李文靜， 許惠鳳， 詹 妍， 胡燕霞， 朱 希*， 楊桂娣

(1.福建農(nóng)林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，福建福州 350002；2.福建省中西醫(yī)結(jié)合老年性疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合研究院，福建福州 350002)

血紅素(Hemin)是一種由卟啉和Fe(Ⅱ)結(jié)合形成的鐵卟啉類化合物，存在于高等動物的血液和肌肉中，在氧氣轉(zhuǎn)運(yùn)過程中起到關(guān)鍵作用[1]。在藥學(xué)領(lǐng)域，血紅素除了能夠作為制備抗癌和半合成膽紅素藥物的原料，還在抗瘧疾中起著重要作用[2]。然而，過量的血紅素能嵌入脂膜，催化生成 ·OH，破壞細(xì)胞膜，從而造成細(xì)胞溶解和死亡[3,4]。因此，血紅素的定量檢測對于醫(yī)藥衛(wèi)生、食品工業(yè)、環(huán)境科學(xué)、生物科學(xué)等領(lǐng)域具有非常重要的意義。

血紅素的常用檢測方法有電泳法[5]、高效液相色譜法[6]和火焰原子吸收法[7]等方法。這些方法需要昂貴的儀器，專業(yè)培訓(xùn)的實(shí)驗(yàn)人員，以及復(fù)雜的日常維護(hù)過程，很大程度上限制了在血紅素檢測中的應(yīng)用。血紅素在波長400 nm附近具有較強(qiáng)的吸收峰，可采用簡便且低成本的分光光度法對其進(jìn)行直接檢測[8]，然而該方法因抗干擾能力相對較差，且靈敏度較低，在復(fù)雜樣品的檢測應(yīng)用受到一定限制。熒光分析法具有操作簡單、靈敏度高和選擇性好等特點(diǎn)，這些優(yōu)點(diǎn)極大拓展了它在分析領(lǐng)域的應(yīng)用。Guan等人[9]利用肝素和巰基丙酸修飾的硫化鎘量子點(diǎn)作為熒光探針，實(shí)現(xiàn)對血紅素的免標(biāo)記熒光檢測。Kang等人[10]提出了一種基于原卟啉Ⅸ與G -四聯(lián)體體系的熒光方法對血紅素進(jìn)行檢測。但這些方法或用到了具有一定毒性的硫化鎘量子點(diǎn)，或需要繁雜的實(shí)驗(yàn)過程。因此，設(shè)計(jì)一種安全無毒，簡便、穩(wěn)定、靈敏度高、可靠的新方法用于檢測血紅素勢在必行。

硅量子點(diǎn)(SiQDs)是一種零維納米材料。與Ⅱ-Ⅵ族、Ⅲ-Ⅴ族的半導(dǎo)體量子點(diǎn)相比，SiQDs不僅有著優(yōu)異的光學(xué)性能，還具備環(huán)境友好、低合成成本、無細(xì)胞毒性和高生物相容性等優(yōu)點(diǎn)[11,12]。為了得到水溶性較好的SiQDs，研究者通常需要采用兩步法進(jìn)行制備：首先，通過“top-down”的過程得到疏水性SiQDs，然后再通過表面功能化的過程得到水溶性SiQDs。盡管這種方法能得到水溶性較好的SiQDs，但它需要繁瑣的操作過程。近年來，研究人員以3-氨基丙基-三甲氧基硅烷(APTMS)等作為硅源[13]，在還原劑存在下，采用水熱合成方法合成了具有高親水性的水溶性SiQDs。這些水溶性SiQDs在金屬離子和生物小分子檢測領(lǐng)域有著巨大應(yīng)用前景[14-18]。本研究以APTMS為硅源，檸檬酸三鈉為還原劑，采用水熱法合成了水溶性良好和高熒光活性的水溶性SiQDs。利用血紅素與SiQDs間的內(nèi)濾作用，構(gòu)建一種簡便快速的熒光方法實(shí)現(xiàn)對血紅素的檢測。本方法與現(xiàn)有的檢測手段相比具有簡便快速、選擇性好、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Cary Eclipse熒光分光光度計(jì)(美國，瓦里安公司)；UV1750紫外-可見分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)；FEI Tecnai G2 F20透射電子顯微鏡(美國，F(xiàn)EI公司)；F4500穩(wěn)定/瞬間熒光光譜儀(英國，愛丁堡公司)；KQ300DE數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；pHS-3C pH計(jì)(上海越平科學(xué)儀器有限公司)。實(shí)驗(yàn)所需光學(xué)測量均在室內(nèi)環(huán)境溫度條件下操作。實(shí)驗(yàn)所需熒光測量均在統(tǒng)一的石英比色皿中操作。

