楊 露，譚會澤，劉松柏，陳 丹，余軍軍

(溫氏食品集團股份有限公司//農(nóng)業(yè)部動物營養(yǎng)與飼料學重點實驗室，廣東 云浮 527400)

球蟲病是由寄生于宿主腸道或膽管上皮細胞內的艾美耳科原蟲引起的家禽常見且危害嚴重的寄生蟲病。球蟲病造成的經(jīng)濟損失是巨大的，目前國內外對雞球蟲病的防治主要是依靠聚醚類抗球蟲藥物，如甲基鹽霉素(NAR)、鹽霉素(SAL)、莫能菌素(MON)、拉沙洛西鈉(LAS)、馬杜霉素(MAD)等。這些聚醚類藥物是20世紀70年代出現(xiàn)的一類離子載體抗生素，它們在化學結構和性質上非常相似，大多都含有一個一元有機酸和許多醚基，因而可形成多種金屬鹽。聚醚類抗球蟲藥經(jīng)常以鈉鹽、鉀鹽或銨鹽的形式存在，微溶或不溶于水，易溶于低級醇、丙酮、氯仿、苯、乙醚、石油醚、乙酸乙酯、四氯化碳及正己烷等，且在中性或堿性環(huán)境中穩(wěn)定。它們能與球蟲細胞中的陽離子緊密結合，改變細胞膜上脂質屏障的滲透性，使細胞內外離子濃度發(fā)生變化，導致大量水分進入球蟲細胞，最終使球蟲腫脹死亡[1]。

目前，國內外關于莫能菌素、鹽霉素、甲基鹽霉素、拉沙洛西鈉和馬杜霉素的檢測方法，主要為微生物法、免疫學分析法、光譜法、色譜法、色譜質譜聯(lián)用分析法等[2]。本研究是利用液相色譜-串聯(lián)質譜法摸索測定飼料中5種聚醚類抗球蟲藥的檢測方法，優(yōu)化目前已有的液相色譜條件和化合物質譜條件，使其靈敏度更高、重現(xiàn)性更好，結果更加準確，能更好的滿足禽用飼料中聚醚類抗球蟲藥物的檢測。

1 方法原理

試料中的聚醚類抗球蟲藥物經(jīng)乙腈提取，然后硅膠固相萃取柱凈化后，備用液用液相色譜-串聯(lián)質譜儀測定，外標法定量。

2 材料與方法

2.1 試劑

甲醇、乙腈、甲酸試劑，色譜純；正己烷-乙醚(50+50)；二氯甲烷-甲醇(90+10)；聚醚類抗球蟲藥標準溶液等。

2.2 儀器

液相色譜-串聯(lián)質譜儀(配有電噴霧電離源ESI)，渦動儀；離心機，分析天平，硅膠固相萃取柱(500 mg/(6 ml))，水浴氮吹儀，0.22 μm有機濾膜。

2.3 儀器條件

2.3.1液相色譜條件

液相色譜條件見表1。

表1 液相色譜條件

色譜柱：BEH C18柱，100 mm×2.1 μm(i.d.)，粒徑1.7 μm。柱溫：50℃。

流動相：甲醇(含0.1%甲酸)-0.1%甲酸(97+3)。流速：0.3 ml/min。進樣體積：10 μl。

2.3.2質譜條件

質譜條件見表2。

表2 聚醚類藥物測定的質譜條件

掃描方式：正離子掃描。

檢測方式：多反應檢測(MRM)。

電噴霧毛細管電壓：2.8 kV。

取樣錐孔電壓：1.0 V。

透鏡電壓：0.5 V。

離子源溫度：80℃。

去溶劑溫度：300℃。

倍增器電壓：650 V。

二級碰撞氣：氬氣。

2.4 標準曲線制作

2.4.1標準品來源

鹽霉素、拉沙洛西鈉、莫能菌素、甲基鹽霉素和馬杜霉素(純度均≥95%)由國家標準物質中心提供。

2.4.2不同濃度混合標準液

單個聚醚類標準液(1 000 μg/ml)：分別準確稱取鹽霉素、拉沙洛西鈉、莫能菌素、甲基鹽霉素和馬杜霉素標準品10 mg，用甲醇分別溶解并定容10 ml容量瓶中，制成1 000 μg/ml的單個聚醚類抗球蟲藥標準液。-20℃保存，有效期為12個月。

