朱梅青， 崔 蓉*

(北京大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，北京 100191)

2-(2′-羥基-3′,5′-二叔丁基苯基)-5-氯苯并三唑(2,4-Di-tert-butyl-6-(5-chloro-2H-benzotriazole-2-yl)phenol，UV-327)、2-(2′-羥基-3′,5′-二叔戊基苯基)-苯并三唑(2-(2H-benzotriazol-2-yl)-4,6-di-tert-pentylphenol，UV-328)均為苯并三唑類紫外線吸收劑，它們能強烈吸收270～380 nm和290～400 nm的紫外光[1]。因化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，揮發(fā)性小，與聚烯烴相容性好而廣泛應(yīng)用于油漆涂料、合成纖維、毛紡織品、感光材料、食品包裝材料和化妝品中。UV-327和UV-328在環(huán)境中不易降解、高度親脂，易在體內(nèi)蓄積，且具有潛在毒性，已成為備受關(guān)注的一類新型環(huán)境內(nèi)分泌干擾物[2]。暴露于特定的職業(yè)環(huán)境、水環(huán)境污染以及食品包裝材料的遷移等都有可能使人體接觸到此類物質(zhì)。研究表明，淺水魚類(鯔魚、鱸魚)肝臟中UV-327的濃度比其他部位高3～4倍，與烏魚肝臟中UV-328的濃度分布一致，表明該類化合物可能優(yōu)先積累在某些魚種的肝臟，且降解較少[3]。多項大鼠實驗結(jié)果表明，UV-327和UV-328對肝臟有明顯的毒性作用。每日用摻入UV-328(>200 μg/g)的飼料喂養(yǎng)大鼠90 d，可觀察到大鼠的血液、肝臟和腎臟均產(chǎn)生不良影響[4]。以UV-327(22～800 mg/kg/d)喂養(yǎng)大鼠90 d[5]，大鼠肝臟重量呈劑量依賴性增加，出現(xiàn)肝臟毒性癥狀，且雄性大鼠在25 mg/kg UV-327重復(fù)劑量暴露下，其血清中堿性磷酸酶、白蛋白和白/球蛋白比值、絕對肝臟重量和相對肝臟重量均升高[6]。由此可見，肝臟是UV-327和UV-328毒性效應(yīng)的重要靶器官。

目前，有關(guān)UV-327和UV-328測定方法的研究仍多集中于非生物樣品的檢測，如污水[7]、污泥[8]和塑料食品包裝材料[9]等，而生物樣品中檢測方法的報道較少，且目前尚未見小鼠組織中UV-327和UV-328測定方法的研究報道。本研究建立了小鼠肝臟中UV-327與UV-328的測定方法，可為后續(xù)進(jìn)一步研究其在動物體內(nèi)的代謝過程、組織中的分布特征以及動態(tài)變化規(guī)律等提供檢測方法。

1 實驗部分

1.1 儀器和試劑

Waters高效液相色譜儀(美國，Waters科技有限公司)，包括Waters 1525 Binary HPLC Pump，Waters 717 plus Autosampler，Waters 2487 Dual λ Absorbance Detector；MX-S旋渦混合儀(美國，Scilogex公司)；TGL-16G離心機(上海安亭科學(xué)儀器廠)；D -130手持式超細(xì)勻漿器(德國，Wiggens公司)。

UV-320(2-(2′-羥基-3′,5′-二叔丁基苯基)-苯并三唑，內(nèi)標(biāo))，純度98%(上海畢得醫(yī)藥科技有限公司)；UV-327、UV-328，純度98%(薩恩化學(xué)技術(shù)(上海)有限公司)；甲醇(純度≥99.9%)；丙酮；正己烷；生理鹽水。

1.2 實驗方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制分別稱取10 mg UV-320、UV-327及UV-328，于100 mL容量瓶中用甲醇定容，配制成質(zhì)量濃度均為100 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液。取一定體積UV-320標(biāo)準(zhǔn)儲備液，用甲醇逐級稀釋配制質(zhì)量濃度為0.40 μg/mL的UV-320標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液。取一定體積UV-327及UV-328標(biāo)準(zhǔn)儲備液，用甲醇逐級稀釋，配制質(zhì)量濃度分別為0.10、0.20、0.40、1.00、2.00、4.00、10.0、20.0、40.0 μg/mL的UV-327和UV-328混合標(biāo)準(zhǔn)系列溶液。

1.2.2 樣品采集與預(yù)處理小鼠脫臼處死，在冰面上迅速取出肝臟，用生理鹽水洗凈表面的血液，濾紙吸干后稱重。按照0.50 g/mL(小鼠肝臟重量/生理鹽水體積)加入生理鹽水，渦旋混勻。取100 μL小鼠肝臟勻漿，加入1.0 mL正己烷-丙酮溶液(體積比1∶1)，渦旋混勻3 min，13 560×g離心5 min。將上清液轉(zhuǎn)入干凈管中，50 ℃氮氣吹干，殘渣用200 μL甲醇溶解，渦旋混勻3 min，13 560×g離心5 min，上清液經(jīng)0.45 μm尼龍過濾器過濾，高效液相色譜-紫外檢測器測定。