3-氨丙基-三甲氧基硅烷(APTMS)購自Sigma公司；檸檬酸三鈉、氯化血紅素、甲硫氨酸、半胱氨酸、組氨酸、酪氨酸、葡萄糖、NaOH、Na2HPO4、NaH2PO4，均購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。實(shí)驗(yàn)所需用水均為Millipore Milli-Q系統(tǒng)凈化的超純水。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 水溶性SiQDs的合成參照文獻(xiàn)方法[12]并進(jìn)行適當(dāng)修改，具體步驟如下：準(zhǔn)確稱取1.1038 g檸檬酸三鈉，吸取5 mL APTMS，將上述兩種試劑加入10 mL 水中攪拌混勻，并將所得溶液轉(zhuǎn)移至聚四氟乙烯反應(yīng)釜中，于160 ℃下反應(yīng)2 h。再將反應(yīng)得到的均勻透明的溶液轉(zhuǎn)移至透析袋(1 kDa)中透析48 h，除去雜質(zhì)。最后把溶液收集存儲于4 ℃冰箱中作為儲備溶液。另取1 mL溶液凍干后稱重，計(jì)算出SiQDs母液的濃度為3 mg/mL。使用硫酸奎寧(QY=54%)作為參比標(biāo)準(zhǔn)品，在0.5 mol/L的H2SO4中測得該SiQDs 的量子產(chǎn)率為28.7%。

1.2.2 光譜測試實(shí)驗(yàn)過程中，紫外吸收曲線通過紫外-可見分光光度計(jì)檢測。熒光光譜圖通過熒光光度計(jì)掃描得到，熒光的激發(fā)波長為350 nm，發(fā)射波長范圍為380～600 nm。

1.2.3 血紅素對SiQDs的熒光響應(yīng)取4 μL上述SiQDs母液，加入290 μL 0.1 mol/L的磷酸鹽緩沖溶液(PBS,pH=7.0)，得到最終濃度為0.04 mg/mL的SiQDs溶液。移取6 μL不同濃度的血紅素溶液，分別加入到上述SiQDs溶液中，靜置5 min后進(jìn)行熒光測定。

1.2.4 干擾實(shí)驗(yàn)6 μL 1 mmol/L的血紅素和6 μL 10 mmol/L的干擾物質(zhì)(組氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸、葡萄糖)，分別加入到“1.2.3”所制備的SiQDs溶液中，靜置5 min后進(jìn)行熒光測定。

2 結(jié)果與討論

2.1 SiQDs的合成及表征

實(shí)驗(yàn)首先對所合成的SiQDs進(jìn)行透射電鏡(TEM)及熒光光譜表征。從圖1(A)中看出，SiQDs表現(xiàn)為規(guī)整的類球形，且分布均勻，平均粒徑2.0 nm。從熒光光譜圖(圖1(B))可以看出，合成的水溶性SiQDs的最大激發(fā)波長和最大發(fā)射波長分別在350 nm和441 nm附近。制備的SiQDs在日光下是無色透明的均相溶液，在365 nm的紫外燈下則呈現(xiàn)明亮的藍(lán)色熒光(圖1(B)插圖)。這些結(jié)果與之前文獻(xiàn)報(bào)道[12]一致，表明本實(shí)驗(yàn)成功制備出了水溶性熒光SiQDs。

圖1 (A) SiQDs的透射電鏡(TEM)圖；(B) SiQDs熒光光譜圖(紅色曲線為激發(fā)光譜，黑色曲線為發(fā)射光譜，插圖為SiQDs在日光下(a)和紫外燈下(b)照片)Fig.1 (A) TEM image of SiQDs;(B) Fluorescence spectra of SiQDs(excitation(red) and emission(black) spectrum of SiQDs,inset:the photograph of SiQDs under daylight(a) and UV lamp(b))

圖2 SiQDs加入血紅素前(a)后(b)的熒光光譜Fig.2 Fluorescence spectra of SiQDs in the absence (a) and presence (b) of hemin

2.2 血紅素對SiQDs的熒光信號影響

圖2是加入血紅素前后SiQDs的熒光光譜圖。從圖可以看出，加入血紅素后SiQDs的熒光信號明顯下降，以空白SiQDs的熒光值作為F0，加入血紅素的熒光值作為F，計(jì)算血紅素對SiQDs的熒光猝滅率為81.7%。另外，加入血紅素前后SiQDs的熒光峰的峰形沒有變化，最大激發(fā)波長出現(xiàn)了稍微的紅移，這可能是由于血紅素加入后引起SiQDs晶型結(jié)構(gòu)發(fā)生變化引起的。

本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步考察了血紅素猝滅SiQDs熒光的可能機(jī)理。首先，通過熒光壽命實(shí)驗(yàn)(圖3(A))發(fā)現(xiàn)，加入血紅素后的SiQDs的熒光壽命與未加入血紅素時(shí)SiQDs的熒光壽命相比，基本沒有變化。另外，通過紫外-可見吸收光譜(圖3(B))，可以看出血紅素的強(qiáng)吸收范圍在波長300～450 nm(曲線a)，這與SiQDs的紫外吸收范圍(曲線b)重疊，同時(shí)也覆蓋了SiQDs的最大發(fā)射波長。這些結(jié)論表明，血紅素對SiQDs的熒光抑制主要由于內(nèi)濾作用所引起。

