白新偉*， 陳定梅， 鄧紅江

(六盤水師范學(xué)院化學(xué)與材料工程學(xué)院，貴州六盤水 553004)

植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑[1-5]與以殺滅作物蟲害為目的的農(nóng)藥不同，如在豆芽[6]發(fā)制過(guò)程中使用的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑屬于生長(zhǎng)促進(jìn)劑，主要作用是使豆芽莖部生長(zhǎng)迅速，而使芽和根部的生長(zhǎng)受到抑制而減緩生長(zhǎng)，從而增加豆芽外觀鮮嫩度。雖然植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑一般為低毒或微毒，但被人體過(guò)量吸收、累積后會(huì)對(duì)人體健康造成威脅。目前檢測(cè)植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑殘留的方法主要包括液相色譜法[7]和液相色譜-質(zhì)譜法[8]，尚未見(jiàn)毛細(xì)管電泳法檢測(cè)植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的相關(guān)報(bào)道。

毛細(xì)管電泳[9,10]在農(nóng)藥檢測(cè)領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用前景。本實(shí)驗(yàn)使用3-氨基苯磺酸作為衍生化試劑，獲得的衍生物性質(zhì)穩(wěn)定，分離度效果好，檢測(cè)靈敏度高。植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑標(biāo)準(zhǔn)品定性定量檢測(cè)，以及豆芽實(shí)際樣品的測(cè)定實(shí)驗(yàn)使毛細(xì)管電泳技術(shù)高效、快速等優(yōu)勢(shì)都得以充分的體現(xiàn)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

HP-3D毛細(xì)管電泳儀(美國(guó)，Agilent公司)。毛細(xì)管總長(zhǎng)度58.5 cm，有效柱長(zhǎng)為50 cm，內(nèi)徑為50 μm。

標(biāo)準(zhǔn)品:4-氯苯氧乙酸(4-CPA)，2-萘乙酸(2-NNA)，吲哚乙酸(IAA)，吲哚丁酸(IBA)，4-氟苯氧乙酸(4-FPA)，2,3,5-三碘苯甲酸(TIBA)，4-溴苯氧乙酸(4-BPA)，2，4-二氯苯氧乙酸(2,4DA)，2，4，5-三氯苯氧乙酸(2,4,5-T)，2，6-二甲基苯氧乙酸(2,6-DA)(昆明聚星達(dá)化學(xué)試劑有限公司公司);衍生試劑：3-氨基苯磺酸(河北建新化工股份有限公司)；乙腈(色譜純，山東旭晨化工科技有限公司)。其余所用試劑均為分析純，水為超純水。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制植物生長(zhǎng)劑標(biāo)準(zhǔn)品溶液：準(zhǔn)確稱取各標(biāo)準(zhǔn)品，用乙腈配成2.0×10-4mol/L。3-氨基苯磺酸衍生試劑溶液(2.0×10-4mol/L)：準(zhǔn)確稱取0.50 mg 3-氨基苯磺酸，溶于2 mL pH=3的0.1 mol/L磷酸鹽緩沖溶液。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)品的衍生化依次向安瓿瓶中加入20 μL混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，80 μL 3-氨基苯磺酸衍生試劑溶液，160 μL EDC溶液，80 ℃水浴中反應(yīng)30 min進(jìn)行衍生化。

1.2.3 實(shí)際樣品預(yù)處理豆芽預(yù)處理參照文獻(xiàn)方法[11]：將豆芽切碎，充分混合均勻。準(zhǔn)確稱20.0 g樣品于離心管中，加入25.0 mL的磷酸鹽緩沖溶液，超聲提取5 min后，加入1 mL 100 g/L ZnSO4溶液沉淀蛋白，過(guò)濾收集濾液。濾液以1 mL/min的流速通過(guò)WAX固相萃取小柱。上樣后，用10 mL 5.0 mmol/L H2SO4平衡，2 mL乙腈淋洗，2 mL含5%氨水的甲醇洗脫。洗脫液按“1.2.2”衍生。