1.2.3 色譜條件色譜柱：Waters SymmetryC18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；保護(hù)柱：Waters SymmetryC18柱(20 mm×3.9 mm，5 μm)；流動相：甲醇；流速：1.0 mL/min；紫外檢測波長：340 nm；柱溫：24 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。

2 結(jié)果與討論

2.1 實驗條件的優(yōu)化

2.1.1 測定波長的選擇依據(jù)文獻(xiàn)報道[1]可知，UV-320、UV-327和UV-328在紫外-可見波長范圍內(nèi)均有2個吸收峰，其波長分別為303、340 nm(UV-320)，313、345 nm(UV-327)和299、336 nm(UV-328)，且各組分的后一個吸收峰的吸收強度較大，因此，檢測波長選擇340 nm。

2.1.2 色譜條件的選擇本實驗分別以甲醇、乙腈、甲醇+水、甲醇+20%乙腈水溶液、乙腈+0.1%甲酸水溶液、95%甲醇-乙腈溶液+水、甲醇+0.1%甲酸作為流動相，考察各組分的分離情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，以甲醇為流動相時，基線穩(wěn)定，各組分分離良好，且肝臟內(nèi)源性物質(zhì)不干擾組分和內(nèi)標(biāo)的測定。因此，本實驗最終確定以甲醇為流動相，流速1.0 mL/min。

2.1.3 樣品前處理方法的選擇既往文獻(xiàn)報道中，測定生物樣品中UV-327和UV-328含量時，通常采用超聲法[4]、索氏提取法[2]或萃取法[10]提取目標(biāo)物，萃取液經(jīng)凝膠滲透色譜法去除脂質(zhì)，硅膠柱層析法去除非極性雜質(zhì)等，操作步驟繁雜，耗時較長。常用的萃取劑為甲醇、乙腈、正己烷、丙酮、甲苯、氯仿以及二氯甲烷/乙醚或其混合溶液[11]。本實驗對比了甲醇、乙腈、正己烷、丙酮、正己烷-丙酮作為提取劑的實驗結(jié)果，發(fā)現(xiàn)以1.0 mL正己烷-丙酮混合液(體積比1∶1)作為萃取液，UV-327和UV-328的萃取效率較高，萃取效果好，且方法簡便快速。

2.2 特異性

在上述已確定的色譜條件下，考察內(nèi)源性物質(zhì)對目標(biāo)物質(zhì)測定的影響。如圖1所示，UV-327、UV-328與內(nèi)標(biāo)UV-320的色譜峰峰形良好，可完全分離，且肝臟中內(nèi)源性物質(zhì)對UV-327、UV-328與內(nèi)標(biāo)UV-320的測定無干擾。

圖1 小鼠肝中UV-320、UV-327和UV-328的高效液相色譜圖Fig.1 Chromatograms of UV-320,UV-327 and UV-328 in mice livera.blank liver;b.blank liver spiked with UV-320(0.20μg/mL);c.blank liver spiked with UV-320(0.20 μg/mL) and UV-327(2.00 μg/mL);d.blank liver spiked with UV-320(0.20 μg/mL) and UV-328(2.00 μg/mL);e.blank liver spiked with UV-320(0.20 μg/mL),UV-327(2.00 μg/mL) and UV-328(2.00 μg/mL).

2.3 工作曲線的線性范圍、檢出限與定量限

取空白小鼠肝臟勻漿100 μL，分別加入0.40 μg/mL UV-320溶液100 μL，不同濃度UV-327和UV-328混合標(biāo)準(zhǔn)溶液100 μL，按照“1.2.2”所述方法處理樣品。以UV-327或UV-328的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，UV-327或UV-328與UV-320的峰面積比值為縱坐標(biāo)，繪制工作曲線。分別以3倍和10倍噪聲水平對應(yīng)的UV-327或UV-328的濃度確定方法的檢出限和定量限。結(jié)果顯示，在實驗選定的色譜條件下，在0.05～20.0 μg/mL濃度范圍內(nèi)，UV-327或UV-328與內(nèi)標(biāo)UV-320(0.20 μg/mL)的峰面積比值呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，回歸方程分別為：y=4.6242x-0.011，r=0.9999；y=4.2498x-0.3582，r=0.9998。UV-327和UV-328的檢出限均為0.01 μg/mL，定量限均為0.03 μg/mL。