圖3 (A) 加入血紅素前后SiQDs的熒光壽命對比圖;(B) 血紅素(a)和SiQDs(b)的紫外-可見吸收光譜圖Fig.3 (A) Fluorescence lifetime of SiQDs;(B) UV-Vis absorption spectra of hemin(a) and SiQDs(b)

2.3 實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化

2.3.1 緩沖溶液pH本實(shí)驗(yàn)分別選定pH為4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.4、8.0和9.0來考察SiQDs的熒光信號變化情況。在圖4中，SiQDs的熒光信號隨著pH的增大先上升而后下降，在pH為7.4的時(shí)候達(dá)到最大值，并且pH為7.4是人體生理pH值，故選定pH=7.4作為該實(shí)驗(yàn)體系的pH值。

2.3.2 血紅素與SiQDs反應(yīng)時(shí)間實(shí)驗(yàn)考察了不同反應(yīng)時(shí)間下熒光強(qiáng)度的變化情況，結(jié)果如圖5所示。從圖中可以看出，在5 min內(nèi)反應(yīng)體系的熒光強(qiáng)度逐漸降低。當(dāng)反應(yīng)時(shí)間超過5 min，熒光強(qiáng)度幾乎不再降低，因此該體系最佳反應(yīng)時(shí)間應(yīng)為5 min。

圖4 不同pH的PBS中SiQDs的熒光光譜Fig.4 Fluorescence spectra of SiQDs in PBS with different pH

圖5 不同時(shí)間下血紅素對SiQDs的熒光猝滅情況Fig.5 Fluorescence quenching of SiQDs by hemin at different reaction times

2.4 線性范圍及檢出限

在上述最佳實(shí)驗(yàn)條件下，考察了不同濃度血紅素對體系熒光強(qiáng)度的影響。如圖6(A)所示，體系的熒光強(qiáng)度隨血紅素濃度的升高逐漸降低，血紅素的濃度在2.67～200 μmol/L之間時(shí)，熒光強(qiáng)度變化值ΔF(ΔF=F0-F)與血紅素濃度的對數(shù)呈良好線性關(guān)系(圖6(B))，線性方程為:ΔF=120.12logc-38.39，相關(guān)系數(shù)R為0.997，該方法的檢出限(S/N=3)達(dá)到0.83 μmol/L。

圖6 (A)不同血紅素濃度下的熒光光譜圖；(B)血紅素濃度對數(shù)與熒光強(qiáng)度變化值ΔF間關(guān)系Fig.6 (A) Fluorescence spectra of SiQDs at different hemin concentrations(a-k:The concentrations of hemin are 0.00,2.67,3.33,6.66,13.33,20.00,26.66,33.33,66.66,133.33,200.00 μmol/L,respectively);(B) Linear plot of fluorescence intensity change ΔFvs.logarithm of hemin concentrations

圖7 不同物質(zhì)和SiQDs共存時(shí)熒光強(qiáng)度變化圖Fig.7 Fluorescence intensity change of SiQDs in the presence of different substances a-g stand for SiQDs，SiQDs+histidine，SiQDs+tyrosine，SiQDs+cysteine，SiQDs+methionine，SiQDs+glucose,and SiQDs+hemin.

2.5 干擾實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)以幾種可能共存的氨基酸和小分子為干擾物質(zhì)，考察了它們對體系熒光強(qiáng)度的影響。這些干擾物質(zhì)的濃度是200 μmol/L，而血紅素濃度為20 μmol/L。從圖7可以看出，只有血紅素存在時(shí)，才能引起熒光顯著變化，而這些干擾物的存在則不會引起SiQDs熒光信號顯著改變，表明這種方法對血紅素的檢測具有良好的選擇性。

2.6 實(shí)際血清樣品中血紅素的檢測

為了進(jìn)一步評估該方法的實(shí)用性，實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步將稀釋的人血清樣品用作血紅素檢測的樣品基質(zhì)，在樣品中未檢測到血紅素。在樣品中加入了不同濃度的血紅素進(jìn)行加入回收率實(shí)驗(yàn)。表1中的結(jié)果表明，檢測出的血紅素含量與添加值基本一致，回收率在97.8%～103.2%范圍內(nèi)。表明本研究所提出的方法有望用于實(shí)際樣品中血紅素的檢測。

表1 血清樣本中血紅素的檢測(n=3)

3 結(jié)論

本文通過水熱法制備了具有較高熒光強(qiáng)度且環(huán)境友好的水溶性SiQDs?；谠撍苄許iQDs與氯化血紅素間存在著內(nèi)濾作用，建立了快速檢測氯化血紅素的熒光新方法。該方法操作簡便，所用試劑安全無毒，檢測結(jié)果具有高的靈敏度和良好的選擇性，在氯化血紅素的快速檢測方面具有應(yīng)用潛力。