5種聚醚類混合標準液(100 μg/ml)：分別準確量取適量5種1 000 μg/ml單個聚醚類標準溶液于同一容量瓶中，用甲醇稀釋成100 μg/ml的混合標準液。-20℃保存，有效期6個月。

5種聚醚類混合標準液(10 μg/ml)：準確量取適量100 μg/ml聚醚類混合標準溶液于容量瓶中，用甲醇稀釋成10 μg/ml的混合標準液。-20℃保存，有效期6個月。

5種聚醚類藥物混合標準工作液：量取適量10 μg/ml聚醚類藥物混合標準液，用甲醇(含0.1%甲酸)依次稀釋成濃度為1、2、10、20、100、200 ng/ml的標準工作液，現(xiàn)配現(xiàn)用。

2.5 樣品前處理

2.5.1提取

稱取試樣2 g(精確到0.01 g)于50 ml離心管中，加20 ml乙腈，振蕩提取30 min，2 000 r/min 4℃條件下離心5 min，取上清液至離心管。殘渣用20 ml乙腈重復提取一次，合并2次上清液。將提取液于雞心瓶，40℃旋蒸至干，用3 ml正己烷溶解殘渣，轉移至10 ml離心管。再用2 ml正己烷洗滌雞心瓶，合并2次溶解液，3 500 r/min離心5 min，上清液備用。

2.5.2凈化

取硅膠固相萃取柱，加5 ml正己烷預洗，將上述得到的上清液過萃取柱，加乙醚-正己烷(50/50)8 ml洗滌，抽干，加二氯甲烷-甲醇(90/10)6 ml洗脫，收集洗脫液，40℃下氮氣吹干，甲醇(含0.1%甲酸)1.0 ml溶解殘渣，過0.22 μm濾膜后上液相色譜-串聯(lián)質譜儀分析[3]。

2.5.3基質標準曲線的制備

精密量取標準工作液，用甲醇(含0.1%甲酸)溶液稀釋成1.0、2.0、10.0、20.0、100、200 ng/ml的工作溶液。將5個飼料空白樣品按樣品提取凈化步驟處理，氮氣吹干后，用上述標準工作液溶解后上機測定，將各抗球蟲藥物定量離子峰面積與其響應濃度進行線性回歸，得到基質標準的工作曲線以及各組織中的線性回歸方程和相關系數(shù)，詳情見表3。

2.5.4回收率

在禽用配合飼料空白樣品中分別添加25、125 ng/ml兩種不同濃度的聚醚類抗球蟲藥進行回收率試驗，每個濃度5個平行，連續(xù)做3 d，分別求得回收率、日內變異系數(shù)和日間變異系數(shù)，結果見表4。

3 結果與分析

3.1 基質匹配加標校準曲線

從檢測結果看，5種聚醚類抗球蟲藥的線性條件都較好，相關系數(shù)均大于0.995。這證明5種聚醚類抗球蟲藥物在濃度1～200 ng/ml的范圍內呈線性相關關系。

3.2 添加回收率測定

在禽用配合飼料空白樣品中分別添加25、125 ng/ml兩種不同濃度的聚醚類抗球蟲藥進行回收率試驗，結果如表4所示。

表4 5種聚醚類藥物的添加回收率試驗結果

從檢測結果看，5種聚醚類抗球蟲藥檢測的日內變異系數(shù)均小于10%，日間變異系數(shù)也均小于10%。對于藥物測定的方法回收率偏差范圍，據(jù)GB/T 27404—2008的附錄F.1中要求，新建立的方法回收率在要求范圍內。而且按照農(nóng)業(yè)部1862號公告:4—2012《飼料中5種聚醚類藥物的測定液相色譜-串聯(lián)質譜法》中要求：在重復條件下完成的2個平行測定結果的相對偏差不大于15%，檢測結果表明該方法滿足條件。

4 結論

利用液相色譜-串聯(lián)質譜法檢測快速、定性定量準確、回收率較高，解決了長期以來禽用飼料中聚醚類藥物殘留檢測中常常遇到的雜質干擾和基質效應等問題，完全滿足對建立禽用飼料中5種聚醚類藥物殘留檢測方法的要求。