2.4 準(zhǔn)確度與精密度

取空白小鼠肝臟勻漿100 μL，加入0.40 μg/mL UV-320溶液，以及一定濃度的 UV-327和UV-328混合標(biāo)準(zhǔn)溶液各100 μL，制備低、中、高(0.20、2.00、16.0 μg/mL)3種加標(biāo)濃度的質(zhì)控樣品，每種濃度做6個平行樣，連續(xù)測定3 d，考察方法的準(zhǔn)確度和精密度。3種加標(biāo)濃度的質(zhì)控樣品中UV-327和UV-328的平均回收率分別為97.2%、94.9%、98.5%與102.2%、97.0%、99.1%；日內(nèi)精密度分別為5.6%、4.9%、3.7%與5.3%、4.5%、3.8%；日間精密度分別為8.2%、7.8%、2.8%與9.5%、6.7%、2.8%?？瞻仔∈蟾闻K中未檢出UV-327、UV-328和UV-320。結(jié)果表明，本方法的準(zhǔn)確度和精密度良好。

2.5 提取回收率與基質(zhì)效應(yīng)

如“2.4”所述，制備低、中、高3種加標(biāo)濃度(0.20、2.00、16.0 μg/mL)的質(zhì)控樣品，按照“1.2.2”所述方法處理，每種濃度做6個平行樣，測得的UV-327或UV-328與UV-320的峰面積比記為A。另取空白小鼠肝臟勻漿100 μL，加入1.0 mL正己烷-丙酮(體積比1∶1)，渦旋混勻3 min，13 560×g離心5 min，氮氣吹干后，加入0.40 μg/mL UV-320溶液和一定濃度的 UV-327和UV-328混合標(biāo)準(zhǔn)溶液各100 μL，使加標(biāo)樣品中UV-327和UV-328最終質(zhì)量濃度分別為0.20、2.00、16.0 μg/mL，每種濃度做6個平行樣，測得的UV-327或UV-328與UV-320的峰面積比記為B。計算提取回收率(E%)=A/B×100。用甲醇分別配制質(zhì)量濃度為0.20、2.00、16.0 μg/mL的UV-327和UV-328混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,每種質(zhì)量濃度做6個平行樣，測定其與UV-320(0.20 μg/mL)的峰面積比記為C，計算基質(zhì)效應(yīng)(ME%)=B/C×100。3種加標(biāo)濃度的質(zhì)控樣品中UV-327和UV-328的提取回收率分別為97.6%、98.9%、94.2%與97.8%、95.3%、94.3%；基質(zhì)效應(yīng)分別為110.8%、99.2%、92.5%與112.3%、100.7%、92.3%。結(jié)果表明，本方法的提取回收率高，樣品的基質(zhì)效應(yīng)對測量結(jié)果的影響較小。

2.6 穩(wěn)定性

如“2.4”所述，制備低、中、高3種加標(biāo)濃度(0.20、2.00、16.0 μg/mL)的質(zhì)控樣品，每種濃度取6個平行樣，考察室溫下放置6 h及-40 ℃下保存15 d條件下，樣品中UV-327和UV-328的穩(wěn)定性。3種加標(biāo)濃度的質(zhì)控樣品室溫下放置6 h，UV-327和UV-328測定值的相對偏差分別為5.0%、1.5%、1.0%與5.0%、1.5%、0.1%；-40 ℃放置15 d，UV-327和UV-328測定值的相對偏差分別為10%、4.0%、1.3%與10%、1.5%、0.9%。結(jié)果表明，小鼠肝臟樣品室溫下至少可以放置6 h，-40 ℃冰箱中可以保存15 d。

2.7 實際樣品測定

對小鼠單次灌胃分別給予UV-327或UV-328，采用上述建立的高效液相色譜法測定其肝臟中UV-327或UV-328的含量。圖2a和圖2b分別為灌胃4 h小鼠肝臟中UV-327、UV-328測定的色譜圖。如圖所示，UV-327或UV-328與內(nèi)標(biāo)UV-320可完全分離，峰形良好。灌胃4 h，小鼠肝臟中UV-327、UV-328的平均濃度(n=5)分別為10.4 μg/mL和8.43 μg/mL。

圖2 實際樣品測定的色譜圖Fig.2 Chromatograms of real samplesa.chromatogram of UV-327 after 4 h gavage in mice liver;b.chromatogram of UV-328 after 4 h gavage in mice liver.

3 結(jié)論

本文以小鼠肝臟為樣品，建立了小鼠肝中UV-327和UV-328的高效液相色譜測定方法，方法的準(zhǔn)確度、精密度和靈敏度均可滿足實際樣品中UV-327和UV-328含量的測定要求，且樣品預(yù)處理方法簡便快速，使用的有機試劑毒性相對較低、量少，對環(huán)境的污染小，方法具有一定的實際應(yīng)用價值。