E-cadherin蛋白的表達(dá)水平明顯升高(0.05±0.02 vs. 0.31±0.04，P<0.05)，N-cadherin、波形蛋白的表達(dá)水平明顯降低(0.49±0.04 vs. 0.05±0.03；0.36±0.05 vs. 0.04±0.01，P<0.05，圖6)。

圖6 shRNA Sema4D對(duì)胃癌細(xì)胞SGC-7901 E-cadherin、N-cadherin、波形蛋白表達(dá)的影響Fig.6 Effect of shRNA Sema4D on the expression levels of E-cadherin, N-cadherin and vimentin protein in SGC-7901 cells

3 討 論

胃癌是一種臨床常見(jiàn)的消化道腫瘤，其發(fā)病率和病死率居惡性腫瘤前列[9]。隨著基因治療技術(shù)的發(fā)展，分子靶向治療有望為胃癌的治療提供新的 方向。

胃癌細(xì)胞具有高度增殖能力，致使其早期可發(fā)生轉(zhuǎn)移，因此，抑制胃癌細(xì)胞的增殖對(duì)于控制胃癌的進(jìn)展具有重要意義[10]。Ki-67是一種與細(xì)胞增殖相關(guān)的核蛋白，是指導(dǎo)治療、判斷腫瘤預(yù)后的重要指標(biāo)。有研究發(fā)現(xiàn)，Ki-67在胃癌組織中呈高表達(dá)[11]， 而抑制Ki-67的表達(dá)可有效降低胃癌細(xì)胞的增殖潛能。PCNA是一種與細(xì)胞增殖狀態(tài)有關(guān)的核蛋白，在胃癌組織中的表達(dá)高于正常組織及癌前病變組織，且隨著臨床分期的增加和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，其表達(dá)水平逐漸增高，可反映腫瘤細(xì)胞的增殖活性和所處周期[12]。陳武桂等[13]發(fā)現(xiàn)，siRNA沉默Sema4D可抑制MDA-MB-231細(xì)胞的增殖和遷移。Tasaka等[14]發(fā)現(xiàn)，低氧誘導(dǎo)因子能夠促進(jìn)乳腺癌Sema4D的表達(dá)，并誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生遷移，導(dǎo)致乳腺癌細(xì)胞增殖。本研究發(fā)現(xiàn)，shRNA Sema4D可下調(diào)SGC-7901細(xì)胞Ki-67、PCNA蛋白的表達(dá)，提示shRNA Sema4D可抑制SGC-7901細(xì)胞的增殖。

細(xì)胞凋亡紊亂是腫瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵。Caspase蛋白的改變是細(xì)胞凋亡發(fā)生的重要標(biāo)志，而caspase-3以無(wú)活性的pro-caspase 3形式存在，在細(xì)胞接收到一系列的凋亡信號(hào)后，經(jīng)過(guò)剪切成為活化的執(zhí)行因子caspase-3，后者是細(xì)胞凋亡不可逆的標(biāo)志[15]。Bcl-2家族的抗凋亡蛋白Bcl-2和促凋亡蛋白Bax是細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，提高Bax/Bcl-2的比值可促進(jìn)細(xì)胞凋亡，而降低Bax/Bcl-2的比值則會(huì)抑制細(xì)胞凋亡[16]。相關(guān)研究表明，在胃癌中caspase-3表達(dá)下調(diào)，Bcl-2表達(dá)明顯高于癌旁組織，且與Bax的表達(dá)存在負(fù)相關(guān)關(guān)系[17]。Jiang等[18]發(fā)現(xiàn)，敲低Sema4D的表達(dá)能促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的增殖、侵襲及遷移，并誘導(dǎo)其凋亡。Wang等[19]發(fā)現(xiàn)，敲低Sema4D的表達(dá)可促進(jìn)食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞的凋亡。本研究發(fā)現(xiàn)，shRNA Sema4D可升高Bax/Bcl-2、cleaved caspase-3/caspase-3比值，提示shRNA Sema4D可促進(jìn)SGC-7901細(xì)胞凋亡。

自噬是維持細(xì)胞平衡的一種自我保護(hù)機(jī)制，但在某些應(yīng)激條件下，自噬則是腫瘤細(xì)胞逃避凋亡的重要機(jī)制[20]。Beclin1是酵母Atg6基因在人類基因中的同源體，可激活自噬過(guò)程，是維持細(xì)胞自噬活性的關(guān)鍵。Beclin1在胃癌組織中的表達(dá)陽(yáng)性率較低，而上調(diào)Beclin1的表達(dá)可誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞自噬的發(fā)生[21]。自噬標(biāo)記蛋白p62是多泛素化結(jié)合蛋白，自噬發(fā)生缺陷可上調(diào)p62的表達(dá)，p62在胃癌中表達(dá)率較高且聚集[22]。LC3蛋白是一種自噬標(biāo)志物，檢測(cè)LC3Ⅱ與LC3Ⅰ的比值可在一定程度上反映自噬體的數(shù)量[23]。本研究發(fā)現(xiàn)，shRNA Sema4D可升高SGC-7901細(xì)胞Beclin1蛋白的表達(dá)水平及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值，降低p62蛋白的表達(dá)水平，提示shRNA Sema4D可抑制SGC-7901細(xì)胞的自噬。

上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化是正常上皮細(xì)胞失去上皮特性轉(zhuǎn)變?yōu)殚g質(zhì)樣腫瘤細(xì)胞的重要過(guò)程[24]。多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的異常活化與胃癌的發(fā)生、侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[25-26]。上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的主要特征為E-cadherin表達(dá)減少、N-cadherin表達(dá)增加、細(xì)胞角蛋白細(xì)胞骨架轉(zhuǎn)化為以波形蛋白為主的細(xì)胞骨架及形態(tài)上具有間充質(zhì)細(xì)胞[27]。本研究發(fā)現(xiàn)，shRNA Sema4D可升高SGC-7901細(xì)胞E-cadherin蛋白的表達(dá)水平，降低N-cadherin、波形蛋白的表達(dá)水平，提示shRNA Sema4D可抑制SGC-7901細(xì)胞的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化。

綜上所述，沉默Sema4D可抑制SGC-7901細(xì)胞的生長(zhǎng)、自噬、上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化，促進(jìn)其凋亡。本研究的不足之處在于未能在體內(nèi)試驗(yàn)驗(yàn)證沉默Sema4D對(duì)胃癌細(xì)胞自噬、上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化和凋亡的影響。