1.2.4 毛細(xì)管電泳條件背景電解質(zhì)為20 mmol/L Tris-H3PO4緩沖溶液(pH為9.2)。采用壓力進(jìn)樣的方式:50 mbar×8 s。分離電壓12 kV，柱溫25 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)為220 nm。每次進(jìn)樣前依次用0.1 mol/L NaOH溶液、超純水和背景電解質(zhì)溶液各沖洗毛細(xì)管2 min。

2 結(jié)果與討論

2.1 分離條件的優(yōu)化

2.1.1 緩沖溶液的選擇毛細(xì)管電泳中常用的緩沖溶液有磷酸鹽、硼砂或硼酸、乙酸鹽等[12]。本研究分別考察了Tris-磷酸鹽緩沖體系和硼酸鹽緩沖體系，發(fā)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)品衍生物在Tris-H3PO4緩沖體系中分離效果最好。固定其他實(shí)驗(yàn)條件，考察緩沖溶液濃度在10～30 mmol/L時(shí)的分離效果，發(fā)現(xiàn)Tris-H3PO4濃度為20 mmol/L時(shí)，其理論塔板數(shù)(N)和分離度(RS)最佳，分離效率較高，如圖1所示。

2.1.2 緩沖溶液pH的選擇在電泳過(guò)程中，pH值不僅會(huì)影響溶質(zhì)分子的有效電荷數(shù)[13]，且對(duì)待測(cè)物在毛細(xì)管中的遷移速度也有影響[14]。調(diào)節(jié)Tris-H3PO4溶液其pH值為9.0～9.4，考察pH值對(duì)四種代表性標(biāo)準(zhǔn)品衍生物的理論塔板數(shù)及分離度的影響。在pH為9.2時(shí)，幾種物質(zhì)的分離度與理論塔板數(shù)達(dá)到最佳，如圖2所示。

圖2 緩沖溶液pH對(duì)分離效果的影響Fig.2 The effect of buffer solution pH on separation efficiency 1.2-NNA;2.4-FPA;3.4-CPA;4.CBA;5.2,4D.

2.2 線性范圍、檢出限和重現(xiàn)性

配制系列濃度的10種標(biāo)準(zhǔn)品溶液并進(jìn)行衍生化后，由高濃度到低濃度依次進(jìn)樣分析，依據(jù)峰面積對(duì)其濃度的變化進(jìn)行線性回歸，得到線性回歸方程及相關(guān)系數(shù)，10種標(biāo)準(zhǔn)品的線性方程及遷移時(shí)間及峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)列于表1。

表1 10種標(biāo)準(zhǔn)品線性方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍及遷移時(shí)間、峰面積相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差

2.3 實(shí)際樣品分析

取經(jīng)“1.2.1”預(yù)處理的豆芽樣品四份，兩份按“1.2.1”方法衍生化，直接進(jìn)行定性定量分析，典型電泳譜圖見(jiàn)圖3(a)和3(b)。另外兩份用標(biāo)準(zhǔn)加入法加標(biāo)進(jìn)行回收率實(shí)驗(yàn)?？疾旆椒ň芏?，各組分含量見(jiàn)表2。

圖3 實(shí)際樣品的電泳譜圖Fig.3 Electropherograms of sample solutions1.2-NNA;2.4-FPA;3.4-CPA;4.4-BPA;5.2,4D;6.2,4T;7.TIBA;8.IAA 9.IBA;10.2,6-DA.

表2 豆芽中植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑含量及回收率

3 結(jié)論

實(shí)驗(yàn)利用3-氨基苯磺酸對(duì)10種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑進(jìn)行衍生化，在16 min內(nèi)實(shí)現(xiàn)了分析物的高效基線分離。建立的方法操作簡(jiǎn)便、線性范圍寬、重現(xiàn)性好，能同時(shí)檢測(cè)豆芽中10種可能存在的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑殘留，同時(shí)有望將該方法用于其他蔬菜、水果中植物生長(zhǎng)調(diào)劑殘留的測(cè)定。